（自然地理学专业论文）盐胁迫下抗坏血酸生理功能研究.pdf

缩写词 英文缩焉 a 取a a s c a p x c a p x e 式 c e 娃z n s o d d h a d h a r d w f e s o d 焉 f o f _ 最 凡 f 。 f 0 f 。 f 0 p m m p s i ! g & g s h 缩写词 英文全称 a b s c 耗i ca c i d a s c o r b a t e a s c o r b a t ep e m x i d a s e c y t o s o l i ea s c o r b a t ep e m x i d a s e e a t a l a s e i n t e r c e l l u l a rc 饥c o n c e n t r a t i o n c o p p e r - z i n cs u p e r o x i d ed i s m u t a s e d e h y d r o a s c o r b a m d e h y d r o a s c o r b a t er e d u e t a s e d r yw e i g h t i r o n - s u p e m x i d ed i s m u t a s e m i n i m a lf l k o 躺c e n c el e v e li no & k - a d a p t e ds t a t e m i n i m a lf l u o r e s c e n c el e v e li nl i g h t - a d a p t e ds t a t e m a x i m a lf l u o r e s c e n c el e v e li nd a r k - a d a p t e ds t a t e m a x i m a lf l u o r e s c e n c el e v e li nl i g h t - a d a p t e ds t a t e s t e a d y - s t a t ef l t t o r e s c e n e el e v e la tq p o v a r i a b l ef l u o r e s c e n c el e v e li nd a r k - a d a p t e ds t a t e v a r i a b l ef l u o r e s c e n c el e v e li nl i g h t - a d a p t e ds t a t e m a x i m a le f f i c i e n c yo f p si i 曲o t o - c h e m i s t r y e f f i c i e n c yo f e x c i t a t i o ne n e r g yc a p t u r eb yo p e np s l lr e a c t i o nc e n t r e s q u a n t u m y i e l d o f p s i ie l e c t r o n t r a n s p o r t 垂u t a t h i o n er e d u c t a s e s t o m a t a lc o n d u c t a n c e r e d u c e dg l u t a t h i o n e 中文全称 艇落酸 抗坏血酸 靛蒜蠢馥避襞纯镌游 胞质抗坏瓶酸过氧化物酶 避氧纯氢瓣 胞间c 0 2 浓度 锯锌超氧豫物歧纯酶 双脱氢抗坏血酸 敷脱氢抗坏血酸还聪酶 予重 铁超氧化物歧化酶 骧逶痘捩态的最小荧光永乎 光适应状惑的最小荧光水平 麓逶痤状悫的最大荧光承平 光适应状态的最大荧光水平 q p o 时的稳态荧光水平 暗适应状态的可变荧光水平 光适应状淼的可变袋光水平 p s i i 最丈姥纯学效攀 开放p s i i 反应中心的激发能 撼获兹率 p sl i 电予传递的量子产量 豁魏甘菔述原酶 气孔导度 备胱甘肽 中科院寒早所博士论文盐胁迫下抗坏血酸生理功能研究 g s s g h 2 0 2 m d a m d a r m n s o d n a c l n a d h n a d 辩 g l u t a t h i o n ed i s u t f i d e 坶d r o g e np e r o x i d e m o n o d e h y d r o a s c o r b a t e m o n o d e h y d r o a s c o r b a l er o d a c t a s e m a n g a n e s e - s u p c r o x i d ed i s m u t a s e s o d i u me h l o h r e d u c e dn i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i e d r e d u c e dn i c o t i n a m i 赴a d e n i n ed i n u c l e o t i e d p h o s p h a t e n o n p h