（生物化学与分子生物学专业论文）土壤耐cd2细菌分离、鉴定及生物吸附研究.pdf

西南交通大学硕士研究生学位论文第l 页 摘要 我国土壤重金属污染相当严重。目前全国受c d 、c r 、p b 等重金属污染的耕地面 积近2 0 0 0 万h m 2 ，约占全国耕地的1 5 。全国每年因重金属污染而减产粮食，直接经 济损失超过2 0 0 亿元。由土壤重金属污染引发的农产品安全和人体健康事件也时有发 生，成为影响人类健康和社会稳定的重要因素。土壤重金属污染问题已经引起了全世 界的关注。世界各国都非常重视污染土壤修复技术的研究，有关微生物修复技术的研 究更是备受关注。利用微生物作为治理重金属污染的吸附剂，需要筛选和获得高吸附 能力，并且兼具吸附选择性的菌株。对菌株吸附性能和机理的研究，为化学和遗传学 方法改造生物吸附剂提供了理论依据，也为工程菌的构建提供了宝贵的原料。 本研究主要是从西昌矿区土壤中分离出对c d 2 + 有高耐受和高富集作用的8 株菌株， 通过生理、生化实验，1 6 sr d n a 分子生物学技术对其进行菌种的分类鉴定。对菌株吸 附重金属c d 2 + 吸附能力做定量测定，同时测定菌株对其他金属的耐受能力。最后对筛 选所得的细菌进行质粒提取、酶切鉴定和质粒消除实验，目的对其耐受和1 及附重金属 的机理有所研究。 主要研究结果： 从四川西昌某矿区土壤中筛选得到8 株能够在液体培养基中耐c d 2 + 浓度在 4 0 0 m g l 以上，琼脂平板上耐c d 7 + 浓度为8 0 0 - - 一1 5 0 0 m g l 的细菌。 对8 株菌株进行生理、生化实验和1 6 sr d n a 鉴定，菌株确定均为恶臭假单胞 菌( p s e u d o m o n a sp u t i d a ) 。 菌株在含有少量c d ! + 条件下长势好于不含c d ! + 的条件下生长。在c d 2 + 浓度为 2 5 m g l 的培养基中培养，1 0 h 丌始进入稳定期，在而不含c d 2 + 的培养基中培 养，1 4 h 丌始进入稳定期。 8 株菌对c d 2 + 吸附能力不同，c d 5 对c d 2 + 的吸附率最高，为9 0 0 4 。吸附总 量2 7 0 m g ( 3 0 m 1 ) 。对照菌的吸附重量、吸附量和吸附率均为最低。 菌株除了对c d 2 + 有耐受性外，对p b “、z n “、c u “、n i “、m n 2 + 也有一定的 耐受能力，但普遍不高。低于对c d 7 + 的耐受性。 在8 株菌株中均提取到质粒，仍需进行进一步的研究。 关键词：c d + ，恶臭假单胞菌，生物吸附，1 6 s r d n a ，重金属 西南交通大学硕士研究生学位论文第1l 页 曼曼皇鲁皇置e 篁皇皇皇皇! ! 毫詈毫篁皇鼍詈詈詈詈詈詈置| 鼍| 置置鼍曼鼍曼曼詈皇詈皇詈曼葛i i l l i 皇量鼍詈| 舅皇置| 詈曼一 a b s t r a c t h e a v ym e t a lp o l l u t i o ni sas e r i o u sp r o b l e mi nc h i n a a tp r e s e n t ，t h ea r e ao fc u l t i v a t e d l a n dp o l l u t e db yc d ，c r , p ba n do t h e rh e a v ym e t a li sn e a r l y2 0m i l l i o nh m 2 ，a b o u t1 5 a r a b l el a n d d e c r e a s e dh a r v e s to fc r o p sb yh e a v ym e t a lp o l l u t i o nh a p p e n se a c hy e a r , t h e d i r e c te c o n o m i cl o s si sm o r et h a n2 0b i l l i o ny u a n a g r i c u l t u r a ls a f e t ya n dh e a l t he v e n t s c a u s e db yt h eh e a v ym e t a lp o l l u t i o no f t e no c c u r , i th a sb e c o m et h em o s ti m p o r t a n tf a c t o ro f h u m a nh e a l t ha n dt h es o c i a ls t a b i l i t y h e a v ym e t a lp o l l u t i o nh a sb e e nt h ew o r l d w i d ec o n c e r n e v e r yc o u n t r ya t t a c hg r e a ti m p o r t a n c et os t u d yc o n t a m i n a t e ds o i lr e m e d i a t i o na n dm i c r o b i a l r e m e d i a t i o nh a sb e e nt a k e nm o r en o t i c e t h e r ei