（发育生物学专业论文）小鼠受精前后转录谱重编程及染色质重组机制.pdf

转录谱重编程及染色质结构重组2 0 0 8 年5 月 小鼠受精前后转录谱重编程及染色质重组机制 摘要 转录谱重编程主要发生在卵母细胞生成后期及附植前胚胎发育阶 段，我们用免疫组化和荧光分子追踪的方法研究了母源特异性转录谱在 受精后转变成合子转录谱的基本机理，发现在g v ( g e r m i n a lv e s i c l e ) 期 卵母细胞中转录停止的时候，包括通用转录因子和转录调节子在内的一 组染色质因子( c h r o m a t i nf a c t o r s ，c f s ) 从染色质上解离，c f s 的全面 解离破坏了染色质和c f s 的物理联系，导致转录中止，并功能性清除了 母源特异的转录谱。受精或孤雌激活后，关键的转录因子和转录调节子 在原核形成后不久重新与染色质结合。c f s 与染色质的再结合伴随了核 功能的重建，包括d n a 复制和转录功能的恢复。据此认为母源性的转录 程序在卵子发生过程中被清除了，产生一个相对原始的单倍体染色质， 受精或孤刺激活后合子的转录程序才被重新建立，这个过程我们称为“清 除一重建”过程，通过它可以将母源性的转录谱重新设定成合子的转录 ；盐 旧o 在转录谱重编程过程中，染色质体结构的变化为功能的重编程提供 了基础。在第二章中，用免疫组化的方法研究了受精后附植前胚胎染色 质体结构及其组蛋白修饰的变化，发现围绕在1 细胞胚胎原核核仁周围 上海交通大学 邢风英 的异染色质在胚胎卵裂到2 细胞胚胎时，大部分已经从原核周围解离并 定位在核内除核仁外的其他部分，成较大点状分布。虽然2 细胞到桑椹 胚阶段异染色质染色强度有所增强，但是在桑椹胚发育到孵化囊胚阶段 时，异染色质的强度和致密度又开始逐步降低，在内细胞团细胞中致密 度达到最大程度的松散，强度最弱；另外发现常异染色质的相关组蛋白 修饰在内细胞团细胞中的强度也降到最低。在胚胎的发育过程中无论染 色质结构还是组蛋白修饰都是逐步变化的，直到内细胞团才出现和胚胎 干细胞相类似的定位模式。结论是1 细胞胚胎到囊胚阶段的发育是染色 质重组的重要阶段，通过染色质结构和表观修饰的逐步变化，在囊胚的 内细胞团细胞中完成全能性的建立，全能性细胞通过核内异染色质浓缩 程度的降低，以及一系列表观修饰程度的降低来保持它的全能性和可塑 性。 关键词：小鼠，重编程，转录，受精，染色质结构，附植前胚胎 上海交通大学邢风英 t ra n sc r i p t i o np r o f ，er e p r o g r a m m i n ga n d c h r o a 厦a t i ns t r u c t u r ew e r er e e s t a b l i s h e d i nm o u s ef e r t 。i z e de m b r y o s a b s t r c t t r a n s c r i p t i o nr e p r o g r a m m i n gm a i n l yw a so c c u r r e di nl a t t e rs t a g eo f o o c y t e sg r o w i n ga n dt h ee a r l ye m b r y o w es t u d i e dt h em e c h a n i s mo f t r a n s c r i p t i o nr e p r o g r a m m i n gf i r s t l yu s i n g t h ei m m u n o c h e m i c a la n d g f p - p r o t e i na s s a y o o c y t e sd i s p l a y e dam a t e r n a l - - s p e c i f i cg e n ee x p r e s s i o n p r o f i l e ，w h i c hw a ss w i t c h e dt oaz y g o t i cp r o f i l ea f t e rf e r t i l i z a t i o n h e r ew e d e m o n s t r a t e dt h a tb yt h et i m ew h e nt r a n s c r i p t i o nw a ss h u td o w ni ng e r m i n a l v e s i c l eo o c y t e s ，ar a n g eo fg e n e r a lt r a n s c r i p t i o nf a c t o r sa n dt r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t o r sa r ed i s s o c i a t e df r o mt h ec h r o m a t i n t h eg l o b a ld i s s o c i a t i o no f c h r o m a t i nf a c t o r s ( c f s ) d i s r u p t sp h y s i c a lc o n t a c t sb e t w e