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冰岛硫化叶菌中r a d a 基因的遗传学分析 摘要 同源重组修复是一类重要的针对双链d n a 分子断裂的修复方式。r e c a 蛋白和 r a d 5 1 蛋白分别是细菌和真核生物中参与d n a 同源重组修复的重要蛋白。泉古菌 s u l f o l o b u ss o l 中的蛋白是最早被分离纯化并进行生化性质研究的与 蛋白和fataricu蛋s白同源r的ad类areca r a d 5 1 似蛋白。在嗜盐古菌h a l o f e r a xv o l c a n i i 中将r a d a 基因敲除后，得到的突变体表现出生长速率下降，并且对d n a 诱变剂敏感性增加。 但是，在嗜热古菌中，由于遗传操作体系的缺乏，至今对于r a d a 基因的研究还仅限 于一些体外的生理生化性质方面，而对其在体内的遗传学分析则从未报道过。 本实验以p y r e f 和肠岱基因双缺失突变的s u l f o l o b u si s l a n d i c u se 2 3 3 s 作为研究 对象。在构建敲除载体的过程中，对位于r a d a 基因两端的d n a 分子片段进行p c r 扩增得到两段同源序列臂，分别命名为l a r m 和r a r n l 。接着利用p c r 技术扩增出 一个用a r a s 启动子替换了r a d a 基因自身启动子的d n a 分子片段，命名为t - g e n e 。 最终得到的敲除载体是在p u c l 9 载体的多克隆位点处依次插入了r a l t l l 、l a r l t l 、 矽y 旭f + l a c sm a r k e r 和t - g e n e 。将线性化的敲除载体电转化si s l a n d i c u se 2 3 3 s 后， 利用不含尿嘧啶的选择性培养基筛选线性化载体发生双交换整合到染色体上的转化 子。得到的双交换转化子经过划线纯化后，直接倒p s c v y u + 5 f o a 的双层平板进 行反筛选r a d a 基因的缺失突变体。但是经p c r 验证，平板上长出的单菌落全部是 p y r e f 基因自发突变产生的。为此，本课题又进行了反筛选富集实验，期望能够筛 选得到r a d a 基因功能互补型的缺失突变株。反筛选富集实验中得到的几株经x g a l 染色显白色的菌落经验证亦不是r a d a 基因的缺失突变株，而可能是p y r e f 和肠岱 基因的双自发突变体。这些实验结果说明r a d a 基因对于& i s l a n d i c u s 的生长是必需 的。此外，通过将r a d a 双交换转化子放在3 种不同碳源的培养基中进行培养并测定 生长曲线，我们发现r a d a 基因的表达差异对细胞的生长速率有着十分明显的影响。 本课题首次说明了r a d a 基因对于嗜热古菌s u l f o l o b u si s l a n d i c u s 的生长是一个必 需基因。但是在其他嗜热古菌中，r a d a 基因是否也是一类必需基因呢? 如果是，则 说明同源重组在嗜热古菌中的生物学功能有着十分重要的作用；如果不是，则说明 在嗜热古菌中r a d a 基因可能还有着其他方面的重要功能。 关键词：冰岛硫化叶菌；r a d a ；同源重组；基因敲除 冰岛硫化叶菌中r a d a 幕凶的遗传学分析 a b s t r a c t h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n r e p a i r i sap r i m a r ym e a n sf o rt h e r e p a i r o f d o u b l e s t r a n d e dd n ab r e a k s ( d s b s ) t h er e c aa n dr a d a r a d 51p r o t e i n sa r eo n eo ft h e m o s ti m p o r t a n tc o n t r i b u t o r st ot h ep r o c e s so fh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o ni nb a c t e r i aa n d e u c a r y ar e s p e c t i v e l ya n dt h e i ra r c h a e a li sc a l l e dr a d a t h ea r c h a e a lr a d aw a sp u r i f i e d a n ds t u d i e db i o c h e m i c a l l yf i r s tf r o mt h eh y p e r t h e r m o p h i l i cc r e n a r c h a e o t es u l f o l o b u s s o l f a t a r i c u s ar o l ef o ra na r c h a e a lr a d ap r o t e i ni nd n ar e p