sg r e a tn e e dt os c r e e na n df i n dm i c r o b i a l s t r a i n sw i t hh i g ha d s o r p t i o nc a p a c i t ya n ds e l e c t i v ea d s o r p t i o nf o rm i c r o b i a l a d s o r b e n t d e v e l o p m e n tf o rc o n t r o l l i n gh e a v ym e t a lp o l l u t i o nt h es t u d yo na b i l i t ya n dm e c h a n i s mo f a d s o r p t i o np r o v i d e si m p o r t a n tt h e o r ye v i d e n c ef o rt h ec h e m i c a la n dg e n e t i cm a n i p u l a t i o n so f b i o l o g i c a la d s o r b e n t ，a sw e l lm a t e r i a l sf o rt h ec o n s t r u c t i o no fe n g i n e e r e dm i c r o b e s 8h i g ht o l e r a n c ea n dh i g ha c c u m u l a t i o nb a c t e r i a ls t r a i n sw a ss c r e e n e da n di s o l a t e d f r o mt h es o i l so fm i n e si nx i c h a n g , s i c h u a np r o v i n c e ，i na d d i t i o nt ou s i n gp h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lm e t h o d s ，16 sr d n am o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n i q u e sh a db e e nu s e dt oi d e n t i f yt h e c l a s s i f i c a t i o na n ds t r a i n so fb a c t e r i a q u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fa d s o r p t i o no ft h es t r a i n sf o r h e a v ym e t a l sc d “h a db e e nd o n e ，a sw e l lt h ed e t e r m i n a t i o no ft h et o l e r a n c et oo t h e rh e a v y m e t a l s f i n a l l y , p l a s m i dp r e p a r a t i o n ，r e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o na n dp l a s m i de l i m i n a t i o n e x p e r i m e n t sw a su s e dt os t u d yt h et o l e r a n c ea n da d s o r p t i o nm e c h a n i s mo fh e a v ym e t a l sb y t h e s ec d “r e s i s t a n ts t r a i n s m a i nr e s u l t s ： 1 t h e8s c r e e n e ds t r a i n sw a sa b l et og r o wa tc d 2 + c o n c e n t r a t i o no fa b o v e4 0 0 m g li n l i q u i dn u t r i e n tm e d i u ma n d8 0 0 12 0 0 m g lo na g a rp l a t e 2 t h e8s t r a i n sh a da l lb e e ni d e n t i f i e dt ob ep s e u d o m o n a s p u t i d a 3 t h es t r a i n sc o u l dg r o ww e l la tl o wc o n c e n t r a t i o no fc d “s t a t i o n a r yp h a s es t a r t so n 1 0 ho n2 5 m g lo fc d 2 + a n d1 4 ho n0 r n g lo fc d “ 4 t h e8s t r a i n sh a dd i f f e r e n ta d s o r p t i