e nt h ec h r o m a t i na n d c f sa n dl e a d st oe r a s u r eo ft h em a t e r n a lt r a n s c r i p t i o np r o g r a ma tt h e f u n c t i o n a ll e v e l c r i t i c a lt r a n s c r i p t i o nf a c t o r sa n dr e g u l a t o r sr e m a i ns e p a r a t e d f r o mc h r o m a t i nf o rap r o l o n g e dp e r i o d ，a n db e c o m er e - a s s o c i a t e dw i t h 转录谱重编程及染色质结构重组 2 0 0 8 年5 月 c h r o m a t i ns h o r t l ya f t e rp r o n u c l e a rf o r m a t i o ni nf e r t i l i z e do rp a r t h e n o g e n e t e d e m b r y o s t h i si s f o l l o w e dt e m p o r a l l yb yt h er e - e s t a b l i s h m e n to fn u c l e a r f u n c t i o n ss u c ha sd n ar e p l i c a t i o na n dt r a n s c r i p t i o n w ep r o p o s et h a tt h e m a t e r n a lt r a n s c r i p t i o np r o g r a mi se r a s e dd u r i n go o g e n e s i st og e n e r a t ea r e l a t i v e l yn a f v ec h r o m a t i na n dt h ez y g o t i ct r a n s c r i p t i o np r o g r a mi sr e b u i l td e n o v oa f t e rf e r t i l i z a t i o no rp a r t h e n o g e n e s i s t h i sp r o c e s si st e r m e da st h e “e r a s e - a n d - r e b u i l d ”p r o c e s s ，w h i c hi su s e dt or e s e tt h et r a n s c r i p t i o np r o g r a m ， a n dm o s tl i k e l yo t h e rn u c l e a rp r o c e s s e sa sw e l l ，f r o mam a t e r n a lo n et ot h a t o f t h ee m b r y o c h a n g e so fc h r o m a t i n c h r o m o s o m es t r u c t u r ew e r eb a s e do nc h r o m a t i n f u n c t i o nr e p r o g r a m m i n g i nt h es e c o n dp a r t ，w es t u d i e dt h a tt h ec h a n g e so f c h r o m a t i n c h r o m o s o m es t r u c t u r ea n dh i s t o n e e p i g e n e t i c m a r k si n p r e i m p l a n t a t i o ne m b r y o sa f t e rf e r t i l i z a t i o nu s i n gi m m u n o c h e m i c a la s s a y s w h e nt h ee m b r y o d e v e l o p e di n t o t h e2 - c e l l ，m o s t l yh e t e r o c h r o m a t i n r o u n d i n gt h ep e r i p h e r yo fn u c l e o l u si np r o n u l c l e a ro f1 - c e l le m b r y od i s p l a c e d s t e pb ys t e p ，a n dw a sa p p e a r e da sl a r g er e g i o n si nt h eo t h e rt h a nt h e n u c l e o l u so ft h en u c l e a r a l t h o u g ht h ei n t e n s i t yo fh e t e r o c h r o m a t