a i rv i ah o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o nc a m ef r o mg e n e t i ca n a l y s i si nh a l o f e r a xv o l c a n i is h o w i n gt h a td e l e t i n gt h e r a d ag e n ed e c r e a s e di t sg r o w t hr a t e ，a n di n c r e a s e di t ss e n s i t i v i t yt od n ad a m a g i n g a g e n t s h o w e v e r , d u et ot h el a c ko ft h eg e n e t i cs y s t e mf o rh y p e r t h e r m o p h i l i ca r c h a e o n , t h er e s e a r c ho fr a d ai sl i m i t e dt ot h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a ls t u d i e si nv i t r oa n d a ni nv i v oa n a l y s i so ft h er a d af u n c t i o n sh a sn e v e rb e e nc o n d u c t e d i nt h i sw o r k ，az f p y r e f z l l a c sd o u b l e - d e l e t i o nm u t a n to fs u l f o l o b u si s l a n d i c u s e 2 33sw a su s e da st h eh o s tt oc o n d u c tg e n e t i cm a n i p u l a t i o nw i t ht w om a r k e r s t o c o n s t r u c tt h ek n o c k o u tp l a s m i d ，t h ef l a n k i n gs e q u e n c e so f r a d aw e r ea m p l i f i e da n du s e d a st h eh o m o l o g o u ss e q u e n c ea r m s ，l a r ma n dr a r m t h ep r o m o t e ro fr a d aw a sr e p l a c e d b ya r a sp r o m o t e ri no r d e rt oc r e a t eat - g e n ea n t if o rh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n t h e f i n a lk n o c k o u tp l a s m i dw a sc o n s t r u c t e db yi n s e r t i n gt h ek n o c k o u tc a s s e t t eo fl a r m ， r - a r n l ，p y r e f 七t a c sm a r k e ra n dt - g e n ea r l ni r a o a ne c o l iv e c t o rp u c19 a f t e r t r a n s f o r m i n gt h e l i n e a rk n o c k o u tp l a s m i di n t o i s l a n d i c u se 2 3 3 s ，t h ec a s s e t t e r e c o m b i n e d 、析mt h eh o s tc h r o m o s o m e t h r o u g h d o u b l e c r o s s o v e r , y i e l d i n g u r a c i l p r o f i c i e n tt r a n s f o r m a n t sw h i c hf o r m e dc o l o n i e so nt h es e l e c t i v ep l a t e s t h e t r a n s f o r m a n t sw e r ep u r i f i e dv i as t r e a k i n gf o rs i n g l ec o l o n i e so nt h es e l e c t i v ep l a t e sf o r3 c o n s e c u t i v et i m e s ，t h ed e s i g n e dd e l e t i o nm u t a n t sw e r es e l e c t e db yt h ep y r e fc o u n t e r s e l e c t i o n h o w