o na b i l i t i e so nc d “c d 5w a st h eh i g h e s tw i t h a d s o r p t i o nr a t eo f9 0 0 4 a n da d s o r b a n c eo f2 7 0 m g ( 3 0 m 1 ) t h ec o n t o ls t r a i n sw a st h e 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 ii 页 l o w e s t 5 t h es t r a i n sw a sa l s ot o l e r a n tf o rp b 2 + 、z n 2 + 、c u 2 + 、n i 2 + 、m n 2 + h o w e v e rl o w e rt h a n c d “ 6 p l a s m i dc o u l db ee x t r a c t e df r o ma l lt h e8s t r a i n s ，t h ef u r t h e rs t u d yw a sn e e d e d k e yw o r d s ：c d 2 + ；p s e u d o m o n a sp u t i d a ；b i o s o r p t i o n ；1 6 s r d n a ；h e a v ym e t a l 西南交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权西南交通大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数掘库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 保密口，在年解密后适用本授权书： 2 不保密使用本授权书。 ( 请在以上方框内打“、”) 学位论文储繇缓生 只期： 。气9 指导老师签名： 只期：私辔b 咖。 西南交通大学硕士学位论文主要工作( 贡献) 声明 本人在学位论文中所做的主要工作或贡献如下： 1 从西昌矿区土壤中筛选出8 株对重金属c d 2 + 有高耐受性的菌株。分别可在c d 。2 + 浓度为8 0 0 、1 0 0 0 、1 5 0 0 m g l 的l b 固体培养基上生长。 2 通过生理生化实验测定以及1 6 sr d n a 分子生物学技术对8 株高耐c d 2 + 的菌株进 行菌种分类鉴定。结论得出8 株菌株均为恶臭假单胞菌。 3 利用a a s 原子吸收方法对高耐c d 2 + 菌株的金属吸附能力进行定量测定，8 株菌 株对c d + 的吸附性均较高。其中菌株c d 5 吸附率达到9 0 。 4 在8 株高耐c d 2 + 的菌株中均提取到了质粒，为进一步的细菌耐受重金属的机理 研究提供了重要基础。 本研究所筛选获得的重会属c d 2 + 高耐受和高富集的恶臭假单胞菌，可望作为环境 重金属污染的细菌生物吸附剂，同时也可为工程菌的改造提供宝贵的材料。 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师指导下独立进行研究工作所得的成 果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰 写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明。 本人完全了解违反上述声明所引起的一切法律责任将由本人承担。 学位论文作者签名： 气救 纫吆夕 r 期：如f 口。6 、钐 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 第1 章绪论 1 1 课题的研究背景和目的 1 1 1 课题研究背景 金属c d 在自然界中与z n 大量共存在各种天然矿藏中，其污染主要是由于矿业开 采和磷酸盐的化肥开发与使用造成的。目前农业中采用的c d 磷酸盐施肥以及工业中 c d 的开采和使用，将c d 从自然环境中纯化出来，并通过农业和工业的废水进入人类 的生存环境中。重金属由于在土壤中移动性差，而且很难被自然降解，造成土壤质量 下降，水环境恶化。长期滞留在土壤中的后果就是被植物吸收，通过食物链的积累损 害人类健康i 。c d 是公认的三大有毒会属之一，c d 在自然界中以化合物形式存在，其 中有毒的化合物种类繁多，例如c d s ，c d c l 2 ，c d ( o h ) 2 ，( c h 3 c o o ) 2 c d 3 h 2 0 ， 3 c d s 0 4 8 h 2 0 ，c d ( n 0 3 ) 2 4 h 2 0 ，c 2 c d n 2 ，c d b r 2 ，c d l 2 ，c d s e 等。而大多数的c d 化 合物都溶于水，这使得金属c d 可以非常容易混入人的吸收途径从而对人体造成危害1 2 j 。 由于c d 并不是人体需要的元素，而摄入定量或者过量的c d 金属对身体损害很大：低 剂量的c d 可以引起。肾衰竭、骨矿密度降低、钙排泄增加及生殖等毒性，高剂量的c d 可引起肾、肺、肝、骨、生殖效应及癌症等严重疾病1 3 j 。