i ns t a i n i n g w a si n c r e a s e df r o m2 - c e l le m b r y ot om o r u l a ，t h ei n t e n s i t ya n dt h e c o m p a c t i o n a n dt h en u m b e ro fh e t e r o c h r o m a t i nf o c i p e rn u c l e u sw e r e s t e p w i s ed e c r e a s e df o r mm o r u l at ob l a s t o c y s t t h eh e t e r o c h r o m a t i ns t a i n i n g 2 上海交通大学邢凤英 i sf u r t h e s td i f f u s e l yl a b e l e dr e g i o n si nt h en u c l e a ro ft h ei n n e rc e l lm a s s a s t h es a m et i m e ，t h es a m ed i s t r i b u t e d p r o f i l e w a so b s e r v e d t h r o u g h i m m u n o s t a i n i n g o ft h em o d i f i c a t i o no ft h eh i s t o n eo n h e t e r o c h r o m a t i n e u c h r o m a t i n c h r o m a t i ns t r u c t u r ea n dh i s t o n em o d i f i c a t i o n w a sc h a n g e ds t e pb ys t e pi nd e v e l o p m e n t ，u n t i lt h ee sc e l lt y p ep r o f i l ew a s e s t a b l i s h e di nt h ec e l lo fi n n e rc e l lm a s s t h e r e f o r e ，t h es t a g e sf r o m1 - c e l l e m b r y ot ob l a s t o c y s tw e r ec r u c i a l f o rt h ec h r o m a t i nr e m o d e l i n g t h e p l u r i p o t e n c y o ft h ei n n e rc e l lm a s sw a se s t a b l i s h e dv i ac h r o m a t i n r e o r g a n i z a t i o na n de p i g e n e t i cm o d i f i c a t i o n t h ep l u r i p o t e n tc e l lm a i n t a i n e d c h r o m a t i ni nap l a s t i cs t a t e ，a n d ，i nt h i s w a y ，t ot h em a i n t e n a n c eo f p l u r i p o t e n c yv i at h ed e c r e a s eo ft h eh e t e r o c h r o m a t i nc o m p a c ta n de p i g e n e t i c m o d i f i c a t i o n k e y w o r d s ：m o u s e ，r e p r o g r a m m i n g ，t r a n s c r i p t i o n ，f e r t i l i z a t i o n ，c h r o m a t i n s t r u c t u r e ，p r e i m p l a n t a t i o n 3 上海交通大学 邢风英 符号和单位说明 英文缩写英文全称 b s a f b s p b s p f a d h m l n b o v i n es e r u ma l b u m i n f e t a lc a t t l es e r u m p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a li n e p a r a f o r m a ld e h y d e d a y h o u r m i n u t e g r a m m i l l i g r a m m ic r o 。