o t o e h e m i c a lq u e n c h i n gc o e f f i c i e n t s u p e r o x i d e l - p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e a p p a r e n tp h o t o s y n t h e t i cr a t e p e r o x i d a s e p h o t o s y s t e ml | p r i m a r yq u i n o n ee l e c t r o na c e e p t o ro f p si i n o n p h o t o c h e m i c a lq u e n c h i n gc o e f f i c i e n t p h o t o c h e m i c a lq u e n c h i n gc o e f f i c i e n t r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s l t l a t i v e w a t e r c o n t e n t s u p e r o x i d ed i s m u t z s e v i o l a x a n t h i nd e - e p o x i d a s e 2 氧能型谷魏辞敢 过载化氢 单脱氢抗坏m 酸 单越氢撬坏斑酸还鳆瓣 锰越氧化物歧化酶 氯纯镳 还原型烟酰胺腺嘌岭二核苷酸 还麟型溜蘸麟艨礤垮二浚蔷酸 磷酸 非沌纯学淬灭系数 超畿暇离子 l - 笨丙氨酸氮解酶 表溅毙台速攀 过鬣化物酶 毙繁统珏 p s 儿原初质体醌电予受体 非搬纯学漳灭系数 光化学淬灭系数 活饿氧 掘对窘本量 超氧化物歧化酶 紫黄蒺去拜托薅 嫩何眦 陬 啪 刚 树妒 耋 粼 啪 | | | 中文摘要 中文摘要 盐胁迫下抗坏血酸生理功能研究 抗坏血酸是植物体中丰度极高的小分子代谢物，它在植物生长发育中具有 多种功能。本研究以拟南芥抗坏血酸缺失突变体w c j ( 其抗坏血酸含量仅是野 生型的3 0 ) 为实验材料，研究短期盐胁迫下抗坏血酸的生理作用。 与野生型w t 相比，拟南芥v t c j 突变体c 0 2 同化能力明显降低。拟南芥 v ，c ，突变体中光系统i l 功能对盐胁迫也显示出更高的敏感性。以过氧化氢为指 标，v t c ，突变体中的氧化胁迫与野生型w t 相比在盐胁迫下急剧上升。测量在 盐胁迫下抗坏血酸含量的变化发现v t c j 突变体在4 8 小时盐胁迫期间抗坏血酸 库很快减小并几乎完全处于氧化状态。抗坏血酸喂饲实验可使v t c 突变体中盐 胁迫下降低的光系统i i 功能恢复。由此推测可能是低内源抗坏血酸和( 或) 低 抗坏血酸再生引起还原型抗坏血酸的急剧下降，导致v t c 突变体中r o s 含量 的上升和非光化学淬灭( n p q ) 的下降。 本论文也研究了在盐胁迫下抗坏血酸谷胱甘肽循环中的抗坏血酸再生系 统。一方面盐胁迫下v i e j 突变体中两个抗坏血酸还原酶一单脱氢抗坏血酸还原 酶( m d a r ) 和双脱氢抗坏血酸还原酶( d h a r ) 的活性低于w t ，另一方面 谷胱甘肽库和谷胱甘肽还原酶( g r ) 活性升高。这些结果都预示抗坏血酸与谷 胱甘肽代谢之间解偶联。吡啶核菅酸水平的变化为这一结论提供了佐证。在1 2 小时盐处理时v l c j 中n a d ( p ) h 含量升高，而此时w t 中含量降低，此结果可 解释为对用于还原氧化型抗坏血酸的n a d ( p ) h 利用率下降。 进一步研究表明v t c 一，突变体中低抗坏血酸含量引起抗氧化体系的扰动。 一些对胁迫敏感的抗氧化酶的活性，诸如c u z n s o d 、c a p x 和p o d 在v t c - ， 突变体中上调。同时p a l 的活性模式也发生改变。结果表明盐胁迫下低抗坏血 酸含量调节了植物的氧化还原系统和防御体系。 关键词：抗坏血酸拟南芥抗坏血酸一谷胱甘肽循环氧化胁迫光系统1 1v t c j 中科院寒旱所博士论文盐胁迫下抗坏血酸生理功能研究 英文摘要 p h y s i o l o g i c a lr o l e so f a s c o r b a t eu n d e rs a l ts t r e s s c h e n g h o n gh u a n g ( p l a n tp h y s i o l o g ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y ) d i r e c t e db yl i x i nz h a n g a b s t r a c t a sa na b u n d a n ts m a l lm o l e c u l a rm e t a b o l i t e ，a s c o r b a t ep l a y sm u l t i p l er o l e si n p l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t a na r a b i d o p s i sa s c