首次的临床c d 中毒报道见1 8 5 8 年一接触碳酸c d 粉末的工人出现急性的肠胃和呼吸症状i 训，a l s b e r g 和s c h w a r t z e 通过 对动物的药代动力学实验确定了多种c d 中毒的临床特征，并报道了不同脊椎动物如鸟 类和狗的c d 中毒后形态变化，p r o d a n 将猫暴露在c d 毒性气体中2 4 小时后发现猫的 肝、肺和肾中均出现严重的损伤。类似的症状在后面的研究中不被发现。1 9 4 0 年报道 食物和饮水中的c d 中毒，导致中毒者出现急性的肠胃症状，f r i b e r g 于1 9 4 8 年详细的 报道了c d 重污染环境中工人出现的中毒症状，报告中详细的描述了尿蛋白和肺气肿症 状特征，其在后期的研究中将兔子暴露在c d 毒性化合物气体和金属粉尘中发现了动物 体内出现严重的肺气肿和尿道炎，通过每天注射放射性的c d 硫酸盐发现，在2 个月的 时间中仅有微量的c d 被自然排泄出体外，同时蛋白尿症状在此期i 日j 增长了5 0 倍。r 本典型的痛痛病就是由于c d 金属中毒引起的一种骨疼病，x 光扫描发现患者的长骨具 有明显的骨软化特征而其他部位的骨头如脊柱等也有问题，生物化学方法检测出骨软 化会导致血清中碱性磷酸酶和c d 磷酸盐浓度增加。如此可见金属c d 对人体具有非常 严重的危害，必须对c d 污染进行治理。 重会属污染的危害越来越得到世界各国的重视，目前治理主要可分为三类：工程治 理、物耻化学治理和尘物治王里l5 1 。工程处理本质足将重金属集中起来，或将其从一个介 质转移到另一介质，稀释或者固化。通过客土、换土和深耕翻上与污土混合，可以降 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 页 低土壤中重金属的浓度，减少重金属对动植物产生的毒害峄l 。工程处理重金属可以缓解 污染并在短时问内降低重金属污染的危害，但是并没有减少在土壤中重金属的总量， 属于治标不治本，即使经过治理但仍然具有潜在的危害，而且工程处理工程量非常大、 处理费用也很昂贵1 7 1 。另外处理后的土壤土质和肥力容易下降，并且很容易受p h 值等 环境因素的影响导致残留的重金属活性增大。所以并不是一种经济，高效，永久性的 处理方法【8 1 。 美国是最早进行化学物理治理重金属污染并成功产业化的国家，早期的方法都要 用到螫合剂，通过添加合成的螯合剂如e d t a 可以增加重金属的溶解度和生物利用度。 螫合剂的分子结构能与特定的重金属形成多种配位键提高重金属在土壤中液相浓度从 而增强其流动性1 9 j 。由于有些金属离子能与土壤形成很强的键，因此必须使用如e d t a 钠盐这样的强力螫合剂，然而这样的处理方法不仅需要大量昂贵的化学螯合剂以及设 备，而且对技术的要求很高。经物理化学治理后也很容易产生化学污染，从而问接的 影响地下水和土壤的质量。例如土壤中铁和钙元素在喷洒e d t a 后由于其在土壤中的浓 度要远远高于目标重金属，使之很容易与e d t a 结合从而越弱螫合剂结合重会属的作用 。据报道e d t a 使用后螯合剂对土壤中c u 、p b 和z n 的结合量要远远大于植物在土壤 中的吸收量，这使螫合剂的使用得不偿失。因此采用对环境有毒，选择性不高而且昂 贵的物理化学处理方法不如考虑更为环保经济措施，这样可以避免采用的螯合剂对人 体造成新的损害1 1 1 j 。 由于化学和物理在重会属的实际处理中存在种种的缺点，绿色的生物治理也越来 越多的被人们采用。动物治理方面主要是利川蚯蚓，蚯蚓是重要的土壤有机生物之一， 在提高土壤质量方面具有不可替代的地位。它们通过进食、挖洞、排泄以及新陈代谢 等作用使得土质和营养成分都得到提高。带有c o o h 和c o 等官能团化学物质的产生 和析出有利于酸化土壤并激活种重金属，几种胶状物质能软化土壤并与重金属离子发 生螫合作用。然而相对微生物来说由于其针对性较弱作用面较小，其处理金属离子的 效果既不显著也不稳定。根据b a k e r 等人的研究，经过蚯蚓在土壤中的活动后p h 值降 低了o 7 0 9 ，如果土壤是酸性的红土p h 值仅降低0 0 3 0 1 8 ，而砂土经过处理后其p h 的降低幅度很大1 1 2 l 。这样来说蚯蚓对土壤中金属的效果过于依赖土壤的条件，而不能 对其中的重会属进行迅速而彻底的清除。 植物修复是通过植物吸收累积某种重金属，利用植物以及相关的微生物共存体系 作用来清理土壤中重金属的方法。根据其作用机理可以将植物修复分三类：植物吸收、 植物挥发和植物稳定。植物的吸收是通过特定的植物吸收对应的重会属减少土壤的重 金属含量从币j 达到重金属的去除和回收；植物的稳定利用特殊植物将重金属钝化一般 是络合螫合等作用，降低其生物利用性及流动性，使其不能为其他的植物所利用。可通 过植物的根内部的吸收和富集、根表嘶的吸附、根附近土壤中钝化沉淀三种方式进行， 西南交通大学硕士研究生学位论文第3 页 无论何种方法都是通过激活或者降低土壤中重会属来实现。植物对重金属的作用有以 下几个方面：与重会属发生螫合作用，形成重金属螯合物分子；植物根部通过专性原 生质膜结合重金属，使之发生还原反应；根部释放质子来酸化土壤激活重金属。现在 使用最为广泛的植物超富集吸附就是植物能通过土壤的中的根系对重金属产生富集 作，几种特殊的质子从根部放出使得土壤酸化，激活重金属并提高其生物吸收的活性 【1 3 l 。