e v e r , t h ec o l o n i e sg r o w nu po nt h ec o u n t e rs e l e c t i o np l a t e sw e r ea l l i d e n t i f i e da st h es p o n t a n e o u sp y r e fm u t a n t sb yp c r t h e n ，t h em u t a n t sw e r ee n r i c h e db y i n c u b a t i o nu n d e rt h ep y r e fc o u n t e rs e l e c t i o na l l o w i n go n l yt h ed e l e t i o nm u t a n t st og r o w u pa sw h i t ec o l o n i e su p o nx g a ls t a i n i n gb e c a u s es p o n t a n e o u sm u t a t i o n sb o t hf o rp y r e f a n df o rl a c sc o u l do n l yo c c u ra tv e r yl o wr a t e ( = r - a r m l - a r mr - a r m j 嘲_ _ 图2 - 2 基因敲除原理示意图 f i g 2 - 2s c h e m a t i c i l l u s t r a t i o no f t h e m e c h a n i s mo f g e n ek n o c k o u t 冰岛硫化叶菌中r a d a 基因的遗传学分析 2 2 1 3s u l f o l o b u si s l a n d i c u s 基因组d n a 的提取 利用北京t i a n g e n 生物技术有限责任公司的基因组d n a 提取试剂盒进行 s u l f o l o b u si s l a n d i c u s 基因组d n a 的提取，具体操作步骤如下：取1m l 活化的 s u l f o l o b u si s l a n d i c u s 菌液，转接到含有5 0m lp s c v y 培养基的三角瓶中，在7 8 恒温油浴器中，1 2 0r m i n 振荡培养3 5d ；取5 m l 菌液于室温下1 0 0 0 0r m i n 离心l m i n 收集菌体；向菌体沉淀中加入2 0 0g l 缓冲液g a ，振荡至菌体彻底悬浮；向管中加 入2 0 “l 蛋白酶k 溶液，混匀；加入2 2 0l x l 缓冲液g b ，振荡1 5s e e ，7 0 放置1 0 m i n ，待溶液变清亮后简短离心以除去管盖内壁的水珠；加2 2 0g l 无水乙醇，充分 振荡混匀1 5 s e c ，简短离心除去管盖内壁的水珠；将上一步所得溶液全都加入到一个 吸附柱c b 3 中，1 2 0 0 0r m i n 离心3 0s e c ，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；向吸 附柱c b 3 中加入5 0 0 此缓冲液g d ，1 2 0 0 0r m i n 离心3 0s e c ，倒掉废液，将吸附柱 c b 3 放入收集管中；向吸附柱c b 3 中加入7 0 0 此漂洗液p w ，1 2 0 0 0r r a i n 离心3 0s e e ， 倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；向吸附柱c b 3 中加入5 0 0 此漂洗液p w ，1 2 0 0 0 r m i n 离心3 0s e c ，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；将吸附柱c b 3 放回收集管中， 直接1 2 0 0 0r m i n 离心2m i n ，倒掉废液。将吸附柱c b 3 至于室温放置数分钟，以彻 底晾干吸附材料中渗入的漂洗液；将吸附柱c b 3 转入一个干净的离心管中，向吸附 膜的中间部位悬空滴加2 0 0 儿洗脱缓冲液t e ，室温放置2 5m i n ，1 2 0 0 0r m i n 离心 2m i n ，将溶液收集到离心管中。 2 2 1 4 目的片段的p c r 扩增 在构建r a d a 基因敲除载体的过程中，为了避免l a r n l 与t - g e n e 有重复序列， 本实验在设计t - g e n e 时采用了a r a s 启动子替换r a d a 基因自身启动子的方法。对于 t - g e n e 同源臂的p c r 扩增是分两步完成：首先利用r a d a g f 2 与r a d a g r 这对引 物，以s u l f o l o b u si s l a n d i c u s 基因组d n a 为模板扩增出不含启动子区域的r a d a 基因 片段，然后将该片段插入到古菌表达载体p e x a 中a r a s 启动子的后面，最后再利用 r a d a g f 1 与r a d a g r 这对引物，以插入有r a d a 基因片段的p e x a 载体为模板扩 增出含有a r a s 启动子的r a d a 基因片段。