基因工程制药.ppt

基因工程制药,第一节概述第二节基因工程基本技术与策略第三节基因药物生产的基本过程第四节基因工程药物制造实例,第一节概述,一、基因工程建立的基础二、基因工程的相关概念及相关酶学三、基因工程技术所生产的药物四、基因工程制药的优点五、基因工程制药所使用的生物技术六、我国基因工程制药的进展七、基因工程制药生产的化学工艺学要求八、基因工程的发展,一、基因工程建立的基础,（一）、理论方面的三个重要的发现,1.生物遗传物质DNA的发现,2.DNA双螺旋结构和半保留复制机理的建立,1953年，沃森(Watson）和克里克（Crick）首次提出了DNA双螺旋结构和半保留复制机理。这一重大发现大大地促进了现代生物科学的发展。,3.遗传信息传递方式的确立,1966年，发现DNA连接酶。1970年Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化限制性内切酶Hind，使DNA分子的切割成为可能。1979年，Bltimore和Temin领导的两个研究小组分别在各自的工作中发现了逆转录酶。,（二）、技术上三个重要成果,1.基因工程的工具酶,1972年，美国斯坦福大学Berg研究小组利用限制性内切酶EcoRI和T4DNA连接酶成功地进行了首例体外基因重组实验。,2.基因工程载体,为了使DNA片段能在宿主细胞中得以扩增，须将其接到一个特定能够进行自我复制的载体分子上。Lederberg开始从事细菌性因子（F因子）研究。20世纪50-60年代，相继发现其他质粒，如抗药性基因（R因子）和大肠杆菌因子（CoE）。这些工作为基因工程载体系统的建立打下基础。,3.基因的体外重组技术,1973年，科恩（Cohen）等人用EcoRI内切酶处理大肠杆菌的抗四环素和抗青霉素及磺胺的质粒，并连接成一个新的重组质粒。将这种工程化的质粒转入大肠杆菌，在含有四环素和青霉素的平板中筛选重组菌落。同年，加利福尼亚的博耶（Boyer）也进行了类似的实验。重组子转化的成功标志着基因工程的诞生。,基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，按照人类的需要进行设计，然后按设计方案创建出具有某种新的性状的生物新品系，并能使之稳定地遗传给后代。,（三）、基因工程的研究内容,二、基因工程相关概念及基本工具,1.克隆与克隆化克隆指同一副本或拷贝集合。从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，经扩增产生很多相同分子集合，即为分子克隆。2.DNA克隆在体外外来遗传物质与载体DNA结合成具自我复制的DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出转化子细胞，再扩增提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆又称重组DNA。,（一）、基因工程的相关概念,3.目的基因有时应用重组DNA技术的分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，有时是为获得感兴趣基因的表达产物-蛋白质。4.基因载体也称克隆载体。这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。,克隆和进行基因操作需要对遗传物质进行剪切、修饰和连接，这些过程都是在工具酶的催化下完成的。按功能将工具酶分类，可分为剪切酶类、连接酶类和修饰酶类如下所示,分子剪刀和分子针线,（二）、基因工程的工具酶,1.限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE),(1)定义是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链DNA中的特定碱基序列的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。,+,BamH,与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统：限制外源DNA，保护自身DNA，稳定细菌遗传性状。,(2)分类、作用、（基因工程技术中常用型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名第一个字母，用大写；第二、第三个字母是该细菌种名的前两个字母，用小写；第四个字母代表菌株类型；如果菌株有几种酶，在代表菌株的字母后用罗马数字表示。,(3)命名,EcoR,EscherichiacoliRY13株大肠杆菌RY13株的第一种酶,(4)类酶识别序列特点回文结构(palindrome),特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种末端结构：5粘性末端3粘性末端平端或钝端回文序列(palindrome)是指该部位的核苷酸序列呈180O反向重复;粘性末端(stickyend)是指经内切酶特异切割后产生的5末端突出和3末端突出的碱基序列相互间具有互补性。,BamH,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。,BamH,Bgl,+,+,2.DNA聚合酶（全酶）,E.ColiDNA聚合酶（DNApol）是一个具有3种酶活性的多功能性酶。包括：53DNA聚合酶活性53核酸外切酶活性35核酸外切酶活性,DNApol应用,常用来催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA探针；cDNA第二条链的合成；对DNA3突出末端进行标记；DNA序列分析。,E.coliDNApol.催化缺口平移,3.TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase),作用特点1）TaqDNApol催化DNA合成的最适温度范围7075，2）95以上高温，半小时不失活，3）最适合用于聚合酶链反应（PCR）。,4.