o r b a t e - d e f i c i e n tm u t a n t ，v t c j ， w h i c hh a so n l y3 0 a s c o r b a t ec o n t e n t so f t h ew i l dt y p e ( w t ) ，w a su s e dt os t u d yt h e p h y s i o l o g i c a lr o l e so f a s c o r b a t eu n d e rs h o r t - t e r ms a l ts t r e s si nv i v o s a l ts t r e s sr e s u l t e di nam o r es i g n i f i c a n td e c r e a s ei nc 0 2a s s i m i l a t o r yc a p a c i t y i nt h ev l c ，m u t a n tt h a ni nt h ew t p h o t o s y s t e mi if u n c t i o ni na r a b i d o p s i sv t f 一， m u t a n ta l s os h o w e da ni n c r e a s e ds e n s i t i v i t yt os a ks t r e s s o x i d a t i v es t r e s s ，i n d i c a t e d b yh y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) c o n t e n t ，i n c r e a s e dm o r ed r a m a t i c a l l yi n t h ev t c ， m u t a n tt h a ni nt h ew tu n d e rs a l ts t r e s s t oc l a r i f yt h er e a s o nf o rt h ei n c r e a s e d o x i d a t i v es t r e s si nt h ev 把1m u t a n t t h ec o n t e n t so fa s c o r b a t ew e r em e a s u r e d t h e a s c o r b a t ep o o lw a sd e c r e a s e dg r e a t l ya n dw a sa l m o s tc o m p l e t e l yo x i d i z e di nt h e v t c ，m u t a n td u r i n g4 8hs a l ts t r e s s a s c o r b a t ef e e d i n ge x p e r i m e n ts h o w e dt h e d e c r e a s ei np h o t o s y s t e mi if u n c t i o nw a sr e s t o r e di nt h ev t c 一，m u t a n t t h u s 1 0 w i n t r i n s i ca s c o r b a t ea n d ( o r ) i t sl o wr e g e n e r a t i o np r o b a b l yi n d u c e dad r a m a t i c d e c r e a s ei nt h er e d u c e df o r mo fa s c o r b a t e w h i c hr e s u l t e di nb o 血e n h a n c e dr o s c o n t e n t sa n dd e c r e a s e dn p qi nt h ev t c - 1m u t a n t a s c o r b a t e r e g e n e r a t i o ns y s t e m i n a s c o r b a t e g l u t a t h i o n ec y c l e w a sa l s o e x a m i n e d t h ea c t i v i t i e so ft w oa s c o r b a t er e d u c i n ge n z y m e sm d a ra n dd h a r w e r el o w e ri nt h ev c jm u t a n tt h a ni nt h ew tu n d e rs a l ts t r e s s w h e r e a sg l u t a t h i o n e p o o la n dt h ea c t i v i t i e so fo rw e r ee l e v a t e d t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h eu n c o u p l i n g b e t w e e na s c o r b a t ea n