g r a m 1 i t e r m i l l i l i t e r m i c r o l i t e r m i c r o m e t e r m o l a r li t e r m i l l i m o l a r 1 中文全称 牛血清白蛋白 胎牛血清 磷酸盐缓冲液 多聚甲醛 天 小时 分钟 克 毫克 微克 升 毫升 微升 微米 霹尔缺 毫摩尔升 g g l l m 心 g 唱 嵋 1 以 山 岫 m 心 转录谱重编程及染色质结构重组2 0 0 8 年5 月 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：j 两雌 日期：劫曙年午月f 乡e l 邢风英 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规 定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 | 不保密囱。 ( 请在以上方框内打“4 ”) 学位论文作者签名：黛俄翁乙 指导教师签名：勘磐嘭 日期：鲫占年年月“日日期：砌馏年牛月日 上海交通大学邢风英 第一章受精和孤雌生殖中转录谱的重编程机制 在小鼠上，转录停止在卵母细胞的g v ( g e r m i n a lv e s i c l e ) 期【l 弓】，直到合子基 因转录激活开始前一直保持沉默。合子基因激活发生在受精后9 1 0 小时【6 - 9 ，转录停 止到重新开始之间，母源性的转录模式重编程到合子的转录模式。负责正常发育、 孤雌生殖和体细胞核移植重编程过程的分子机制目前还不是很清划1 0 d 3 1 ，理解这个 基本的机制对发育生物学来说是非常重要的。 在胚胎发生过程中针对转录沉默曾提出三个假说：l ，爪蟾早期发育过程中，由 于中期囊胚转换前快速的细胞分裂周期抑制转录的发生【1 4 1 6 1 ；2 ，卵内存在的抑制因 子抑制转录【1 7 _ 1 9 】；3 ，关键转录因子的缺失【2 0 】或不足【2 1 2 2 1 可能导致转录沉默。这些假 说主要集中在受精后的事件上，并没有考虑到在卵子或精子发生过程中转录是否会 停止。 目前有些研究关注了发生在卵子发生过程中的转录因子或转录调节因子的表达 水平或功能状态，发现有几个转录因子的核内浓度在卵母细胞生长过程中是在降低 的，如s p l 和t b p t 2 3 】；另外，也发现了r n a 聚合酶i i ( r n a i i ) 全酶成分去磷酸化， 离开活性位点【5 , 2 4 - 2 7 ；多梳集团蛋白( p o l y c o m bg r o u pp r o t e i n ) 的成员r i n g l b 和 r a e 2 8 p h l 从减数分裂g v 期卵母细胞的染色质上解离下来【2 8 】。尽管可以认为这些事 件能导致完全生长的卵母细胞转录的缺陷【5 ，2 3 斟2 6 】，但是这些研究数据和研究范围太 有限了，不能对全基因组的转录失活提供充足的解释，这些研究也不能解释这些事 件对基因表达模式的重编程有怎样的作用。s n ( s u r r o u n d i n gn u c l e o l u s ) 阶段的卵母 细胞的转录下调时，r n a 聚合酶i ( r n a i ) 的亚单位u b f ( u p s t r e a m - b i n g d i n gf a c t o r ) 以及r r n a 过程与核糖体生物基因相关的蛋白仍然与核样小体相连，这就使这个问 题的描述更加的复杂【2 9 1 ，转录失活的基本的机制还不知道【3 1 。 在真核细胞中，m r n a 转录起始于启动子上前起始复合体的装配【3 3 1 。基因转 转录谱重编程及染色质结构重组 2 0 0 8 年5 月 录通道几乎每一步都由不同的多蛋白复合体调节，大部分的多蛋白复合体结合到特 异性的调节元件上，调节转录本的产生，修饰核小体和更高序列染色质的结构。这 些染色质因子( c h r o m a t i nf a c t o r s ，c f s ) 在功能上联合起来产生明显的特异性，确 定转录模式。我们假设从母源性的转录模式转变到合子的转录模式伴随着与染色质 结合的c f s 模式的全面的改变，一个可能的机制是c f s 的改变是清除已经存在于染 色质的转录程序，产生一个相对原始的染色质，接下来再把合子的转录程序装上， 为了验证这个假设，我们研究了g v 期卵母细胞和1 细胞胚胎中染色质和c f s 之间 关系的动态变化。 孤雌生殖是某些生物，例如果蝇、蚂蚁、蜥蜴、蛇、鱼类等普遍存在的一种繁 殖方式【3 4 1 ，在这个过程中，卵子的基因组被复制，二倍体的卵子发育，但是没有雄 性的贡献。哺乳动物完全发育需要雌雄两个基因组，孤雌体能发育到原肠中期，但 是许多动物是不能发育成个体的【3 5 4 1 1 ，但是通过对印记基因的修饰，也有孤雌体能 发育成存活的个体。 通过对受精胚胎以及孤雌生殖胚胎的研究，揭示了包括必需的转录因子在内的 一大批c f s 在第一次减数分裂时从染色质解离下来，导致母源性的转录程序被清除， 大多数的c f s 在受精后原核形成时重新与染色质结合。染色质与c f s 重新结合后核 功能很快重新建立，如d n a 的复制心，4 3 】和转录【6 明。本实验结果提供了一个对于转 录重编程概念性的新的框架。第一，转录机器和调节机器的解离导致转录失活是发 生在卵子发生过程中的。第二，转录重编程开始于受精前的卵子发生过程中，卵子 发生在清除母源性转录程序上有重要功能，目的是为合子的发育准备相对原始状态 的染色质。第三，母源性转录程序转变成合子转录程序是通过广泛的“清除一重建” 过程，而不是限定在染色质重编程过程。第四，转录沉默在两代之间的转变点是一 个与转录重编程有关的现象，它代表母源性转录程序解离后到合子转录程序开始前 染色质一个去功能状态。