逆转录酶,特点逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性：以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA以DNA为模板，催化合成cDNA双链。,逆转录酶的应用：将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；补平和标记5-末端突出的DNA片段；代替Klenow酶用于DNA序列分析；制备杂交探针等。,5.DNA聚合酶大片段Klenow片段,Klenow片段用途,补齐双链DNA的3末端；用标记碱基补齐3末端；,用于cDNA克隆中第二股链的合成；DNA序列分析。,6.DNA连接酶(DNAligase),催化双链DNA中一条链的3-OH与另一条链的5-PO3H2形成磷酸二酯键，从而构成完整的DNA长链。DNA连接酶的用途（1）两个双链DNA片段连接起来5-ACGAATTCGT-3T4DNA连接酶5-ACGAATTCGT-33-TGCTTAAGCA-53-TGCTTAAGCA-5（2）修补带有缺口的双链DNA分子,7.碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）,能够催化水解去除DNA或RNA5-端的磷酸基团。用途制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子5端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。用32P标记5-端前，去除5-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5-端进行标记。,8.末端（脱氧核苷酸）转移酶(TdT),作用将标记或未标记的dNTP加到DNA的3-OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片段上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。应用探针标记,P32-.dGTP,G32G32G32G32,G32G32G32G32,在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接,3,3,重要的工具酶,基因工程的载体是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,（三）、基因工程的载体,常用载体(vector)来源分类：质粒载体噬菌体载体病毒载体人工染色体载体,用途分类：克隆载体表达载体穿梭载体,克隆载体(cloningvector)能使插入的外源DNA序列被复制、扩增而不能表达，这样的载体为克隆载体。表达载体(expressionvector)使插入的外源DNA序列转录翻译，表达出多肽链，这样的载体称为表达载体。,这类载体中含有来源不同的复制子结构，既具备原核细胞复制所需的序列结构，又具有能使外源片段在真核细胞表达所需的结构元件和相应的选择标记基因,故能在两种受体细胞中复制并检测，克隆的外源基因在此类载体直接从一种受体转入另一种受体中进行复制和表达,穿梭载体（shuttlevector),具有能使外源DNA片段组入的克隆位点。能携带外源DNA进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制。必须具有选择标记，承载外源DNA的载体进入受体细胞后，以便筛选克隆子。分子量小，拷贝数高。具有较高的遗传稳定性。,基因克隆载体必须具备三个条件,松弛型的复制子、多克隆位点、筛选标记.常见:质粒、噬菌体,克隆载体必需结构:,具有复制子，筛选标记，位于多克隆位点的上下游具有转录效率较高的启动子，起始密码子和核糖体结合位点，转录终止子结构,表达载体结构特点：,三、基因工程技术所生产的药物,传统方法很难生产的，主要是药用活性蛋白质和多肽类，包括：（1）免疫蛋白质-各种抗原、单克隆抗体、乙肝疫苗。（2）细胞因子-各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子、促红细胞生成素。,（3）激素-胰岛素、生长激素、心钠素、人脑激素。（4）酶类-尿激酶、链激酶、葡聚糖酶、组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂、超氧化物歧化酶、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制剂。,四、基因工程制药的优点,（1）利用基因工程技术可以生产出过去难以获得的生理活性蛋白和多肽。（2）可以通过大批量的生产方法获得足够数量的生物活性物质。（3）利用基因工程技术可以发掘出更多的内源性生理活性物质。（4）利用基因工程技术和蛋白质工程技术可以对药物蛋白进行修饰和改造，来提高药效价值和获得新型的化合物。,五、基因工程制药所使用的生物技术,（1）DNA重组技术（2）淋巴细胞杂交瘤技术（3）细胞培养技术（4）克隆表达技术,六、我国基因工程制药的进展,-1b型基因工程干扰素，是我国自行研究开发的具有国际先进水平的基因工程药物，于1997年通过III期临床，并获得国家一类新药证书。它源于中国人基因，最适于黄种人使用。目前，我国已经批准了12种基因工程药物和疫苗上市。,七、基因工程制药生产的化学工艺学要求,（1）工程菌大规模发酵工艺最佳参数的确立（2）新型生物反应器的研制（3）高效分离介质和装置的开发（4）分离纯化技术的优化控制（5）高纯度产品的制备技术（6）生物传感器等仪器仪表的设计和制造（7）电子计算机的智能优化控制,八、基因工程的发展,（一）基因工程的历史（二）基因工程所生产的产品（三）基因工程的发展方向,（一）基因工程的历史,1973年-Cohen第一例成功的克隆实验。1978年-Genentech公司生产出世界上第一种基因工程蛋白药物-人胰岛素。1982年-第一个基因工程药物重组人胰岛素在英、美获准使用。八十年代中期-PCR技术发明1985年-第一批转基因家畜（兔、猪和羊）培育成功。1999年9月-中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组全部序列的1%2000年6月26日-科学家公布人类基因组工作草图。