dg l u t a t h i o n em e t a b o l i s m t h ec h a n g e si nn i c o t i n a m i d ea d e n i n e d i n u c l e o t i d el e v e l sc o n f i r m e dt h i sc o n c l u s i o n n a d ( p ) hc o n t e n t si n c r e a s e di nv t c - i 4 英文摘要 d u r i n g12hs a l tt r e a t m e n tw h i l ed e c r e a s e di n t h ew t ，w h i c hs u g g e s t st h a tt h e u t i l i z a t i o no f n a d ( p ) ht or e d u c eo x i d i z e da s c o r b a t ew a sd e c r e a s e di nv t c j f u r t h e rs t u d i e sd e m o n s t r a t e dl o wa s c o r b a t ec o n t e n t sp e r t u r b e dt h e a n t i o x i d a n ts y s t e mi nv t c 一1 t h ea c t i v i t i e so fs o m es t r e s ss e n s i t i v ea n t i o x i d a n t e n z y m e ss u c ha sc u z n s o d ，c a p x ，a n dp o d w e r eu p - r e g u l a t e du n d e rs a l ts t r e s si n v 阳一，t h ea c t i v i t i e so fp a ls h o w e ds i m i l a rp a a e mi nv t c - 1 t h er e s u l t si n d i c a t el o w i n t r i n s i ca s c o r b a t ec o n t e n t sr e g u l a t e dp l a n tr e d o xa n dd e f e n s es y s t e mu n d e rs a l t s t r e s s k e yw o r d s ：a s c o r b a t e ，a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，a s c o r b a t e - g l u t a t h i o n ec y c l e ， o x i d a t i v es t r e s s ，p h o t o s y s t e mi i ，v t c 一， 5 中科院寒早所博士论文盐胁迫下抗坏血酸生理功能研究 第一部分前言 与动物不同，植物不移栖的生长方式使其不能逃避恶劣的生活环境。在其 整个生活史中必须适应各种不同的环境胁迫，因而需要灵活的适应机制。植物 即使在正常代谢中也会产生的活性氧( r o s ) 。在寒区、旱区逆境下生长的植物 体更易于产生过量的活性氧( r o s ) 。由于r o s 一方面具有氧化伤害能力，另 一方面参与环境胁迫感应和信号转导过程( l e v i n ee ta 1 ，19 9 4 ；f o y e re la 1 ，19 9 7 ； n o c t o re t a l ，2 0 0 0 1 ，因此必须受到严格的控制。植物为了控制在正常代谢中， 特别是在环境胁迫下过量产生的活性氧( r o s ) ，在长期进化形成了复杂的抗氧 化体系，包括小分子抗氧化物和抗氧化酶。抗坏血酸( a s c o r b a t e ，a s c ，v i t a m i nc ) 在植物抗氧化胁迫活性氧( r o s ) 清除中具有至关重要的作用。同时，在逆境 胁迫下易于产生真接或间接的生理性光胁迫，而抗坏血酸参与非光化学淬灭和 光合电子传递链中产生的活性氧的清除，具有光保护作用。如沙棘等旱生植物 果实中抗坏血酸含量极高，这正是植物为适应环境进化的结果。抗坏血酸在植 物中的功能及其保护机制是植物逆境生理研究的重要组成部分。 抗坏血酸在植物中的功能 抗坏血酸是植物细胞中大量存在的有机小分子，广泛存在于包括藻类和藓 类等光合真核生物中。抗坏血酸浓度在叶绿体中可达到2 0m m ，广泛存在于包 括细胞质、叶绿体、液泡、线粒体和细胞壁在内的所有细胞区域。抗坏血酸在 植物胁迫生理及生长发育中具有重要功能。它是控制r o s 含量至关重要的抗氧 化物( n o c t o ra n df o y e r , 1 9 9 8 ) 。做为还原剂和a p x 的辅酶，它是抗氧化体系的 重要组分( s m i m o i f , 1 9 9 6 ；n o c t o ra n df o y e r1 9 9 8 ；a s a d a , 1 9 9 9 ) 。抗坏血酸是细 胞中有力的还原剂，对细胞氧化还原态的维护起重要的缓冲作用。