（微生物学专业论文）沉香内生真菌的初步研究.pdf

摘要 摘要 内生真菌( e n d o p h y t i cf u n g i ) 是一大类未被充分研究的真菌。近年来的研究 表明，几乎所有植物中都存在内生真菌，他们主要生长在植物的根、茎、叶等 器官的表皮下的组织当中。它泛指那些生活在健康的植物体内不引起任何病害 症状的所有真菌，植物内生真菌长期生活在稳定的植物微生态系统中，和宿主 建立了共生或半共生关系。研究表明已分离出的大多数植物内生真菌能够产生 与其宿主相同或相似的活性成分。 白木香树的茎干在刀砍、虫蛀、病腐后被真菌感染，木质部的薄壁细胞中 储存的物质产生一系列化学变化，最后形成树脂，即为沉香。为了找出含有树 脂的木材，必须砍倒树干才能找出含有沉香树脂的个体，导致大量白木香树遭 人砍伐，严重影响了白木香族群的生存。同时，沉香的高价也导致了白木香在 多个沉香产地国被非法砍伐及贸易。因此，从沉香木块中分离沉香内生真菌研 究人工结香具有重要的意义。 本论文通过优化内生真菌的分离条件，从沉香木块中分离纯化出9 株沉香 内生真菌，然后通过苄基丙酮耐受性、人工结香材料分析等方法筛选出4 株内 生真菌具有促进结香作用；对该4 株内生真菌进行分子生物学种属鉴定、人工 结香条件实验和红褐肉座菌摇瓶发酵实验。实验结果概括如下： l 、沉香内生真菌分离条件优化实验中，采用次氯酸钠( 5 有效氯) 作为表面 消毒剂处理效果较好，选择次氯酸钠( 5 有效氯) 消毒合适的时间为4 m i n ，最适 分离培养温度是2 6 。共分离纯化出9 株沉香内生真菌，经初步鉴定分属2 亚 门、5 目、5 科、5 属。 2 、对沉香挥发油提取方法进行方法学研究，选择索氏提取无水乙醚回流法 结合g c m s 分析沉香挥发油成分组成。 3 、沉香内生真菌的筛选实验中，先后通过苄基丙酮耐受性筛选、人工结香 样品变色部分的宽度和燃烧香味筛选，最后筛选出a q 2 、a q 3 、a q 5 b 、a q 7 等4 株内生真菌。 4 、沉香内生真菌的分子生物学种属鉴定，鉴定结果为：a q 2 为蒂腐色二孢 ( b o t r y o s p h a e r i ar h o d i n a ) ，a q 一3 为红褐肉座菌( h y p o c r e aj e c o r i n a ) ，a q 一5 b 里 氏木霉( t r i c h o d e r m a r e e s e i ) ，a q 7 为康氏木霉( t r i c h o d e r m ak o n i n g i i ) 。 摘要 5 、对4 株沉香内生真菌蒂腐色二孢、红褐肉座菌、里氏木霉、康氏木霉按 照封口方式、打孔位置、接菌方式、结香时间等方案进行人工结香条件研究。 最适结香条件：采用棉塞和木塞作为封口方式；选择树干自基部5 0 l o o c m 之间 的区域作为结香位置；采用蒂腐色二孢菌株单菌结香和褐肉座菌、里氏木霉、 康氏木霉3 株木霉属内生真菌混菌结香，其次是里氏木霉、康氏木霉混合人工 结香等作为人工结香方式；适当延长接菌时间，可以得到品质好的沉香。 6 、红褐肉座菌摇瓶发酵液和菌体内含物g c m s 的检测实验，在发酵液成 分中未发现苄基、呋喃基等基团的成分存在，菌体内含物中检测出苯毗喃类化 合物，属于沉香复杂成分中的一种，但是该化合物的含量非常少，而且成分也 比较单一，采用微生物发酵产沉香物质的可行性受到限制。 关键词：沉香；内生真菌；分离纯化；人工结香 i i a b s t r a c t _ - _ _ _ _ _ _ 一 a b s t r a c t e n d o p h y t i cf u n g ii s al a r g ec a t e g o r yf u n g iw h i c hh a sn o tb e e nt h o r o u g h l y s t u d i e d i nr e c e n ty e a r s ，m a n ys t u d i e sh a v es h o w nt h a te n d o p h y t i cf u n g id i s t r i b u t ei n s u b c u t a n e o u st i s s u eo fr o o t ，s t e m ，l e a fa n do t h e ro r g a n so fa l m o s ta l lp l a n t s i tg e n e r a l l y r e f e r st ot h ef u n g u sw h i c hl i v ei nh e a l t h yp l a n t sa n dd on o tc a u s ea n ys y m p t o m so f t h ed i s e a s e si np l a n t s e n d o p h y t i cf u n g id w e l ls t a b l yi nt h ep l a n t sm i c r o 。