整个作用过程最关键有三个因素：a 传递蛋白，带有特殊结合位点的蛋白质能将金 属离子从胞外转移到包内，l a s a t 发现一种植物中的z n 转移蛋白能特异吸附z n 离子将其 转移到细胞内【1 4 】。b 生物螯合剂，作用机理同螯合剂e d t a ，有些植物能排放出物质与 重金属产生螯合作用。c 有机酸，同生物螫合剂几种植物产生的有机酸能加速根部对重 金属的吸收作用。 微生物虽然不能直接的降解和破坏重金属，但微生物种类繁多具有多种特异的生 物活性和生物功能：如细胞代谢、表面生物大分子吸收转运、生物吸附、空泡吞饮、 沉淀和氧化还原反应等，这些功能能针对不同的重金属化学或物理特性与重金属发生 反应，影响重会属形态改变其在环境中的迁移与转化方式达到除去蕈金属的作用【i 副。 真菌如曲霉、毛霉、青霉、根霉等对重金属都具有良好的吸附作用i l 引。一些藻类如动 胶菌、蓝细菌、硫酸还原菌等，能够在胞外产生聚合物与重金属离子形成络合物，使 重金属失去活性1 1 7 j 。细菌如氧化硫硫杆菌、硫酸盐还原菌、恶臭假单胞菌、铜绿假单 胞莴等对重金属都有很好的吸附作用，表1 1 列出了一些细菌对不同金属的吸附能力。 微生物在修复被重金属污染的土壤方面具有独特作用例如微生物可以改变根部周围的 微环境，根据不同的机理提高植物对重金属的吸收，挥发或固定效率i l 引。不同微生物活性 及机理不同使得微生物治理重金属手段灵活多变，工程菌的改造更为此类方法提供了 产业化的前景。 化学物理治理和动植物治理在除去重金属上均有着各自的不足，化学物理治理成 本过高且容易形成二次污染、动植物治理受制与环境的条件而且周期长治理也不彻底。 相比较而占微生物治理不但能达到较好的效果而且克服了化学物理治理和动植物治理 的不足，具有很好的前景。 表1 - 1 对金属有吸附作川的细菌 t a b l e l 1b a c t e r i a lb i o m a s su s e df o rm e t a lr e m o v a l 微生物金属 吸附能力( m g g ) 参考文献 p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n s t h ，u 1 5 ，6 t s e z o sa n dv o l e s k y ( 1 9 8 1 ) 1 1 9 i p s e u d o m o n a ss p un ap o n sa n df u s t e ( 19 9 3 ) 1 2 0 i o c h r o b a c t r u ma n t h r o p i c r , c d c u n ao z d e m i re la 1 ( 2 0 0 3 ) 1 2 1 l t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n sz n8 2b a i l l e te ta 1 ( 1 9 9 8 ) 1 2 2 1 c rn a c e l a y ae ta i ( 2 0 0 0 ) f 1 西南交通大学硕士研究生学位论文第4 页 微生物 金属 r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s c d ，z n o c i m u mb a s i l i c i u m c r s p h i n g o m o n a sp a u c i m o b i l i s c d b a c i l l u sf i r m u s p b ，c u ，z n b c o a g u l a n sc r ( v 1 ) b m e g a t e r i u mc r ( v i ) z o o g l o e ar a m i g e r ac r ( v 1 ) c u ， s t r e p t o m y c e sn o u r s e i c d ，c u ，n i p b ，z n ，a g ， c r p b 吸附能力( r a g g ) n a n a n a 4 6 7 ，3 8 1 ，4 1 8 3 9 9 3 0 7 2 2 9 3 4 ，9 ，0 8 3 6 ，1 6 ，3 8 1 8 ，5 5 参考文献 p l e t t ee ta 1 ( 1 9 9 6 ) 2 4 i m e l oa n dd s o u z a ( 2 0 0 4 ) 1 2 5 1 t a n g a r o m s u ke ta 1 ( 2 0 0 2 ) 1 2 6 1 s a l e h i z a d e he ta 1 ( 2 0 0 3 ) 2 7 1 s r i n a t he ta 1 ( 2 0 0 2 ) 1 2 8 i s r i n a t he ta 1 ( 2 0 0 2 ) n o u r b a k h s he ta 1 ( 1 9 9 4 ) 1 剀 a k s ue ta 1 ( 1 9 9 2 ) 3 0 i m a t t u s c h k aa n ds t r a u b e 3 1 1 m a t t u s c h k aa n ds t r a u b e ( 19 9 3 ) m a t t u s c h k aa n ds t r a u b e ( 1 9 9 3 ) s 1 0 n g w o o d e n s i s p b ，u1 0 0 ，4 4 0 f r i i sa n dm y e r s k e i t h l 3 2 l s r i m o s u s z n3 0m a m e r ie ta 1 ( 19 9 9 ) 1 3 3 1 1 1 2 课题研究目的 从西昌矿区周边土壤中采集土样，筛选高耐c d l + 细菌，利用原子吸收分光光度法 测定耐c d 2 + 菌株的c d 2 + 吸附能力，对筛选得到的细茼通过生理生化实验以及1 6 s r d n a 的方法鉴定菌种种属分类地位。