2003年4月14日-公布人类基因组基本信息。,产品名称治疗功能与医药范围1.人胰岛素治疗糖尿病2.人生长激素治疗侏儒症，加速创口愈合3.干扰素治疗癌症、病毒感染4.干扰素治疗带状疱疹，眼结、角膜炎5.干扰素治疗癌症、病毒感染6.人组织纤溶酶原激活因子(tPA)溶解血栓，治疗急性心肌梗塞7.红细胞生成素(Epo)治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平8.超氧化物歧化酶清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死9.凝血因子治疗A型血友病10.乙型肝炎疫苗防治肝炎11.神经生长因子维持神经元细胞存活、生长和分化12.脑啡肤镇痛13.降钙素治疗骨质疏松症,（二）基因工程所生产的产品,基因工程生产胰岛素的原理（示意图）,（三）基因工程的发展方向,第一代基因工程-蛋白多肽的高效表达-经典基因工程第二代基因工程-蛋白编码基因的定向诱变-改造基因第三代基因工程-代谢信息途径的修饰重构-改造个体第四代基因工程-基因组或染色体的转移-基因组工程,第二节、基因工程基本技术与策略,一、切二、接三、转四、增五、检,一、切,（一）定义-限制性内切酶切及与载体连接（二）关键问题-限制性内切酶的选择及连接末端的设计。（三）具体方法：1、同种限制性内切酶产生的粘性末端连接2、同尾酶产生的粘性末端连接3、不同限制性内切酶粘性末端的连接4、人工粘性末端的连接-5突出末端5、人工粘性末端的连接-3突出末端6、粘性末端的添加与更换，利用人工接头Linker,几种主要的连接策略,1、同种限制性内切酶产生的粘性末端连接,2、同尾酶产生的粘性末端连接,3、不同限制性内切酶粘性末端的连接,4、人工粘性末端的连接-5突出末端,5、人工粘性末端的连接-3突出末端,6、粘性末端的添加与更换，利用人工接头Linker,二、接（体外重组）,（一）重组率-含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数（二）重组特性：粘性末端的重组率大大高于平末端。双酶切片段与载体的重组率高于单酶切片段与载体。（三）提高重组率的方法1、加大外源基因片段与载体的比例2、选择基因序列固有的酶切位点3、在利用PCR扩增基因的同时引入酶切位点4、利用中间载体提供酶切位点,1、加大外源基因片段与载体的比例,（1）外源基因片段与载体的比例为5:1-10:1（2）5末端去磷酸化,2、选择基因序列两侧固有酶切位点,选用酶切位点,不能在基因序列内部双酶切产生粘端连接单酶切粘端连接平端连接,3、在利用PCR扩增基因的同时引入酶切位点,利用PCR扩增基因时，在引物序列中加入特定的限制性酶切位点序列，在扩增基因的两侧就带有了该特定酶切位点。,4、利用中间载体提供酶切位点,例：Taq酶特点，常会在3末端添加一个脱氧腺苷酸（A），因此，为克隆PCR产物，设计一个特殊的载体-T载体，其特点是3末端含有一个脱氧胸腺苷酸（T）。PCR产物可以不经过酶切直接与T载体连接，T/A克隆随后就可以利用质粒上插入基因两侧的酶切位点来克隆基因。,三、转（外源基因导入细胞）,（一）转化方法1、大肠杆菌的质粒转化2、酵母的质粒转化方法（二）转化率（三）转化率的用途（四）转化率的影响因素,1、大肠杆菌的质粒转化,（1）钙离子转化法（2）电转化法（3）大肠杆菌的噬菌体转染,（1）钙离子转化法,适用于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌），利用钙离子与细菌细胞膜磷脂在低温下形成液晶结构，这一状态下的细胞称为感受态细胞。此时细胞经过热脉冲发生收缩作用，细胞膜出现间隙，此时质粒DNA可通过进入细胞。,（2）电穿孔法,将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。,（3）大肠杆菌的噬菌体转染,2、酵母的质粒转化方法,（1）乙酸锂转化法（2）原生质体转化法（3）电转化法,（二）转化率,转化率-单位质量的质粒转化大肠杆菌产生转化子的数量。钙离子转化法：106-109/ug超螺旋质粒电转化法：108-1010/ug超螺旋质粒例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.41011个分子（6.021017/2686660），即每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有21010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18DNA。,（三）转化率的用途,（四）转化率的影响因素,1、载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。2、载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率要比新制备的质粒低两个数量级。3、插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低,4、受体细胞的性质：不同菌株转化效率有较大差异5、受体细胞与载体的匹配：受体细胞必须与载体相匹配，如：pBR322转化大肠杆菌JM83株转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高。6、实验参数条件方面：实验操作对转化率影响较大，特别是电转化，转化电压，电容，电阻等参数的设置非常重要。,四、增（重组基因的扩增）,增殖转化细胞扩增与表达载体上的标记基因及目标基因表达外源基因,五、检（检测转化子，获得重组子）,1、抗药性检测筛选法2、显色检测3、限制酶切图谱检测4、PCR扩增检测5、原位杂交检测6、外源蛋白质功能检测,外源性DNA插入到载体DNA的某一抗药性基因区域时，会导致抗药基因的失活。转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。,1、抗药性检测筛选法,对于将外源DNA插入BamH和Sal之间位点,2.显色检测-半乳糖