e c o l o g i c a l s y s t e mi nl o n g t e r m ，a n de s t a b l i s hh a l fs y m b i o t i co rs y m b i o t i cr e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h eh o s t r e s e a r c h e sh a v es h o w nt h a tt h em a j o r i t yo fi s o l a t e de n d o p h y t i cf u n g u sc a n p r o d u c es a m eo rs i m i l a ra c t i v ei n g r e d i e n t sw h i c he x i s ti np l a n t sh o s t a q u i l a r i a s i n e n s i st r e ec a nb e i n f e c t e d b yf u n g i a f t e r a r t i f i c i a l l y s l a s h e d ，m o t h e a t e no rt o t t e d ，t h e nt h em a t e r i a ls t o r e di nt h ep a r e n c h y m ac e l l so ft h e x y l e mo ft h et r u n kt a k ea s e r i e so fc h e m i c a lr e a c t i o n sa n df i n a l l yg e n e r a t er e s i n ，w h i c h i sk n o w na sa g a l w o o d i no r d e rt of i n do u tt h et i m b e rc o n t a i n i n gr e s i n ，p e o p l eh a v et o c u td o w nm a n ya q u i l a r i as i n e n s i st r e e s ，s ot h a tt h ei n d i v i d u a lw i t ha g a l w o o dr e s i nc a n b ei d e n t i f i e d ，w h i c hc a u s eal a r g en u m b e ro fa q u i l a r i as i n e n s i st r e e s f e l l e da n d s e r i o u s l ya f f e c t e dt h es u r v i v a lo fe t h n i cg r o u p so fa q u i l a r i a s i n e n s i s m e a n w h i l et h e h i g hp r i c eo fa g a l w o o dh a sl e dt oi l l e g a ll o ga n dt r a d ea g a l w o o di n an u m b e ro f c o u n t r i e so fo r i g i n s ot h es e p a r a t i n ge n d o p h y t i cf u n g if r o mc h e nx i a n gb l o c ka n d s t u d yo f a r t i f i c i a le d g e w o r t h i ai so fg r e a ts i g n i f i c a n c e i nt h i sp a p e r , d u r i n go p t i m i z a t i o no fc o n d i t i o n so fe n d o p h y t i cf u n g ii s o l a t i o n ，9 a g a l w o o de n d o p h y t i cf u n g ih a v eb e e ns e p a r a t e d a n dp u r i f i e df r o mc h e nx i a n g b l o c k t h e nt h r o u g hb e n z y l a c e t o n et o l e r a n c e ，a r t i f i c i a le d g e w o r t h i a m a t e r i a l sa n a l y s i s e ta l ，4a g a l w o o de n d o p h y t i cf u n g iw i t ht h ep r o m o t i o no ft h e r o l eo fa r t i f i c i a l e d g e w o r t h i ah a v eb e e ns c r e e n e da n dt h es p e c i e si d e n t i f i e db ym o l e c u l a rb i o l o g y t