敲除载体中的l a r m 和r a r l r l 则是分别利 用r a d a l f 与r a d a l r 和r a d a r f 与r a d a r r 这两对引物，以s u l f o l o b u si s l a n d i c u s 基因组d n a 为模板进行的p c r 扩增。本实验中涉及的所有p c r 扩增引物都是利用 p r i m e rp r i m i e r5 0 软件所设计，并且在各个引物的5 端根据需要设计了相应的酶切 位点。各引物序列及酶切位点见表2 1 所示，引物序列中下划线所示位置为相应的 酶切位点： 冰岛硫化叶菌中r a d a 皋凶的遗传学分析 表2 - 1p c r 反应引物 t a b l e2 - 1p c r p r i m e r s p c r 反应条件如下：9 5 预变性5m i n ；9 4 变性4 5s ，5 5 退火3 0s ，7 2 延伸1m i n ，3 0 个循环；7 2 延伸1 0r a i n 。p c r 反应体系见表2 2 。p c r 反应结束 后取3 “lp c r 反应混合物，在o 8 的琼脂糖凝胶中电泳检测p c r 结果。最后，利 用a x y g e n 公司的p c r 产物清洁回收试剂盒对各目的片段的p c r 产物进行清洁回 收，具体操作步骤如下：首先向p c r 反应混合物中加入3 倍体积的p c r a 溶液， 混匀后将全部混合液加入到p c r 离心吸附柱中，1 2 0 0 0r m i n 离心1m i n ；弃废液， 在离心吸附柱中加入7 0 0 此的洗脱液w 2 ，1 2 0 0 0r m i n 离心1m i n ；弃废液，再在 离心吸附柱中加入7 0 0 此的洗脱液w 2 ，1 2 0 0 0r m i n 离心1r a i n ；弃废液，将离心 吸附柱重新放回2m l 离心管中，1 2 0 0 0r m i n 离心2m i n ；最后在离心吸附柱中加入 3 0l x le l u e n t 缓冲液，将吸附柱置于一个新的的离心管中，1 2 0 0 0r m i n 离心1m i n 后 收集纯化后的p c r 产物。 表2 - 2p c r 反应体系 t a b l e2 2p c rr e a c t i o ns y s t e m 反应物体积 s u l f o l o b u si s l a n d i c u s 基因组d n a ( 3 0n g p l ) 上游引物( 2 0r t r n o l l ) 下游引物( 2 0 m o l l ) l o x p y r o b e s tb u f f e r 玳t p p y r o b e s td n a 聚合酶 d d h 2 0 1l x l 1 “l 1l x l 5p l 4 肛l o 2 5 “l 3 7 7 5 “l 1 9 冰岛硫化叶菌中r a d a 基因的遗传学分析 2 2 1 5 敲除载体的构建及酶切验证 各目的片段清洁回收的p c r 产物和质粒载体p u c l 9 根据敲除载体构建时设计 的酶切位点进行相应的酶切处理，酶切反应体系为：1 0 x b u f f e r2 9 l ，p c r 产物5 此， 相应的核酸内切酶o 5 肛l ，补水至2 0 肛l 。酶切反应时间为1 0h 1 5h 。 酶切产物利用a x y g e n 公司的p c r 产物清洁回收试剂盒进行清洁回收，方法同 上。清洁回收得到的各酶切产物按以下酶连体系进行酶连：1 0 x t 4d n a l i g a s eb u f f e r 2 肛l ，目的片段5l x l ( 2 0n g g l ) ，质粒载体1p l ( 2 0n g g l ) ，t 4d n al i g a s e1 肛l ， 补d d h 2 0 至2 0p l 。将酶连体系置于1 6 过夜。 取1 0 此酶连反应混合物到冰上预冷的1 0 0 此大肠杆菌d h 5 a 的感受态细胞中， 冰上静置3 0m i n ，然后于4 2 水浴中放置9 0s e e ，迅速将热激过的感受态细胞放回 到冰上，静置2m i n 后加入8 0 0l x l 的l b 液体培养基，混匀细胞后置于3 7 摇床上， 1 6 5r m i n 振荡孵育培养4 5m i n ，最后取2 0 0 此孵育后的细胞液在氨苄青霉素选择性 培养基上涂平板，待平板晾干后置于3 7 的培养箱中静置培养1 6h 1 8h 。待平板 上长出单菌落后，挑取5 个于含有5m l 的p a 瓶中进行培养。 