做为辅酶， 抗坏血酸参与光保护作用、病虫害反应、及细胞伸展和分裂( a r r i g o n i ，1 9 9 4 ； s m i m o i f , 2 0 0 0 ；a s a d a , 1 9 9 9 ；c o n k l i n ，2 0 0 1 ；p i g n o c c h ia n df o y e r , 2 0 0 3 ) 。抗坏血酸 在植物中的主要功能包括以下几个部分： 6 第一部分前言 抗坏血酸做为抗氧化剩 做为抗氧化剂，抗坏血酸在抗氧化胁迫起重要作用。在植物体中诸多因素 可产生r o s 。正常生长条件下，伴随着光合作用中的氧的光还原形成超氧阴离 子( s u p e r o x i d e ，0 2 一) ，并进一步形成各种r o s 。这些r o s 包括过氧化氢( h y d r o g e n p e r o x i d e ，h 2 0 2 ) 、超氧阴离子( s u p e r o x i d e ，0 2 ) 和羟自由基( h y d r o x y lr a d i c a l ， o h ) 等，可造成氧化胁迫。当r o s 的产生超过了植物体的抗氧化能力，既造 成氧化伤害。在高光与其他胁迫环境条件如干旱、盐碱、极端温度、营养匮乏 等相结合时，就会形成光氧化( f o y e re la 1 ，1 9 9 4 ) 。其它非生物环境因素如u v - b 、 臭氧、二氧化硫等大气污染、白草枯等具有氧化还原活性的除草剂和锌、铜、 铬等具有植物毒性的重金属都能导致r o s 的升高。在植物受到病菌侵染发生氧 爆现象时也大量生成r o s ( l a m ba n dd i x o n , 1 9 9 7 ) 。尽管r o s 中羟自由基等毒 性强，需要严格控制，但r o s 在信号转导中具有重要作用，据认为氧爆中产生 的h 2 0 2 对超敏反应起诱发作用( c h e ne la 1 ，1 9 9 3 ；l e v i n ee ta 1 ，1 9 9 4 ) 。对r o s 的控制是通过抗氧化网络体系完成的。在此网络中a s c 通过多种机制清除r o s 。 做为还原剂，a s c 可以直接清除一些r o s 如单线态氧、超氧阴离子和羟自由基 ( p a d h ，1 9 9 0 ) 。抗坏血酸做为水溶性抗氧化小分子也参与脂质的还原。结合在膜 脂上的旺生育酚( a - t o c o p h c r o l ，v i t a m i ne ) 依靠抗坏血酸的还原以防止脂质过 氧化( p a c k e re t a l ，1 9 7 9 ；l i e b l e r e t e l l ，1 9 8 6 ) 。生育酚是重要的脂溶性抗氧化物， 被认为是单线态氧的主要清除剂，也是其它r o s 的有效清除剂。而抗坏血酸使 生育酚在清除r o s 后再生( f o y e r e la 1 ，2 0 0 5 ) 。抗坏血酸做为a p x 的辅酶也间 接地参与h 2 0 2 的清除( f o y e ra n dh a l l i w e l l ，1 9 7 6 ；a s a d aa n dt a k a h a s h i ，1 9 8 7 ； a s a d a , 19 9 2 ) 。 研究表明植物细胞中抗坏血酸的氧化还原状态与氧化胁迫具有因果关系。 通常抗坏血酸的加速氧化和( 或) 低效率的再生还原会导致抗坏血酸库的加速 氧化。当抗坏血酸失去一个电子时形成单脱氢抗坏血酸( m o n o d e h y d r o a s c o r b a t e ， m d a ) 。m d a 不稳定，易于歧化为抗坏血酸和双脱氢抗坏血酸( d e h y d r o a s c o r b a t e ，d h a ) 。m d a 和d h a 可分别被单脱氢抗坏血酸还原酶( m o n o d e h y d r o a s c o r b a t er e d u c t a s e ，m d a r ) 和双脱氢抗坏血酸还原酶( d e h y d r o a s c o r b a t e r e d u c t a s e ，d h a r ) 还原成还原型的抗坏血酸( f o y e ra n dh a l l i w d l ，19 7 6 ；j a b l o n s h i 7 中科院寒早所博士论文盐胁迫下抗坏血酸生理功能研究 a n d a n d e r s o n ，1 9 8 1 ；h o s s a i na n d a s a d a ，1 9 8 4 ) 。抗坏血酸的氧化还原状态至少部 分依赖于抗坏血酸库的大小。 抗坏血酸的光保护作用 在高光下细胞中抗坏血酸水平上升，可见抗坏血酸在光合作用中十分重要。 光合作用放出氧气、吸收光并进行电子传递，易于产生r o s 。光合作用中r o s 的形成包括：氧的光还原形成0 2 - ：激发态能量传向氧形成单线态氧；在光呼 吸中过氧化物酶体的乙醇酸氧化酶反应形成h 2 0 2 等( a s a d a ，1 9 9 9 ) 。因此叶绿 体必须有完善的r o s 清除系统。