e c h n i q u e s a t t h es a m et i m et h ea r t i f i c i a le d g e w o r t h i ac o n d i t i o n sa n dh y p o c r e a j e c o r i n af e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n t sh a v e b e e nc a r r i e d o u t t h er e s u l t sc a nb es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： l 、t h ee x p e r i m e n t so fo p t i m i z a t i o no fc o n d i t i o n so fa g a l w o o de n d o p h y t i cf u n g i s e p a r a t i o na d o p tn a c l 0 ( 5 a v a i l a b l ec h l o r i n e ) a sad i s i n f e c t a n to nt h es u r f a c ea n d s t e r i l i z ef o r4m i n ，a n dc h o o s e2 6 a st h ei s o l a t i o na n dc u l t u r et e m p e r a t u r e a tl a s t9 i i i a b s t r a c t a g a l w o o de n d o p h ”i cf u n g ih a v e b e e ns e p a r a t e da n dp u r i f i e d a c c o r d i n gt ot h e p r e l i m i n a r yi d e n t i f i c a t i o n ，t h e ya r eb e l o n gt o2s u b d i v i s i o n s ，5c l a s s e s ，5o r d e r s ，5 f a m i l i e s ，5g e n i 2 、t h r o u g hr e s e a r c h e so fe x t r a c t i o nm e t h o d so fa g a l w o o dv o l a t i l eo i l ，w es e l e c t s o x h l e ta n h y d r o u sd i e t h y le t h e rr e f l u xa n dg c - m sa st h em e t h o dt o a n a l y s i s c o m p o n e n t so fa g a l w o o dv o l a t i l eo i l 3 、i nt h ea g a l w o o de n d o p h y t i cf u n g is c r e e n i n ge x p e r i m e n t s a q - 2 、a q - 3 、a q 一5 b 、 a q 一7e ta l ，4e n d o p h y t i cf u n g ih a v eb e e ns c r e e n e da f t e rt e s t i n gt h eb e n z y l a c e t o n e t o l e r a n c e ，t h ew i d t ho fa r t i f i c i a le d g e w o r t h i as a m p l e sw h i c hc h a n g ec o l o ra n dt h e b u r n i n gs m e l l 4 、t h er e s u l t so ft h es p e c i e si d e n t i f i c a t i o no fa g a l w o o de n d o p h y t i cf u n g ib y m o l e c u l a r b i o l o g yt e c h n i q u e si s ：a q 一2 ( b o t r y o s p h a e r i ar h o d i n a ) ，a q 一3 ( h y p o c r e a j e c o r i n a ) ，a q 一5 b ( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) ，a q - 7 ( t r i c h o d e r m ak o n i n g i o 5 、t h es t u d i e so fa r t i f i c i a le d g e w o r t h i ac o n d i t i o n so f4a q u i l a r i ae n d o p h y t i c f u n g i ：b o t r y o s p h a e r i ar h o d i n a ，h y p o c r e aj e c o r i n a ，t r i c h o d e r m ar e e s e i ，t r i c h o d e r m a k o n i n g i i ，h a v e c a r d e do u t f o l l o w i n g t h ep r o g r a m so fs e a l i n gm e t h o d s ，s r i l l i n g l o c a t i o n s ，f u n g ii n j e c t i o nm o d e s ，e d g e w o r t h i at i m e t h eb e s tc o n d i t i o n sa r e ：t a m p o na n d m u s ea ss e a l i n gm e t h o d s ；t h ea r e a5 0 - 10 0 c mf r o mt h eb o o to ft h et r u n k ；a s i n g l e f u n g u s o f b o t r y o s p h a e r i a r h o d i n aa n d h y p o c r e aj e c o r i n a ，t r i c h o d e r m a r e e s e i ，t r i c h o d e r m a k o n i n g i i 3 e n d o p h y t i cf u n g i o ft r i c h o d e r m a m i n g l i n g t o g e t h e r , t r i c h o d e r m ar e e s e io rt r i c h o d e r m ak o n i n g i i2e n d o p h y t i cf u n g im i n g l i n g t o g e t h e r ；e x t e n d i n ge d g e w o r t h i at i m e ，c a nb eag o o dq u a l i t yo fa g a l w o o d 6 、g c - m sw a su s e dt oa n a l y z et h ec o n t e n t so fb r o t ha n dm y c e l i u mo fh y p o c r e a j e c o r i n a ，t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ：t h eb e n z y lg r o u pa n df u r y lg r o u ph a v en o tb e e n f o u n di nt h eb r o t h ，b u tt h eb e n z o p y r a n sw h i c hb e l o n gt ot h ec o m p l e xc o m p o n e n t so f a g a l w o o dh a sb e e nf o u n di nt h em y c e l i u mo fh y p o c r e aj e c o r i n a ，b u tb e n z o p y r a n si s v e r yl i u l ea n ds i n g l e ，s ow ec a nc o n c l u d et h a tt h ef e a s i b i l i t yo fu s i n gm i c r o b i a l f e r m e n t a t i o nt oy i e l da g a l w o o dc o m p o n e n t si sl i m i t e d k e yw o r d s ：a q u i l a r i as i n e n s i s ；e n d o p h y t i cf u n g i ；s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ； a r t i f i c i a le d g e w o r t h i a i v 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：烈密亟羔签字日期： 喈年，明 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌太堂有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直昌太堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：诌哆生 导师签名：互届一也 签字日期：冲明 e l 签字日期：御驴年月杪日 第1 章前言 第1 章前言 1 1 植物内生真菌的研究进展 自1 8 9 8 年g u e r i n 等【l 】从黑麦草( l o l i u mt e m u l e n t u ml ) 中分离出第一株内 生真菌以来，对内生真菌的研究已经有一百多年的历史。