第五，在孤雌生殖过程中，全面的c f s 的解离和重新结合 的发生在时间顺序上和正常受精是一致的。因此，“清除一重建”过程也适用于孤雌 过程，而且很可能这也是转录重编程的基本机制，所以“清除一重建”机制可能是不 2 上海交通大学 邢凤英 同繁殖方式中建立新的生命周期的一个通用的模式。第六，成熟卵母细胞包含合子 发育过程中大部分的( 如果不是全部) 必需的装配成分，把合子装配成合适的不同 来源的二倍体染色质 4 4 1 。 ( 注：本实验的研究是由本人、李瑞珍和郑俊克同时完成的，其中李瑞珍侧重 于卵母细胞转录谱重编程的研究，郑俊克侧重受精重编程的研究，本人侧重孤雌激 活后转录程序重建的研究。) 1 1 实验材料 1 1 1 实验动物 f l 代( 昆明白xi c r ) 小鼠购自中国科学院上海生命科学院实验动物中心，用 于获取g v 期卵母细胞和成熟卵母细胞。受精的1 细胞胚胎来源于f 1 代雌鼠和昆明 白雄鼠。为了确保实验结果不是由于小鼠品系的原因，也用其他的f 1 品系( d b a x c 5 7 ) 验证了实验结果。受精和孤雌所用的小鼠为雄鼠8 1 2 周，雌鼠6 , - , - 8 周。 g v 卵的雌鼠为3 4 周。 1 1 2 细胞 n i h 3 t 3 细胞购自中科院上海生命科学院细胞库。 1 1 3 主要试剂 d m e m ( 高糖) p b s o 0 5 胰酶 明胶 g i b c o g i b c o g i b c 0 s t e mc e l l 3 转录谱重编程及染色质结构重组2 0 0 8 年5 月 p 一巯基乙醇 非必需氨基酸 胎牛血清 白血病抑制因子( l 礤) 青链霉素 丝列霉素c d m s o o p t im e m g i b c o g i b c o h y c l o n e c h e m i c o n g i b c o s i g m a s i g m a i n v i t r o g e n 孕马血清促性腺激素( p m s g )天津华符生化制品厂 人绒膜促性腺激素( h c g )天津华符生化制品厂 透明质酸酶 牛血清白蛋白( b s a ) t r i t o nx - 1 0 0 多聚甲醛( p f a ) s i g m a s i g m a s i g m a s i g m a 4 ，6 d i a r n i d i n o 一2 一p h e n y l i n d o l e ( d a p i ) s i g m a d a b c o s i g m a 4 上海交通大学 邢风英 1 1 4 本课题所用抗体、对照的来源 1 1 4 1 本实验所用一抗来源 表1 一抗的来源和稀释比例 5 转录谱重编程及染色质结构重组2 0 0 8 年5 月 1 1 4 2 二抗来源： c y 3 或者f i t c 标记的山羊抗兔i g g c y 3 或者f i t c 标记的山羊抗兔i g g c y 3 或者f i t c 标记的山羊抗兔i g g 1 1 4 3 阴性对照的来源 正常兔i g g 正常山羊i g g 正常的小鼠i g g 正常的山羊血清 正常的兔血清 1 1 5 主要实验仪器 培养箱 u p s t a t e 博士德 s i g m a j a c k s o ni m m u n o r e s e a r c h h e r ac e l l 6 上海交通大学邢风英 超净工作台 实体显微镜 倒置显微镜 激光共聚焦显微镜 低温离心机 液氮罐 超纯水系统 显微操作系统 1 1 6 试剂的配制 1 1 6 1 细胞培养 苏净集团 o l y m p u s o l y m p u s o l y m p u s e e n d o r f l z p p e n d o r t f o r m a m i l l i p o r e e f m ：9 0 d m e m ，1 0 胎牛血清，1 0 0 0u m l 青链霉素。 1 1 6 2 胚胎操作及培养 p m s g 和h c g ：生理盐水配成5 0 i u m l ，一2 0 保存。 c z b 培养液：8 1 6 2m mn a c l ，4 8 3m mk c l ，1 1 8m mk h 2 p 0 4 ，1 1 8m m m g s 0 4 7 h 2 0 ， 2 5 1 2m mn a h c 0 3 ，1 7 0m mc a c l 2 2 i t 2 0 ，3 1 3 0m ms o d i u ml a c t a t e ，0 2 7m m s o d i u mp y r u v a t e ，0 1 1m me d t a ( d i s o d i u ms a l t ) ，1 0 0m mg l u t a m i n e ，1 0 0 0 0u m l s o d i u mp e n i c i l l i ng ，o 7 0m g m ls t r e p t o m y c i n ，5 0 0m g m lb s a 。 h c z b 操作液：c z b 培养液中加入2 0 1 1 ：蝴h e p e s 。 透明质酸酶液：用h c z b 培养液配成0 1 m g m l ，- - 2 0 c 保存。 