除了上面提到的直接清除r o s 和做为a p x 的 辅酶间接清除r o s 外，抗坏血酸也是叶黄素循环( x a n t h o p h y l lc y c l e ) 中紫黄质 去环化酶( v i o l a x a n t h i nd e - e p o x i d a s e ，v d e ) 的辅酶( e s k l i n ge la l ，1 9 9 7 ) ，在光保 护中起作用。此循环中紫黄质和玉米黄质跨内囊体膜转换。而此循环涉及光系 统i i 过量光能的非光化学淬灭( d e m m i g - a d a m sa n da d a m s ，1 9 9 0 ) ，已有体内 ( m i i l l e r m o u l de ta l ，2 0 0 2 ) 、体外( h a g e r , 1 9 6 9 ) 证据表明抗坏血酸做为v d e 的辅酶影响非光化学淬灭。近期研究表明质膜和液泡膜存在基于抗坏血酸的电 子传递体系，此体系对电子传递链的驱动十分重要。在两种膜上都含有抗坏血 酸依赖的细胞色素b 5 6 1 ，它被膜一面的抗坏血酸还原，而被膜另一面的m d a 氧化( p r e g e r e la 1 2 0 0 4 ) 。 抗坏血酸参与细胞壁的构成 抗坏血酸也是肽基- 脯氨酰和肽基赖氨酰羟基化酶的辅酶，用于合成羟脯 氨酸和羟赖氨酸( p a d h ，1 9 9 0 ) 。在植物体中，高丰度的富羟脯氨酸糖蛋白 ( h y d r o x y p r o l i n - r i c hg l y c o p r o t e i n s ，h r g p s ) 是细胞壁结构的主要成分，对 h r g p s 的研究较为深入。这种糖蛋白是细胞壁的结构支持物，在损伤、乙烯和 病虫害的诱导下通过脯氨酸的羟基化作用形成( s o m m e r - k n u d s e n e t a l ，1 9 9 7 ) 。 h r g p s 的诱导合成增加了对抗坏血酸的需求。事实上，番茄不同组织的损伤引 起m d a rm r n a 的急剧积累( g r a n t ze ta 1 ，1 9 9 5 ) ；而m d a r 水平的上升与维 持用于羟基化的抗坏血酸需求水平相关。还有证据( g a r c l a - m u n i ze t a l ，1 9 9 8 ) 表明抗坏血酸可能直接参与h r g p s 的诱导。因此抗坏血酸做为合成羟脯氨酸辅 8 第一部分前言 酶的功能说明抗坏血酸也参与植物细胞分裂。不仅如此，h r g p s 也在细胞胶原 合成中起重要作用。 抗坏血酸在细胞分裂与伸展中的作用 一般抗坏血酸在分生组织中含量高而在细胞分裂活动性低的组织中含量很 低( s m i m o f f , 1 9 9 6 ) ，已有证据表明抗坏血酸参与细胞分裂。同样，抗坏血酸氧 化酶( a s c o r b a t eo x i d a s e ，a o x ) 在非分裂细胞中其m r n a 和酶活性高；而进入 分裂中时m r n a 和酶活性都较低( k e r ka n df e l d m a n 。1 9 9 5 ；k a t oa n de s a k a ， 1 9 9 9 ) 。该酶使抗坏血酸氧化，造成还原性抗坏血酸含量下降。外源抗坏血酸可 促进细胞分裂中感受态细胞从g 1 期进入s 期。一些研究表明富羟脯氨酸糖蛋 白h r g p s 参与调节细胞周期的进程( c i t t e r i oe ta l ，1 9 9 4 ) ，而抗坏血酸参与蛋 白的脯氨酰羟化作用。当脯氨酰羟化作用受抑制时，细胞分裂亦会受抑制，使 细胞处于分裂中期( c o o p e re ta l ，1 9 9 4 ；d et u l l i oe ta l ，1 9 9 9 ) 。尽管抗坏血酸是 细胞分裂所必需的，但它不太可能直接参与调节细胞周期的进程。 通过对实验结果的分析，s m i m o f f ( 1 9 9 6 ) 提出抗坏血酸和a o x 在调节细 胞伸展中作用的假说。此假说认为细胞壁通过a o x 生成m d a ，而m d a 被与 脂膜结合的细胞色素b 还原( h o r e m a n se t a l ，1 9 9 4 ；a s a r de t a l ，1 9 9 5 ) 。还原后 的抗坏血酸再被运到质外空间。在这个循环中实现电子的跨膜运输。这种电子 的跨膜运输通过酸生长理论( r a y l ea n dc l e l a n d ，1 9 9 2 ) 刺激了细胞的伸展。同 时，抗坏血酸通过影响细胞壁蛋白和多糖的交联、木质化和c a 2 + 水平调节细胞 伸展。近期研究表明细胞伸展中抗坏血酸、a o x 酶活性及m r n a 水平升高( k a t o a n de s a k a ，1 9 9 9 ) ，支持了上述假说。 拟南芥抗坏血酸突变体及其在抗坏血酸合成与功能研究中的作用 抗坏血酸( a s c o r b a t e ，a s c ，v i t a m i n c ) 是植物细胞中大量存在的有机小分子， 其浓度在叶绿体中可达到2 0m m ，存在于包括细胞壁在内的所有细胞区域。做 为还原剂和抗坏血酸过氧化物酶( a s c o r b a t ep e r o x i d a s e ，a p x ) 的辅酶，它是抗氧 化体系的重要组分。