但是对植物内生真菌 全面深入的研究才刚刚开始。1 9 9 3 年美国蒙大拿州立大学教授g a r ys t r o b e l 等【2 】 报道，从太平洋短叶红豆杉( t a x u s lb r e v i f o l i a ) 韧皮部中分离出了一株能产紫杉 醇的内生真菌( t a x o m y c e sa n d r e a n a e ) ，引起了国内外众多研究者的极大关注， 纷纷把目光投向植物内生真菌的研究。 植物内生真菌由于长期生活在稳定的植物微生态系统中，和宿主建立了共 生或半共生关系，因此它是植物体内的正常菌群，可通过组织学方法或严格表 面消毒从植物组织中分离出内生真菌，也可以直接从植物组织中扩增出真菌 d n a 的方法来证明其内生。宿主植物与其内生真菌彼此相互影响，研究表明已 分离出的大多数植物内生真菌能够产生与其宿主相同或相似的活性成分，不过 有关真实机制还没有确切的定论，多数人认为是植物和内生真菌之间基因交流 的结果。 内生真菌( e n d o p h y t i cf u n g i ) 是一大类未被充分研究的真菌，近年来的研究 表明，几乎所有植物中都存在内生真菌，其种类极其丰富，他们主要生长在植 物的根、茎、叶等器官的表皮下的组织当中，它泛指那些生活在健康的植物体 内不引起任何病害症状的所有真菌【3 】。 1 1 1 内生真菌的定义及研究历程 内生真菌( e n d o p h y t i ef u n g i ) 属于内生菌( e n d o p t e ) 的概念范畴，内生菌 ( e n d o p h y t e ) 一词首先由d eb a r y l8 8 6 年提出，是指生活在植物组织内的微生 物，用以区分那些生活在植物表面的表生菌( e p i p h y t e ) 1 4 】。c a r r o l l 5 】将内生菌 的定义为生活在地上部分、活的植物组织内并不引起明显病害症状的真菌。强 调内生菌与植物的互惠共生关系，因此，在这个内生菌概念的范畴内不包含植 物致病菌和菌根菌。p e t r i n i ( 1 9 9 1 ) 把c a r r o l l 的概念范畴进一步扩展，将内生 菌定义为那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有 引起明显病害症状的菌。这个定义包括那些在其生活史中的某一阶段表面生的 第1 章前言 腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌( l a t e n tp a t h o g e n s ) 和菌根菌【6 j 。b i l l s ( 1 9 9 6 ) 也认为一些类型的菌根菌，如内外生菌根菌，杜鹃菌根菌和假菌根菌 应属于内生菌1 7 j 。 目前对内生真菌概念的界定仍存在较大的争论和分歧，在内生真菌的研究 过程中正如h a w k s w o r t h 等【8 】指出：在研究内生菌之前最好先弄清楚内生真菌的 概念范畴。在以往的研究中，所涉及到的内生菌都是指内生真菌，随着人们内 生菌研究的深入，人们发现植物体内还存在许多内生细菌和内生放线菌。p r t r i n i 提出的内生菌概念被广泛的接受，即植物内生菌( e n d o p h y t i cf u n g i ) 指寄生在健 康植物茎干或叶片及根部，完成其全部或部分生活周期，但不形成明显侵染的 一类真菌【9 】。它们不仅包括了互惠共利的( m u t u l i s t i c ) 和中性的( n e u t r a l ) 内共生微生 物，也包括了那些潜伏在宿主体内的病原微生物。 一个多世纪前，人们就发现了在健康植物组织的内部有微生物的存在，但 是内生真菌生活于没有外在感染症状的健康植物组织内部，其存在和作用长期 以来没有得到人们足够的重视。从1 9 世纪9 0 年代以来，内生真菌研究的重要 性才开始逐渐被人们所认识【l j ，但是关于内生真菌的文献报道只有少数几篇，这 个领域很少涉及。至上世纪3 0 年代发现，由于牲畜误食感染内生真菌的牧草而 导致牲畜中毒，而造成畜牧业重大损失。从而使内生真菌的研究才得以广泛深 入地开展起来，由最初的发现、检测、分离培养和鉴定分类，到8 0 年代以后研 究它们对植物的有益影响、次生代谢产物。研究不断深入，内生真菌的研究涉 及到多样性研究，包括生态学研究，分子生物学及基因工程研究，天然活性成 分的开发研究等多个领域。而我国对内生真菌的研究是始于上世纪8 0 年代。通 过这些研究，充分发掘内生真菌巨大的应用潜能。 1 1 2 内生真菌的广泛性和生物多样性 内生真菌普遍存在于各种植物体内，具有分布广、种类多等特点。在低等 的苔藓、蕨类及裸子植物和被子植物等所有研究过的陆生及水生植物中都有内 生真菌的存在。p e t r i n i ( 1 9 8 6 ) 聂j 分布在不同纬度地区的2 0 0 多种植物进行调查， 发现几乎所有活植物体内均存在内生真菌。