利用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司的质粒提取试剂盒进行重组质粒 的抽提，具体操作步骤如下：收集3m l 菌液的沉淀于1 5m l e p p e n d o r f 离心管中， 加入1 0 0l x l 溶液1 ，振荡至彻底悬浮；加入1 5 0l x l 溶液2 ，立即轻柔颠倒离心管数 次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮，随后将离心管置于冰上2m i r a 加入 1 5 0g l 溶液3 ，立即温和颠倒离心管数次，室温放置5m i n ，1 2 0 0 0r m i n 离心1 2m i n ； 将4 2 0g l 结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后将上述离心后的上清加入离心吸附柱 中，混匀，1 2 0 0 0r m i n 离心3 0s e c ，弃掉收集管中的废液；加入7 5 0g l 漂洗液与离 心吸附柱中，静置1m i n 后，1 2 0 0 0r m i n 离心3 0s e c ，弃掉收集管中的废液，重复 一次，倒掉废液后再次于1 2 0 0 0r m i n 离心2m i n ，尽量除去漂洗缓冲液；小心取出 离心吸附柱，将其放入一个干净的1 5m le p p e n d o r f 离心管中，加入5 0 “l 洗脱缓 冲液，室温放置5m i n 后，1 2 0 0 0r m i n 离心1m i n 。 将r a l t n 通过e c o ri 和s a li 双酶切插入到p u c l 9 载体构建得到的重组质粒命 名为p t b l l ，用e c o ri 和s a li 双酶切进行酶切验证；将l a r n l 通过e c o ri 和x h oi 双酶切插入到p t b l l 载体构建得到的重组质粒命名为p t b l 2 ，用e c o ri 和s a li 双 酶切进行酶切验证；将p y r e f 和l a c s 基因通过n fi 和s a li 双酶切插入到p t b l 2 载体构建得到的重组质粒命名为p t b l 3 ，用n 如i 双酶切进行酶切验证；将带有a r a s 冰岛硫化叶菌中r a d a 基凶的遗传学分析 启动子的r a d a 基因通过a fi 和s p hi 双酶切插入到p t b l 3 载体构建得到的重组质 粒命名为p t b l 4 ，用m l ui 和s p hi 双酶切进行酶切验证。 2 2 2 敲除载体的线性化及电转化& i s l a n d i c u se 2 3 3 s 2 2 2 1 敲除载体的线性化 将构建好的r a d a 敲除载体用s p hi 酶切进行线性化处理，酶切反应体系为：2 0 p l 的p t b l 4 ( 3 2 0n g i _ t l ) ，4g l1 0 x b u f f e r , 1 5g ls p hi ，1 4 5 肛ld d h 2 0 。酶切过夜 的产物通过乙醇沉淀的方法进行线性化载体的纯化回收，具体操作步骤如下：在酶 切反应体系中加入1 1 0 倍体积的3m 的醋酸钠溶液( p h5 2 ) 和2 5 倍体积的无水 乙醇，轻轻混匀后稍微离心并将其置于2 0 放置1h 以上；接着在4 下1 3 0 0 0r m i n 离心3 0m i n ，小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；加入5 0 0 “l7 0 的乙醇， 轻轻颠倒几次洗涤沉淀；再于4 下1 3 0 0 0r m i n 离心5m i n ，小心移去上清，将此 e p p e n d o r f 管置于空气中直至无乙醇气味；最后用2 0 “ld d h 2 0 重新溶解沉淀，4 。c 短期保存，2 0 长期保存备用。 2 2 2 2 & i s l a n d i c u se 2 3 3 s 感受态细胞的制备及电转化 感受态细胞的制备：将2m l 起始培养物接种到1 0 0m lp v c s u 培养基中，置 于7 8 振荡培养过夜，当o d 6 0 0 达到o 2 0 3 之间时停止培养，快速将培养物放入 冰水中5m i n ；接着将培养物转移到2 个5 0m l 灭过菌的离心管中，在室温下以8 0 0 0 r p m 离心1 0m i n 收集全部细胞；弃掉上清，并向每个离心管中加入2 0m l 事先预冷 的2 0m m 蔗糖溶液，轻轻重悬细胞，再用8 0 0 0r p m 离心1 0m i n 收集细胞；弃掉上 清，再向每个离心管中加入1 5m l 预冷的2 0m m 蔗糖溶液，轻轻重悬细胞，再用 8 0 0 0r p m 离心1 0m i n 收集细胞；弃掉上清，每管加入1 0m l 预冷的2 0m m 蔗糖溶 液，轻轻重悬细胞，再8 0 0 0r p m 离心1 0m i n 收集细胞；弃掉上清，用一定量预冷 的2 0m m 蔗糖溶液重悬细胞，使细胞最终的o d 6 0 0 值达到1 0 左右，最后将制备好 的感受态细胞置于室温下保存。 电转化步骤：取5 0 此感受态细胞到干净的1 5m l 离心管中，加入0 5 肛g 1 鹇 的d n a ( 体积小于5 此) ，用枪轻轻混匀后于室温孵育至少5m i n ，然后将混有外源 d n a 的感受态细胞用枪转入到相应的电转杯中，利用b i o r a dg e n ep u l s e ri i 电转仪 进行电转化，电转条件是1 2k v ，6 0 0q ，2 5r t f ，记录每次电转的时间常数；将电转 后的细胞迅速转移到含有8 0 0l x l 预热的孵育培养基中，孵育1 2h ；最后取全部细 胞铺双层平板。 