通过对筛选出的耐受菌进行质粒提取，以及质粒消除 实验，目的明确其耐c d 2 + 机理。期望得到若干株c d n 高耐受、高富集细菌，以用于环 境重会属污染治理以及工程菌的构建等，并为进一步的基凶工程改造提供理论依据。 1 2 课题的研究内容和意义 1 2 1 课题研究内容 本研究通过c d 2 + 浓度梯度培养基，从西昌矿区土壤中筛选得到对c d 2 + 高耐受的菌 株。利用生理、生化试验检验和1 6 s r d n a 分子生物学方法鉴定菌株的种属。并利用原 子i 吸收分光光度计测定其对c d 2 + 的吸附能力。检测微生物是否还有耐c d 2 + 质粒，并通 过质粒消除实验确定质粒对该微生物耐c d 2 + 性的影响。本研究为构建基因工程菌提供 宿主菌，生物吸附剂工业化发展提供了材料和理论依据。主要研究内容包括：高耐c d 2 + 细菌的筛选，生理生化鉴定，1 6 s r d n a 鉴定，对c d 2 + 吸附性的定量测定，质粒提取、 酶切、消除，初步确定耐c d 2 + 机理等。 西南交通大学硕士研究生学位论文第5 页 1 2 2 课题研究意义 随着世界各国城市发展以及对各种工业化产品的需求增加导致矿产开发、污染类工 业快速扩张以及农业生产中采用的化肥等化学品种类和数量的增加，重金属污染r 益 严峻，特别是通过各种渠道进入土壤后，为人类社会造成了巨大的危害和隐患。本研 究从西昌矿区周边的土壤中筛选出了具有对c d 2 + 高耐受、高富集的菌株，能为今后构 建特定和高效的基因工程微生物奠定良好基础，为利用微生物进行c d 2 + 污染的修复奠 定基础。 1 3 论文主要内容和组织 本文分为三章，按如下的结构组织 第一章为绪论，介绍了论文的研究背景、研究目的和论文的主要内容以及重金属 污染治理的国内外研究现状。 第二、三章分别为重金属c d 2 + 高耐受细菌的分离和筛选、生理生化鉴定和1 6 s r d n a 鉴定，以及重金属吸附能力的定量和定性检测。对菌株质粒的提取、消除实验以及酶 切鉴定。并对结果进行分析与讨论，得出初步结论。 西南交通大学硕士研究生学位论文第6 页 第2 章土壤耐c d 2 + 细菌分离、鉴定及吸附研究 2 1 实验材料 2 1 1 主要仪器 超低温( 7 0 ) 冰箱：基因公司 普通冰箱：海尔公司 w p 7 0 0 ( 2 1 ) 型微波炉：g a l a n z 公司 d 3 5 2 0 中型低温离心机：k e n d r o 公司 大型低温离心机：h i m a cc r2 2 gh i g h - s p e e dr e f r i g e r a t e dc e n t r i f u g e ，日本 东芝株式会社出品 d n p 9 0 8 2 型恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司 z d p 1 5 0 型恒温摇床：上海精宏实验设备有限公司 s i m f 1 2 4 型制冰机：s a n y o 公司 h h s 4 型数显恒温水浴锅：江苏金坛金城田胜实验仪器厂 d s x 2 8 0 a 不锈钢手提式灭菌锅：上海申安医疗器械厂 e p p e n d o r f 移液器：f i n n p i p e t t e 公司 d y c 3 1 a 型琼脂糖凝胶电泳仪：北京市六一仪器厂 凝胶成像系统( b i oi m a g i n gs y s t e m ) ：基因公司 s w - c j 2 f 型洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司 0 2 m l p c r 管、1 5 m l e p 管、l m l 蓝色枪头、2 0 0 d 黄色枪头、1 吮l 白色枪 头，均无r n a 酶：购自a x y g e n 电子天平：成都倍赛克仪器仪表研究所 p c r 仪：b i o r a d 分光广度仪：型号7 3 1 型，上海精密 2 1 2 主要试剂 蜡状芽孢杆菌：购自微生物菌种保藏中心 p c r 引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 测序由上海生物工程技术服务有限公司完成 酵母提取物( y e a s te x t r a c t ) 、胰蛋白胨( t r y t o n e ) ：购自o x i o d 公司 t r i sb a s e ：购自s i g m a 公司 限制性内切晦：购自t a k a r a 公司 西南交通大学硕士研究生学位论文 第7 页 t a q 酶、d n t p ：购自t a k a r a 公司 质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒：购自o m e g a g o l d v i e w 、g r e e n v i e w 核酸染料：购自赛百盛基因技术有限公司 其他所用化学试剂为国产分析纯 2 1 3 主要试剂配制 l b 液体培养基( 1 l ) ： 蛋白胨1 0 0 9 、酵母提取物5 0 9 、n a c i1 0 0 9 ，溶于8 0 0 m l 超纯水中，定 容至1 0 0 0 m l ，用n a o h 调p h 至7 0 ，高压蒸汽灭菌，4 c 保存。 