近几年的研究结果表明，植物内生 真菌广泛存在于植物的不同器官和组织的细胞以及细胞间隙中，其中内生真菌 的菌丝在叶鞘和种子中含量最多，而叶片和根中的含量极微。 就目前的研究结果来看，植物内生真菌多数为子囊菌类( a s c o m y c e t e s ) 的 核菌纲( p y r e n o m y e t e s ) 、盘菌纲( d i s c o m y c e t e s ) 和腔菌纲( l o c u l o a s c o m y c e t e s ) ， 2 第1 章前言 无孢菌群的多种真菌以及少量担子菌、接合菌和半知菌中常见的镰刀菌属 ( f u s a r i u m ) 、青霉属( n 聆耙川i u m ) 、链格孢菌属( a l t e r n a r i a ) 等。 研究发现，从不同植物体内分离到的内生真菌的种类和数量均有差异。内 生菌的宿主专一性有较大的变化，一些内生真菌能够从不同种属的植物宿主体 内分离出来，有些种类的内生真菌专一性较强，它们仅限于某些特殊种属的几 种植物，或专一的寄生在某一种特定的植物中。那么根据内生真菌与宿主专一 性的分析，平均每种宿主植物有4 - 5 种寄生菌，目前世界上已知的植物种类大 约有2 5 万种，据此推算内生真菌的种类至少有1l o x1 0 6 种【l 们。这无疑为科学研 究提供丰富的资源，并将极大的丰富物种的多样性，将成为宝贵的真菌资源库。 1 1 3 内生真菌的生态学 1 1 3 1 内生真菌生态类群 按照内生真菌的宿主及其系统特征可划分为具有明显差异的两大生态类群 1 1 1 】：麦角类系统禾草内生真菌与非麦角类系统内生真菌，后者是从树木和灌丛 分离出来的内生真菌( 也包括部分从禾草分离出来的非麦角类系统内生真菌) 。这 两大类内生真菌类群之间的特征比较见表1 1 。 表1 1 禾草内生真菌与非禾草内生真菌类群之间特征比较 t a b l e l 1c o m p a r i s o no f t h ec h a r a c t e r i s t i c so f g r a m i n i c o l o u sa n dn o l l g r a m i n i c o l o u se n d o p h y t i ef u n g i 非禾草内生真菌禾草内生真菌 型q 翌：g 墅! 婴i 翌i 璺q ! q 坠曼皇垦垒q 巳垦丝i 璺! u 翌g i 至! 垡! 坐i 翌i 里q i q 坠墨皇旦堡q 巳塾丝i 呈! u 坠g i 宿主是树木和灌丛植物 童妻是草本植物内并与宿主具有明显的互惠共生 大糸 分类单元多样性 在植物不同组织内的分布具有限制性 寄主范围窄 水平传播 寄主可同时被多种真菌侵染 仅有少数属和种 在植物不同组织内广泛分布 寄主范围广 垂直传播 寄主常被一种真菌侵染 1 1 3 2 内生真菌的分布 内生真菌的分布受多种因素的影响，既有外部环境的因素也有植物宿主本 身的因素。内生真菌分布于植物体的根、茎、叶、花果实和种子等器官的组织 间隙，在植物体内，不同的内生真菌相互作用，建立了优势种群和稀有种之间 的一种生态平衡。 3 第1 章前言 内生真菌受地域差异影响大，通过对内生真菌地理分布的调查，发现不同 的地理环境内生真菌的分布差异很大。f i s h e r 1 2 】等发现q u e r c u si l e xl 叶子上的 内生真菌类群在英格兰、苏格兰和瑞士三地具有明显的不同，造成这种差异的 原因可能与周围的环境因子有关。蒲葵l i v i s t o n ac h i n e n s i s ( j a c q ) r b r 叶子上内生 真菌类群在香港和百慕大两地也明显不同1 1 3 - 1 4 】。此外，内生真菌类群的分布受 郁闭度( 林冠覆盖面积与地表面积的比例) 和树冠高度等小环境的影响。一般在密 度大、封闭均质的树冠上内生真菌的数量要比在开放、暴露混合的树冠上的高； 随着树冠高度增加，定殖频率和种群多样性变化都明显增加。内生真菌类群也 会受到其他环境因子的影响，如季节的变化、采集地的湿度、采集地的海拔高 度、周围其他植物类群和环境污染程度等j 。同时，不同气候条件( 如温带和热 带) 对内生真菌的分布也有较大的影响【1 5 】，如一些腐生菌，如草本枝孢 c l a d o s o r i u m h e r b a r u m ( p e r s ) ，出芽短梗霉a u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ( d e b a r r y ) a m ，链格孢a l t e r n a r i a a l t e r n a t a ( f r ) k e i s s l 等多见于温带地区植物，而某些真菌 类群，如刺盘孢属c o l l e t o t r i c h u mc o a d a 、茎点霉属p h o m as a c c 、拟茎点霉属 p h o m o p s i s ( s a c c ) b u b 、叶点霉属p h y l l o s t i c t ap e r s 和炭角菌科x y l a r i a c e a e 的一 些种类，多见于热带地区植物。 