2 l 冰岛硫化叶茵中r a d a 基冈的遗传学分析 2 2 3 双交换转化子的筛选、验证及纯化 2 2 3 1 双交换转化子的筛选 本实验中采用了p y r e f 和l a c s 双分子标记基因来帮助筛选转化子，p y r e f 基因 主要是控制尿嘧啶( u r a c i l ) 的合成，如果细胞缺失了p y r e f 基因或p y r e f 基因发生 了突变则不能在缺乏尿嘧啶的培养基中生长；l a c s 基因在s u l f o l o b u si s l a n d i c u s 中 编码p 糖苷酶，通过x g a l 染色，菌落或液体培养物能够显蓝色。因此，将培 养了1 0 天左右的平板取出，用2m g m l 的x - g a l 对平板上长出的单菌落进行染色， 如果菌落能够被染上蓝色，说明肠岱基因通过双交换整合到染色体上，然后挑取蓝 色单菌落转接到含有1 0m lp s c v y 液体培养基的p a 瓶中进行振荡培养。 2 2 3 2 双交换转化子的p c r 验证 经过5 7 天的培养时间后，将p a 瓶中的培养物取一部分接种到1 0 0m l 新鲜的 p s c v y 液体培养基中继续培养，剩下的培养物利用北京t i a n g e n 生物技术有限责 任公司的基因组d n a 提取试剂盒进行基因组d n a 的抽提。为了进一步验证得到的 蓝色菌落是发生了双交换的转化子，本实验设计了一对p c r 引物对抽提得到的基因 组d n a 进行扩增，通过p c r 产物的大小来判断是否为发生双交换整合的转化子。 这对验证引物中上游引物v 1 ：g g t t t g g t a g t a g c a g t t g a 位于l a r m 上游5 8b p 的地方，下游引物v 2 ：g a a a l _ r a g t c c t c c a c c t c c 位于r a r n l 下游6 6b p 的地方。 2 2 3 3 双交换转化子的纯化 将经过p c r 验证正确的双交换转化子在p s c v y 的平板上进行划线培养，待长 出单菌落后再用x g a l 进行染色，挑取蓝色的单菌落于含有1 0m lp s c v y 液体培养 基的p a 瓶中进行振荡培养，5 7 天后再进行划线培养、x g a l 染色和挑取蓝色单菌 落，如此反复地进行划线纯培养一共3 次。 2 2 4 目的基因缺失突变株的筛选 将经过3 次纯化后的双交换转化子在p s c v y 液体培养基中培养至o d 6 0 0 为o 5 左右时，取1 0 0p l 培养物与3m l 预热的p s c v y u + 5 f o a 顶层胶液体培养基混匀 后铺上层平板，待培养基于室温下晾干后置于7 5 。c 高温培养箱中进行培养。本实验 是利用5 - f o a 进行反筛选r a d a 基因的缺失突变体，因为含有完整p y r e f 基因的细 胞在含有5 - f o a 的培养基中不能生长，所以在p s c v y u + 5 f o a 固体培养基上长出 来的单菌落有两种可能：一种是两个r a n n 发生单交换形成的目的基因缺失突变体； 冰岛硫化叶菌中r a d a 基凶的遗传学分析 另一种是p y r e f 基因的自发突变。此外，因为l a c s 基因如果还存在于染色体基因组 上，那么通过x g a l 染色，菌落应该能够显蓝色，所以该实验还可以借助蓝白斑筛 选帮助我们进一步确认得到的单菌落是目的基因缺失突变体还是p y r e f 基因自发突 变体。 2 2 5r a d a 基因功能互补型缺失突变株的筛选 2 2 5 1 反筛选富集实验 本实验除了直接利用p y r e f 基因进行反筛选r a d a 基因的缺失突变体外，还进行 了反筛选富集实验，期望能够得到r a d a 基因的功能互补型缺失突变株。具体实验操 作如下：先将纯化后的双交换转化子在p s c v y 液体培养基中培养至o d 6 0 0 达到 0 3 - 4 ) 5 之间，收集1 0m l 培养物转接到新鲜的p s c v y u + 5 一f o a 液体培养基中进行 培养( u r a c i l 和5 - f o a 的终浓度分别为2 0l x g m l 和5 0i t g m l ) ，每2 4 小时进行一 次取样，测定其o d 6 0 0 及p h 。当培养物的p h 值达到或超过4 5 时，需要收集全部 菌体并转接到一瓶含有新鲜的p s c v y u + 5 f o a 液体培养基中继续进行培养，仍然 每2 4 小时进行一次取样，测定其o d 6 0 0 及p h 。反筛选富集实验如此反复共进行了3 轮，直到细胞的o d 6 0 0 值达到1 o 以上，此时停止培养，并取1m l 培养物做5 个梯 度稀释( 1 0 0 1 0 4 ) ，在各稀释梯度下取1 0 0w e 培养物与3m l 含有p s c v y u + 5 f o a 的上层胶混合倒上层平板，待平板于室温晾干后，置于7 5 高温培养箱中进行培养 直至长出单菌落。 2 2 5 2p c r 验证及r a d a 基因的半定量分析 为了验证反筛选富集实验中通过x g a l 染色得到的白色菌落是否为目的基因缺 失突变体，本实验对其基因组d n a 进行了p c r 验证和r a d a 基因的半定量分析。