l b 固体培养基( 1 l ) - 蛋白胨1 0 o g 、酵母提取物5 o g 、n a c i1 0 o g ，溶于8 0 0 m l 超纯水中，定 容至1 0 0 0 m l ，用n a o h 调p h 至7 0 ，分装成1 0 0 m l ，每1 0 0 m l 添加1 5 9 琼脂粉，高压蒸汽灭菌，4 。c 保存。 牛肉膏蛋白胨培养基 蛋白胨1 0 0 、牛肉膏3 0 9 、n a c i5 0 9 ，溶于8 0 0 m l 超纯水中，定容至 1 0 0 0 m l ，用n a o h 调p h 至7 0 ，高压蒸气灭菌，4 。c 保存。 硝酸盐还原培养基 蛋白胨1 0 0 9 、n a c l5 o g 、k n 0 31 - 2 9 、溶于8 0 0 m l 超纯水中，定容至1 0 0 0 m l ， 用n a o h 调p h 至7 4 ，高压蒸气灭菌，4 。c 保存。 n i 2 + 储存液( 1 0 9 l ) ： 称敢n i s 0 4 6 h ：o4 4 7 9 9 ，溶于8 0 m l 超t , e t g e e ，定容至1 0 0 m l ，过滤除菌， 室温保存。 c u 2 + 储存液( r a g l ) - 称取c u s 0 4 5 h ：o3 9 2 9 9 ，溶于8 0 m l 超纯水中，定容至1 0 0 m l ，过滤除菌， 室温保存。 z n 2 + 储存 液0 0 9 l ) ： 称取z n s 0 4 6 h 2 04 3 9 8 9 ，溶于8 0 m l 超纯水中，定容至1 0 0 m l ，过滤除菌， 室温保存。 m n + 储存液( 1 0 l ) ： 称取m n c l 2 4 h 2 03 6 0 2 9 ，溶于8 0 m l 超纯水中，定容至1 0 0 m l ，过滤除菌， 室温保存。 c d 7 + 储存液( 4 0 9 l ) ： 称取3 c d s 0 4 8 h ! o9 1 2 9 9 ，溶f8 0 m l 超纯水中，定容至1 0 0 m l ，过滤除菌， 室温f 泉存。 西南交通大学硕士研究生学位论文第8 页 l b c d 2 + 平板： 蛋白胨1 0 9 、酵母提取物5 9 、n a c i1 0 9 ，溶于8 0 0 m l 超纯水中，定容至 1 0 0 0 m i ，用n a o h 调p h 至7 o ，分装成1 0 0 m l ，每1 0 0 m l 添加1 5 9 琼脂粉， 高压蒸汽灭菌，当温度降至7 0 每1 0 0 m l 加入适当体积的c d 2 + 储存液 ( 5 0 9 l ) ，使其终浓度达到目的浓度，倒平板，4 c 保存。 5 x t b e 储存液： 4 4 5 m mt r i s 碱( p h 7 5 ) 、4 4 5 m m 硼酸和1 0 m me d t a ，超纯水定容，室 温保存。 加样缓冲液( 6 x ) ： 甘油3 0 ，溴酚蓝0 1 2 ，二甲苯青蓝0 1 2 ，室温保存。 1 0 s d s ： 在9 0 m i 超纯水总溶解1 0 9 电泳级s d s ，加热至6 8 。c 助溶，加入几滴浓盐 酸调节p h 至7 2 ，定容至1 0 0 m l ，分装备用。 n a c l 溶液( 5 m o l l ) ： 称取n a c i2 9 2 2 9 ，溶于8 0 m l 超纯水中，定容至1 0 0 m l ，高压蒸汽灭菌， 室温保存。 溶菌酶( 5 0 m g f m l ) ： 称取5 0 m g 溶菌酶粉剂溶于l m l1 0 m mt r i s c l ( p h 8 0 ) ，得到5 0 m g m l 溶菌 酶溶液。 1m t r i s 碱( p h 8 0 ) ： 1 2 1 1 9 t r i s 碱溶于8 0 m l 超存水，h c i 调p h 至8 o ，超纯水定容至1 0 0 m l ， 高压蒸汽灭菌，室温保存。 0 5 me d t a ( p h 8 0 ) ： 1 8 6 1 9e d t a 溶于8 0 m l 超纯水，n a o h 调p h 至8 0 ( 约需l gn a o h 颗粒) ， 超纯水定容至1 0 0 m l ，高压蒸汽灭菌，室温保存。 t e ( p h 8 0 ) ： 1 0 m mt r i s 碱( p h 8 0 ) ，l m me d t a ( p h 8 0 ) ，超纯水定容，高压蒸汽灭菌， 室温保存。 西南交通大学硕士研究生学位论文第9 页 2 2 实验方法 2 2 1c d 2 + 高耐受菌株的筛选 2 2 1 1 耐c d 2 + 菌株的分离 1 、从四川省西昌市某矿区采取土壤样品，称取l o g 加入到1 0 0 m l 的l b 培养基中，剧 烈震荡以打散土壤。 