从植物宿主角度来看，同一地区生长的同种树木上的内生真菌类群通常类 似，但在同一寄主植物的树龄对内生真菌的发生频率和分布上存在影响。通常 随着树龄的增加，植物内生真菌种类和丰富度也随之增加【1 l 】。r a g a z z i 等【1 6 】研究 橡树( q u e r c u ss p ) 的内生真菌表明，虽然从嫩芽、枝条和叶片上都分离到了内生 真菌，但以当年生枝条的内生真菌的数量最多，从长势衰弱的林木中更容易分 离到不常见的内生真菌种类。 1 1 3 3 内生真菌的专一性 研究发现有的内生真菌可以在寄主科的水平上具有专一性，而有的内生真 菌群落可以在寄主种的水平上具有专一性，p e t r i n i 等【1 7 1 8 】通过对生长在同一地点 的欧洲赤松p i n u ss y l v e s t r i sl 和f a g u ss y l v a t i c al 的内生真菌群落分析，发现在 这两棵树上有两组明显不同的真菌群落，同样的情况也在其他的研究中发现。 c a r r o l l 研究发现在法国和瑞士的针叶树的叶柄和叶顶端上一些内生真菌种 类明显不同，因此提出了内生真菌种类具有一定组织专一性的假说【l9 1 。另外， 4 第1 章前言 一些其它研究结果却显示内生真菌几乎没有组织专一性【2 0 1 。 内生真菌的专一性是内生真菌与其宿主长期相互选择和适应的结果，它们 之间存在一定的生理机制，使得内生真菌不仅有寄主的专一性而且还有组织的 专一性，但这种专一性是相对的。 1 1 4 内生真菌次生代谢产物的多样性 植物内生真菌的多样性决定了其次生代谢产物的多样性，这些丰富的次生 代谢产物形成了一个丰富的资源库，为发现新型药物和新型农业的发展提供了 资源。开发植物内生真菌的次生代谢产物，前景非常广阔。 1 1 4 1 具有抗癌作用的次生代谢产物 植物内生真菌能够产生与其宿主形同或相似的活性成分，从具有抗癌活性 的植物出发，进行内生真菌代谢产物的研究并得到了很有价值的研究成果。目 前已经从内生真菌产物中筛选出的具有抗癌价值的活性成分紫杉醇类、鬼臼毒 素、长春新碱、球毛壳甲素、喜树碱等。 1 9 9 3 年s t r o b e l 等【2 l 】从短叶红豆杉的树皮中分离到内生真菌安德氏紫杉 霉( t a x o m y c e sa n d r e a n a e ) ，并从其发酵产物中分离出紫杉醇。l i 等【2 2 】还从红豆杉 属植物以外的落羽松中分离到2 0 多株真菌，其中有9 株可产紫杉醇，国内学者 【2 3 】从东北红豆杉( t a x u sc u s p i d a t a ) 、云南红豆杉( t a x u sy u n n a n e n s i s ) 、南方红 豆杉( t a x u sm a i r e i ) 、中国红豆杉( t a x u sc h i n e n s i s ) 等紫杉属植物分离出多株内 生真菌，并检测到其液体培养物中含有紫杉醇或紫杉醇类似物成分。 杨显志等 2 4 1 从桃儿七( s i n o p o d o p h y l l u mh e x a n d r u m ) 、南方山荷叶( d i p h y l l e i a s i n e n s i s ) 和) 1 1 ) k 角莲( d y s o s m av e r s i p e l l i s ) 等药用植物中分离到6 株内生真菌， 均能产具有抗癌作用的鬼臼毒素。 郭波等1 2 5 】从长春花中分离到多株内生真菌，其中有两株经鉴定为交链孢霉 ( a l t e r n a r i as p ) 和尖孢镰刀菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) ，并在其液体培养物中检测 到长春新碱成分的存在。杨显志等【2 6 】从长春花叶中分离出一株内生真菌9 7 c y 3 ， 属无孢菌群( m y c e l i as t e r i l i a ) ，其发酵液中长春新碱的产率约为0 2 0 5 p g l 。 张玲琪等【2 7 j 从美登木( 缅，纪玎姗h o o k e r i ) 中分离出一株内生真菌球毛壳 菌( c h a e t o m i u mg l o b o s u m ) ，可产球毛壳甲素。同时进一步说明植物内生真菌还 5 第1 章前言 可以产生与植物宿主不同的活性物质。陈贤兴等【2 8 】从喜树果实中分离到一株内 生真菌，能产生喜树碱类似物。 1 1 4 2 具有其他药用价值的次生代谢物 s r o b e l 等f 2 9 从雷公腾( t r i p t e r y g e u mw e f o r d i i ) 和锡兰肉桂( c i n n a m o m u m z e y l a n i c u m ) 中各分离出一株内生真菌，产生的活性成分对多种致病真菌有抑制作 用，w a g e n a a r 等f 3 0 】从薄荷的一株内生真菌p h o m o p s i sl o n g i c o l l a 的培养物中，分 离提取出一种新的抗生素一i c e r a i l d r o l s ，它具有很强的杀菌作用。