首 先，将得到的白色菌落培养到o d 6 0 0 为o 5 左右时提取基因组d n a ，然后分别用验 证引物v 1 和v 2 以及r a d a 基因内部设计的一对引物p 1 和p 2 ( 引物序列分别为： p1 ：aaa ag g a g c g a a t g a a t g t i a 和p 2 ：t a t g a c c a c c t a c t g c t a c g g ) 进行 p c r 验证，p c r 产物用0 8 的琼脂糖凝胶电泳进行检测。 对r a d a 基因进行的半定量分析是将白色菌落的基因组d n a 与宿主菌s u l f o l o b u s i s l a n d i c u se 2 3 3 s 的基因组d n a 做相同的1 0 个浓度稀释，依次为1 0n g g l ，5n g g l ，2 n g i t l ，1n g i _ t l ，0 5n g g l ，0 2n g i t l ，0 1n g i x l ，0 0 5n g i _ t l ，o 0 2n g i t l ，0 0 1n g “l 。然 后利用r a d a 基因内部设计的一对扩增引物p 1 和p 2 分别对两组稀释基因组d n a 进 行p c r 扩增，p c r 产物用o 8 的琼脂糖凝胶电泳进行检测。 冰岛。化叶茁十出阜h 们】f h 析 2 26 双交换转化于在不同碳源培养基中的培养 因为在构建r a d a 基因敲除载体的时候，我们利用a r a s 届动子替换了r a d a 基因 本身的启动子，所以本课题还将r a d a 双交换转化了分别接种到含有3 种4 ：同碳源的 培养基中进行培养，并分别测定双交换转化予在3 种碳源中的生长曲线。具体实验 操作方法如下：首先将双交换转化子在5 0 m lp s c v y 中培养至o d 为03 - - 05 之 间，然后收集争部菌体并用2 0m l 孵育培养基重悬细胞再次离心收集葡体并坩5 m l 孵育培养基重悬细胞，分别砒1m l 的浓缩培养物转接到3 瓶含有小同碳源的】0 0 m l 培养摹中进行培养，待细胞混匀后取l m l 培养物进行初始o d 6 0 0 的测定，此后 每2 4h 对3 瓶培养物进行一次取样测定o d 6 0 0 值。作为对照试验，鼬帕l o b u s i s l a n d i c u s e 2 3 3 s 也利用同样的与法在3 种不同碳源的培养基中进行培养，并测定了生i 乇曲线。 3 结果与分析 3 1 用于构建敲除载体的目的片段的p c r 扩增 利用p c r 扩增小禽启动子部分的r a d a 基罔片段理论r 大小为9 7 5b p ，古有a r a s 启动子的r a d a 基因( t - g e n e ) 理论分子大小应该是1 0 9 7b p ，l - a i t f l 理论分了大小 应谚是1 0 3 9b p tr - a r m 理论分子大小应该为1 0 9 0b p 。各种p c r 产物的琼脂糖凝胶 电泳结果显示，p c r 产物大小与预期大小一致，如图3 1 所示。 图3 1 构建敲除载体的日的片段的p c r 护增 f i g 3 一lp c r a m p l i f i c a t i o no f g e n e f r a g m e n t s f o r k n o c k o u tp l a s m i dc o n s t r u c t i o n 1 ：t - g e n e w i t h o u t a r o s ；2 ：t - g e n e w i t ha r a s ；3 l - 4r - 一m ：d l 2 0 0 0 m a r k e r 2 4 冰岛日。化曲中r a d a * 目的遗传学h 析 32 敲除载体的酶切验证 用d ri 和s a l 】双酶切重组质粒p t b l l ，理论上应得到两条酶b u 条带，大小 分别为2 6 5 3b p 和1 0 7 8b p 。凝胶电泳结果显示酶切结果与预期分析的致如图3 2 a 所示：用e c o ri 和s a l1 双酶切p t b l 2 重组质粒，理论上应得到嘣条酶切条带，大 小分别为2 6 5 3b 口和2 1 1 7b p ，凝胶电泳结果显示酶切结果与预期分析结果一致，如 图3 2 b 所示；用m l ui 和s p hi 双酶切p t b l 3 重组质粒，理论上应得到两条酶切条 带，大小分别为4 7 4 2b p 和1 0 9 4b p ，凝胶电泳结果显示酶切结果与预期分析结果一 致，如图3 2 c 所示；将p y r e f 和l a c s 基因插入到p t b l 3 载体构建得到的重组质粒 命名为p t b l 4 ，用n d ai 单酶切进行酶切验证，理论上应得到四条酶切条带，大小 分别为4 0 4 8 b p 、3 4 0 4h d 、1 6 8 3b p 和4 2 9 b p ，凝胶电泳结果鼎示酶切结果与预期分 析结果一致，如图3 - 2 d 所示。 