2 、吸取上述土壤混悬液l o o p l ，在不同重金属c d 2 + 浓度的培养基平板上涂布，倒置 平板于3 0 培养箱中培养，至单菌落长出。 3 、挑选在高浓度c d “平板上长势较好的单菌落，在l o o m g lc d 2 + 的l b 平板上划 线纯化，将纯化的菌种放入4 冰箱中保存备用。 2 2 1 2 耐c d ! + 菌株的筛选 1 、从分离得到的菌种平板上挑取单克隆于3 m l3 0 m g lc d “的l b 液体培养基中， 3 0 ，2 0 0 r p m 震荡过夜培养。 2 、依次按2 的接种量，接种到c d 2 + 浓度递增的l b 液体培养基中3 0 。c ，2 0 0 r p m 震荡培养。 3 、选取能够在4 0 0 m g l 以上c d 2 + 浓度的l b 培养基中生长的菌株，在1 0 0 m g lc d 2 + 的l b 平板上划线纯化，将纯化的菌种放入4 c 冰箱中保存备用。 2 2 1 3 耐c d 2 + 菌株的保存 1 、在3 0 m g lc d 2 + 的l b 平板上挑取单克隆于3 m ll o o m g lc d 2 + 的l b 液体培养基 中，3 0 ，2 0 0 r p m 震荡培养。 2 、当o d 6 0 0 达到o 4 加6 时，吸取5 0 ( 0 1 菌液加入到1 5 m le p 管中。 3 、加入等体积的3 0 甘油，混匀。 4 、在液氮中速冻2 - 3 m i n ，7 0 保存。 2 2 2 高耐受菌株生理生化鉴定 2 2 2 1 革兰氏染色 1 、染色剂： a 结品紫液：甲液，结品紫2 0 9 、乙醇( 9 5 ) 2 0 m l ：乙液：草酸按0 8 9 ，蒸馏水 8 0 m l 。将 卡l 、乙两液混合，静置于不透气棕色瓶中，4 8 h 后使j j 。 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 0 页 b 碘：碘1 0 小碘化钾( k i ) 2 0 9 ，蒸馏水3 0 0 m l 。先将碘化钾( k i ) 溶于少量蒸 馏水( 3 5 m 1 ) 中，再放入碘，溶时可稍加热，待碘全溶后加水至3 0 0 m l 。此溶液稳定， 在不透气的棕色瓶中保存。 c 脱色液：9 5 的乙醇。d 复染液：即0 5 番红( s a f r a n i n ) 水溶液。取2 5 番红( 又 称沙黄) 的酒精溶液2 0 m l ，蒸馏水混溶。 2 、用具：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、蒸馏水、吸水纸。 3 、染色观察：a 涂片：取一张干净载玻片于其中央滴一滴蒸馏水，按无菌操作用接 种环挑取已培养好的菌株少许于水滴中，调匀并涂成l c m 2 的薄层； b 干燥：涂片最好在室温中干燥。也可手持载玻片一端，小心地在酒精灯上放微微 加热，让水分蒸发，但切勿直接将玻片在火焰上加热，以防标本烤枯变形； c 初染：在涂片上加结晶紫一滴，约l m i n 后，水洗； d 媒染：滴加碘液并保存l m i n ，水沈： e 脱色：将载玻片上的水甩干净，用9 5 酒精滴沈片至滴出的酒精刚刚出现紫色为 止，约2 0 s ，立即用水冲洗； f 复染：用番红染色l m i n ，水洗，吸干； g 镜检：油镜下观察，被染成紫色者即为革兰氏阳性菌( g + ) ，被染成红色者为革 兰氏阴性菌( g 一) 。 2 2 2 2 氧化酶试验 1 、挑取耐c d 2 + 菌株单菌落于l b 斜面固体培养基中，3 0 。c 过夜培养。 2 、配制成1 0 的二甲基对苯撑二胺水溶液，保存在棕色瓶中，将二甲基对苯撑二 胺水溶液滴在一张放在结晶的培养皿巾的滤纸上，使滤纸刚好湿润。 3 、用接种环取少量菌苔涂抹于滴有二甲基对苯撑二胺水溶液的滤纸上。 4 、在1 0 秒内菌苔或边缘呈现红色者为阳性，在3 0 秒内出现红色者为迟缓阳性； 不呈现红色或3 0 秒以后才呈现红色则为阴性。 2 2 2 3 过氧化氢酶试验 1 、挑取耐c d 2 + 菌株单菌落接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，3 0 。c 过夜培养。 2 、挑取一小环菌苔涂抹在滴有5 h ! o ! 的玻璃片上，如有气泡产生则为过氧化氢 酶阳性，无气泡则为阴性。 2 2 2 4 明胶液化实验 1 、从分离得到的菌种平板上挑墩单克隆于l b 液体培养基中，3 0 。c ，2 0 0 r p m 震荡 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 1 页 过夜培养。 2 、用穿刺接种法接种高耐c d 2 + 细菌于明胶液化培养基中，3 0 。c 培养4 8 h 。 3 、观察培养基有无液化及液化后的性状( 因明胶在高于2 5 * ( 7 时自行液化，观察时 应放在冰浴中观察) 。 2 2 2 5 淀粉水解试验 1 、从分离得到的菌种平板上挑取单克隆于l b 液体培养基中，3 0 。c ，2 0 0 r p m 震荡 过夜培养。 2 、制备淀粉固体培养基平板，用接种环接环取少量高耐c d 2 + 细菌点接在培养基表 面，3 0 培养2