b r a d y 等【3 1 】 从s e l a g i n e l l a p a l l e s c e n s 中分离出一株内生真菌镰刀菌( f u s a r i u ms p c r 3 7 7 ) ， 并在其培养物中分离到一种新型的酮内酯( p e n t a k e t i d e ) ，对白色念珠菌( c a n d i d a a l b i c a n s ) ：有较强的抑制作用。k u m a r 等【3 2 】从雷公藤( 乃勿胞懈f 材棚w f 勿伽访f ) 中分离 了拟盘多毛孢属( p e s t a l o t i o p s i s ) 、轮枝菌属( v e r t i c i l l i u ma l b o a t r u m ) 、枝顶孢霉 ( a c r e m o n i u ms p ) 等内生真菌，可防治人的类风湿性疾病。 邹文欣等【3 3 l 从黄花蒿( a r t e m i s i aa n n u a ) 及蒙古蒿( a r t e m i s i am o n g o l i c a ) d p 获 得一株内生真菌刺盘孢霉( g o l l e t o r i c h u ms p ) ，该菌株产生的炭疽菌酸 ( c o l l e t o t r i c h u ma c i d ) 对多种病原菌均有抑制作用。而兰琪等【3 4 】从苦皮藤( c e l a s t r u s a n g u l a t u s ) r 扣分离出多株内生真菌，其液体发酵产物和菌丝体粗提物能够抑制多 种植物病原菌菌丝的生长活性和孢子萌发。 1 1 4 3 能促进植物生长的次生代谢物 寄生在植物体内的内生真菌可以产生多种活性物质，可以增强植物对氮、 磷等元素的摄取能力，分泌植物激素如g a 3 、i a a 等活性物质促进植物的生长， 提高植物的抗逆性。 吴静萍等【3 5 】研究发现密花石斛( d e n d r o b i u md e n i f l o r u m ) 菌根菌能够产生赤 霉素( g a 3 ) 。张集慧等f 3 6 】研究发现多种兰科植物的内生真菌，能够产生赤霉素 ( g a 3 ) 、吲哚乙酸( i a a ) 、脱落酸( a b a ) 等植物生长调节剂。邹文欣等【3 3 】 从黄花蒿中分离得到一株刺盘抱( c o l l e t o t r i c h u ms p ) ，经发酵证明能产生吲哚乙 酸( i a a ) 。 1 1 5 内生真菌的分离培养方法的研究 1 1 5 1 样品的采集与处理 6 第1 章前言 采集植物样品样应及时正确的处理，以免定殖的内生真菌会很快发生变化。 通常在4 8 h 内进行处理，时间过长容易造成内生真菌的丢失。首先晾干去除表 面的湿气，把样品应保存在低温干燥环境中，然后选择透气通风较好的棉、滤 纸或纸袋( 或纸信封) 来装所采样品比较好，以免样品表面霉菌生长或凝结成团。 1 1 5 2 样品表面消毒 对植物材料进行表面消毒通常是用一种强氧化剂或一般的消毒剂按照一定 的先后顺序进行短期处理，然后用无菌水冲洗表面残留的消毒剂。表面消毒具 体方法会因研究者的喜好、宿主植物的种类以及宿主组织类型不同而不同。常 用的氧化剂有1 3 7 】：2 1 0 的n a o c i 漂白剂、3 h 2 0 2 、2 k m n 0 4 或0 0 3 过 乙酸( p e r a c e t i ca c i d ) 等；7 0 0 0 - - - 9 5 的乙醇是最常用的除湿剂，它只有部分的杀菌 活性，一般不单独用做表面消毒剂；此外还有一些不在内生菌研究中常用的消 毒剂，包括硝酸银、升汞、福尔马林、丙烯氧化物。不过，在国内0 1 或0 2 的升汞仍然是主要的植物组织表面消毒剂，常与7 0 的乙醇结合使用。 1 1 5 3 培养基、选择性分离试剂和培养条件 用于内生真菌分离鉴定的培养基有m a r t i n 琼脂培养基、p d a 培养基、察氏 琼脂培养基、麦芽汁培养基、牛肉浸汁( 血) 琼脂培养基、曲汁培养基、p f e f f e r 液 体培养基、s a b o u r a u d 琼脂培养基、玉米粉琼脂和燕麦粉琼脂培养基等【3 引。国内 外学者对植物内生真菌的研究最常用的分离培养基有p d a 培养基、察氏培养基、 马丁氏培养基、麦芽浸膏( 1 2 ) 琼脂培养基等。有时根据分离菌种的需要，会 在营养丰富的分离培养基中加入适当的选择性生长抑制剂( 见表1 2 ) p 9 1 ，用于从 植物组织中分离特定内生真菌。 7 第1 章前言 表1 2 内生真菌分离中常用的选择性分离试剂 t a b l e1 - 2s e l e c t i v ea g e n t su s e f u lf o ri s o l a t i o no fe n d o p h y t i cf u n g i 一般情况，最初分离中常使用营养贫乏的培养基，并在培养基中添加选择 性生长抑制剂和抗生素也能用来延缓和抑制某些菌的生长。生长较快的真菌应 该及时的转移出来，否则会掩盖生长缓慢的菌种生长和存在，影响分离菌种的 种类。 选择合适的培养条件对内生真菌的分离也是很关键的，根据材料的不同选 择合适的培养条件，比如地上部分的植物材料对光的需求可能要比根部的材料 要稍