同时，抗坏血酸也在光合作用；植物生长如细胞分裂、细 胞壁伸展和其他发育中起作用( a r r i g o n i ，1 9 9 4 ；a s a d a , 1 9 9 9 ；s m i m o f f , 2 0 0 0 ； 9 中科院寒旱所博士论文盐胁迫下抗坏血酸生理功能研究 c o n k l i n ，2 0 0 1 ；p i g n o c c h ia n df o y e r , 2 0 0 3 ) 。自1 9 9 6 年起，人们从拟南芥中陆续 分离出一批抗坏血酸缺失突变体( v t c ) 。它们的抗坏血酸含量是野生型的1 0 5 0 ( c o n k l i ne ta 1 ，1 9 9 6 ；2 0 0 0 ) 。拟南芥抗坏血酸缺失突变体的分离鉴定为抗 坏血酸生物合成与功能研究注入了新的活力。该突变体使人们得以深入研究植 物体抗坏血酸生物合成途径以及抗坏血酸在光合作用、抗性生理、氧化还原信 号调节和生长发育过程中的功能。这些研究将为提高农作物维生索c 含量和抗 性的基因改造工程提供理论依据。 拟南芥抗坏血酸突变体 拟南芥( 爿r a b i d o p s & t h a l i a n a ) 是现今主要的模式植物。具有生活周期短、小 基因组、成熟的经典遗传学手段等特征，使其研究远远领先于诸如番茄、烟草、 玉米等具有重要农业价值的模式植物。拟南芥全基因组测序已经完成，更推动 了植物基础理论的研究，使之成为近年来国际植物科学关注的焦点。 1 9 9 6 年c o n k l i n 等从拟南芥中分离出一种抗坏血酸缺失突变体v t c 一( v i t a m i n c 1 ) 。当c o l u m b i a ( c o l ，0 ) 野生型拟南芥种子经乙基甲磺酸( e t h y l m e t h a n e s u l f o n a t e ，e m s ，一种化学诱变剂) 诱变，通过臭氧筛选得到一种对臭 氧敏感的植株，最初命名为s o z l ( s e n s i t i v et oo z o n e ) 。进一步的遗传学及生化分析 表明它是一种半显性单基因突变体，抗坏血酸含量是野生型的3 0 6 0 ，脂质过 氧化程度增加。此突变体对其他可引起r o s 产生的物质如s 0 2 、u v - b ( u l t r a v i o l e t bl i g h t ) 也很敏感( c o n k l i ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 。突变体中抗坏血酸缺失的原因可能是 分解代谢的增强和( 或) 合成代谢的下降。研究表明参与催化抗坏血酸氧化和还 原的酶活性与野生型相比没有差异；尽管在v t c 中抗坏血酸周转的绝对速率较 低，但与植物体中抗坏血酸库( a s c o r b a t ep 0 0 1 ) 相比，其相对周转速率与野生型 没有显著差异；在 u - 1 4 c o l c 懈标记实验中，v t c j 中l - 【”c 】抗坏血酸占全部 可溶性h c 累积物的百分比低于野生型，表明突变体中抗坏血酸的缺失是由抗坏 血酸生物合成代谢缺陷造成的( c o n k l i ne l a l ，1 9 9 7 ) 。结合生物化学、分子生物 学和经典遗传学方法证明v i c 1 位点编码g d p 甘露糖焦磷酸化酶，此酶是 s m i m o f f w h e e l e r 抗坏血酸生物合成途径的主要组分( w h e e l e re ta 1 ，1 9 9 8 ) 。在 突变体2 号染色体v t c l 位点上一个点突变( c t ) 引起其编码的高度保守的脯 氨酸( p r o l i n e ) 转变成丝氨酸( s e f i n e ) ，这种变化可能造成蛋白构象变化，进而 1 0 第一部分前言 使g d p o 甘露糖焦磷酸化酶活性降低，最终导致抗坏血酸生物合成的下降( c o n l d i n 甜a 1 ，1 9 9 9 ；图1 一i ) 。 =萼忌 夏 _口、 t 】 、。 a i = ! ：i q ：l q ：! 剑：l ：c h r2 b c d b a c t 5 1 7 ：! 銮! ! 骂丝9 2 k b ；： v 托j 一，。f - 2 t 围1 1v t c f 位点的遗传与物理性状( c o n k l i ne ta l ，1 9 9 9 ) ( a ) v t c l 位点定位于2 号染 色体，距c a p s ( c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i cs e q u e n c e ) 标记m 4 2 9 远着丝粒0 9c m ，位于 基因组一段已测序范圈中。( b ) 一编码推断g d p 一甘露麓焦磷酸化酶的基因位于此毗连群着丝 粒近端9 2 k b 的t 5 1 7 上。圈中蛤出b a ct 5 1 7 中y 丁c ，位点和另一已知基因位点，t o p p 4 。 ( c ) 此b a c 中用于通过农杆菌借导转化的v t c l 1 突变互补的3 4 - k bc l a i - h i n d l l l 片段。