c f d b 图3 - 2 载体的酶切验证 f i g 3 - 2 r e s t r i c t i o na n a l y s i s o f v e c t o r s a ：p t b nd i g e s t e db y e e o r ia n d s a l l b ：p t b l 2d i g e s t e db y e c o r ia n d s a l c ：p t b l 3d i g e s t e db y m u ia n d 印 i ，d ：p t b l 4d i g e s t e db y n d e i 冰岛矾n 自中r a d 3 幕目的遗传学讣* 3 3 双交换转化子的p c r 验证 线性化的重组质粒p t b l 4 转化sn l a n d i c u se 2 3 3 s 感受态细胞，在不台尿嘧啶的 平板卜k h 的单菌落中用x - 鲫染色，挑取2 个染色显蓝色的转化予接种到1 0m l 液体培养摹中进行培养。培养5 7 天后，取一部分接种到1 0 0 m l 新鲜的p s c v y 液 体培养基中继续培养，剩下的培养物利用北京t i a n g e n 生物技术有限责任公司的 基因组d n a 提取试剂盒进行基吲组d n a 的抽提。然后分别以2 株转化于基因组 d n a 和si s l a n d i c u se 2 3 3 s 基因组d n a 为模板，利用验证引物v 1 和v 2 进行p c r 扩增。理论上，以2 株转化子基因组d n a 为模板进行的p c r 扩增能够得到2 种大 小的p c r 产物，分别为7 9k b 和2 2k b ，而以矗n l a n d i c u se 2 3 3 s 基因组d n a 为模 板进行的p c r 扩增仅能得到1 种大小为31 8k b 的p c r 产物，凝胶电泳结果显示， p c r 扩增结果与预期的一致，| 兑明这两株转化子都是l - a r m 和t - g e n e 发生敢交换整 合得到的，以下就称之为双交换转化子，琼脂糖凝胶l 乜泳结果如图3 - 3 所示。 12c k 图3 - 3r a d a 转化子的p c r 验证 f i g 3 - 3 p c r v e r i f i c a t i o no f a d z t r a n s f o r m a n t s m ：1k b m a r k e r ；1 - - 2 ：m t r a n s f o r m a n t s ；c k ：i i s l a n d t c u s e 2 3 3 s 因为l - a r m 与t - g e n e 与基因组上的同源序列发生双交换，使得敲除载体上的 r a r m 和p 橱+ l a c s 一起被整合染色体基因组上，所咀利用v 1 和v 2 这对引物进 行的p c r 扩增，肯定能够得到一个全长为7 9 k b 的p c r 产物，这其中包括了l - a r m 、 r - a r m 、础r e f _ a c s 、t - g e n e 和基因组上原本的一个r - a n n 。然而，正是因为此时的 基因组上有两个同源的r a r m ，所以再进行一次单交换，也即将p y r e f + l a c s 基困和 目的基因从染色体上缺失掉，得到的p c r 产物大小就应该是22k b 左右。虽然这样 冰岛硫化叶菌中r a d a 基冈的遗传学分析 形成的突变体在不含尿嘧啶的培养基中不能生长，但在提取的细胞基因组d n a 中 却存在着这种d n a 分子结构，所以p c r 扩增应该是能够得到两种大小的p c r 产物。 3 4 目的基因缺失突变株的筛选 将上述验证正确的r a d a 双交换转化子经过3 次的纯化后培养至o d 6 0 0 为0 5 时， 取1 0 0g l 培养物与3m l 预热的p s c v y u + 5 f o a 顶层胶液体培养基混匀后铺上层 平板，室温下晾干后于7 5 高温培养箱中进行培养。经过1 0 天左右的培养，在 p s c v y u + 5 f o a 的平板上一共长出了9 7 个单菌落，经x g a l 染色，全部显蓝色， 这说明l a c s 基因还在染色体基因组上，因此，我们认为这些蓝色菌落应该是p y r e f 基因产生自发突变说形成的。按照1m lo d 6 0 0 为l 的s i s l a n d i c u s 培养物中含有1 1 0 9 个细胞来计算，取1 0 0 此o d 6 0 0 为o 5 左右的r a d a 双交换转化子培养物进行铺 平板，得到了9 7 个p y r e f 自发突变的突变株，其p y r e f 的自发突变率为o 2 5 1 0 由 左右，这与硫化叶菌中p y r e f 的自发突变率相吻合。因此，通过直接进行反筛选实 验我们得到的蓝色菌落全部是p y r e f 的自发突变体。 3 5 功能互补型缺失突变株的筛选 3 5 1 反筛选富集实验 为了进一步试图得到r a d a 基因的缺失突变体，我们又进行了反筛选富集实验， 期望能够得到r a d a 基因功能互补型的缺失突变体。本实验在p s c v y u + 5 f o a 的培 养基中一共进行了3 轮的反筛选富集培养，期间每2 4 小时进行一次取样测量培养物 的o d 6 0 0 及p h ，当p h 达到或超过4 5 时就收集全部的细胞，并转接到新鲜的培养 基中继续培养。3 轮反筛选富集实验的数据如表3 1 所示，整个反筛选