用 于扩增v t c l 位点，分析v t c l 一，和v t c l 2 基因组d n a 序列的引物位重用箭头显示( d ) v t c l 结构与c i - 1 和v t c l 2 棱苷替换：白色矩形框，v 1 fc d n a 非编码序列：黑色矩形框编码 g d p 甘露糖焦磷酸化酶的外显子：细线，内含子序列位置。 f i g1 - 1 g e n e t i ca n dp h y s i c a lc h a r a c t e r i z a t i o no ft h em 1l o c u s ( f r o mc o n k l i ne fa l ，1 9 9 9 ) ( a ) 、c fw a sm a p p e dt oap o s r i o no nc h r o m o s o m e2 0 9c mc e n t r o m e r ad i s t a if r o m c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i cs e q u e n c e ( c a p s ) m a r k e rm 4 2 9 ，p l a c i n gi tw i t h i nas e q u e n c e d r e g i o no ft h eg e n o m e ( b ) ag e n ee n c o d i n gap u t a t i v eg d p m a n n c s ep y r o p h o s p h o r y l a s ei s i o c a t e do nt h e9 2 k bb a ct 5 1 7a tt h ec a n t r e m e r ep r o x i m a le n do ft h i sc o n t i g t h er e l a t i v e m a pp o s i t i o n so ft h ev t c ll o c u sa n das e c o n dg e n e t i c a l l yi d e n t i f i e dl o c u s t o p p 4 ，o nb a c i 5 1 7a r es h o w n ( c ) t h e 3 4 一k bc l a l h i n d l l if r a g m e n tf 阳mt h i sb a cu s e dt oc o m p l e m e n t t h e v t c l - 1 m u t a t i o n b ya g r o b a c t e d u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n t h ei o c a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d ep d m e r su s e dt oa m p l i f yt h ev 7 - c 1l o c u sf r o mv t c l 一7a n dv t c l 一2g e n o m i cd n a f o rs e q u e n c ea n a l y s i si si n d i c a t e dw i t ha r r o w s ( d ) t h es t r u c t ur eo ft h ev t c lt r a n s c r i b e d r e g i o ni ss h o w na l o n gw i t ht h en u c l e o t i d es u b s t i t u t i o nj nv t c l - 1a n dv t c l 2 ：u n s h a d e d r e c t a n g l e s n o n c o d i n gs e q u e n c e sp r e s e n ti nt h ev t c lc d n a ；s h a d e dr e c t a n g l e s ，e x o n s e n c o d i n gt h eg d p - m a n n o s ep y r o p h o s p h o r y l a s e ；t h i nl i n e s ，t h el o c a t i o no fi n t r o ns e q u e n c e s v t c 一突变体叶片小而狭长，抗坏血酸含量降低导致生长减慢、开花延迟和开 花后的早衰。正常生长条件下，c 0 2 同化的光饱和曲线没有显著变化，说明其生 中科院寒旱所博士论文盐胁迫下抗坏血酸生理功能研究 长发育的改变不是由光合能力下降引起；叶绿素口荧光淬灭分析表明仅非光化学 淬灭受到影响；叶片中过氧化氢( h y d r o g e np e r o x i d e ，h 2 0 2 ) 含量与野生型相似； 其抗氧化体系发生迁移：谷胱甘肽含量上升，过氧化物酶( p e r o x i d a s e ，p o d ) 活性提高，胞质a p x 表达上升( v e l j o v i c - j o v a n o v i ce t a l ，2 0 0 1 ) 。 通过c d n a 微阵列分析，与野生型相比v c 中有1 7 1 个基因表达发生改