7 转录谱重编程及染色质结构重组2 0 0 8 年5 月 卵母细胞成熟培养液：m e m a 中添力1 3 m g m l 的b s a ，l m g m l 的f e t u i n ，l n g m l 的e g f 和1 0 0 m g “的f s h 。 化学激活液：c z b 培养液中加入s r 2 + 配成5 m m 浓度的激活液。 融合液：0 3 m 的山梨醇，o 1 m m 的醋酸钙，o 1 n 蝴的醋酸镁和0 5 m g m l 的f f a b s a ( s i g m a ) 。 1 1 6 3 免疫组化 4 p f a ( p a r a f o r m a l d e h y d e ) ：1 0 0 m lp b s 中加入4 9 p f a ，放置6 0 。c 水浴中，不时 搅拌直至完全溶解，n a o h 调p h 为7 4 ，分装后放一2 0 保存。 0 5 的t r i t o n ：l o o m lp b s 中加入0 5 m lt r i t o nx - 1 0 0 。 1x p b s ( 1l ) ：8 9 n a c l ，o 2 9 k c l ，3 6 2 9n a e h p 0 4 1 2 h 2 0 ，0 2 4 9 k h 2 p 0 4 ， 调p h 为7 4 。 免疫组化用封闭液：p b s + 0 3 b s a 。 1 2 实验方法 1 2 1g v 期卵母细胞的收集和培养 3 - 4 周的f 1 雌鼠注射1 0 i u 的p m s g ，4 8 小时后断颈处死，收集卵巢放入h c z b 中， 然后用2 8 g 的针头不停的扎卵巢，使g v 卵释放出来，实体显微镜下观察有生发泡的 卵母细胞为g v 卵，将g v 卵在卵母细胞成熟培养液中培养。为了阻止生发泡破裂( g v b r e a k d o w n ，g v b d ) ，成熟培养液中添加了o 2 n l m 的i b 凇( 3 i s o b u t y l 1 m e t h y l x a n t h i n e ) 。然后在3 7 c ，5 c 0 2 分别培养0 5 h ，l h ，2 h 和6 h 。 1 2 2 成熟卵母细胞的收集和培养 为了获得第二次减数分裂中期( m i i ) 的卵母细胞，选取6 8 周大小的f 1 代雌 鼠，注射1 0 i u 的p m s g ，4 8 小时后再注射1 0 i u 的h c g ，注射h c g1 8 2 0 小时后， 8 上海交通大学邢风英 f l 代小鼠断颈处死，取出输卵管放入h c z b 中，在光学显微镜下找到膨大部，取出 卵母细胞团，然后用o i m g m l 的透明质酸酶处理，去除颗粒细胞，用h c z b 洗3 次， 3 7 。c 、5 c 0 2 条件下培养在c z b 4 5 1 中。 1 2 31 细胞胚胎的收集 激素处理与获得成熟卵母细胞的方法一样，但是注射h c g 后立刻与雄鼠合笼， 1 5 - 2 5 小时同样在输卵管膨大部收集1 细胞胚胎，用透明质酸酶处理去除颗粒细胞并 培养在3 7 c 、5 c 0 2 的c z b 培养液中。 1 2 4 卵母细胞的化学激活 去除颗粒细胞的m i i 期卵母细胞使用化学方法。将去除颗粒细胞的卵母细胞放 到包括5m ms d + 和5 u g m lc b ( c y t o c h a l a s i nb ，s i g m a ) 的无钙c z b 培养液中激活 1 小时，然后用添加5 u g m lc b 的c z b 培养液洗三遍，并在此培养液中继续培养5 小时，最后用胚胎培养液c z b 洗三遍，并培养在c z b 中待用。 1 2 5g v 期卵母细胞、l 一细胞受精胚胎和孤雌胚胎的分类标准 根据以前建立的标准将g v 期卵母细胞分成n s n ( n o n s u r r o u n d i n gn u c l e o l u s ) ， p s n ( p a r t i a ls n ) ，和s n 三个类型1 , 4 , 5 , 4 5 - 4 8 】。 原核形成前的1 细胞胚胎称为早期1 细胞胚胎。原核形成后根据a d e n o t 掣4 3 1 的分类标准将原核期分为1 5 个阶段。为了描述方便，原核形成后的1 细胞胚胎称 为晚期1 细胞胚胎。 圆圆圈圆圈圈 图1 小鼠原核期胚胎分期示意图 f i g u r e1s k e t c hm a po fm o m ep r o n u c l e a rs t a g e sc l a s s i f i c a t i o n 9 转录谱重编程及染色质结构重组 2 0 0 8 年5 月 孤雌生殖过程中，c b 能阻止第二极体的排出，两个姐妹染色单体转变成原核。 因此p n l 阶段的两个原核之间的距离比受精胚胎p n l 的距离要近。孤雌胚胎原核的 分期也是根据a d e n o t 4 3 】的分类标准调整后划分的。p n l ，两个原核刚刚形成，在纺 锤体两端出现两个高度紧实的点，有的有核仁出现；p n 2 ，核开始增大，核内均存在 核仁；p n 3 ，核进一步增大，两个核向胚胎的中心靠近并互相接近；p n 4 ，两个原核 互相接合；p n 5 ，两个原核彼此重叠，正在融合。 1 2 6 免疫组化 每一种抗体都使用5 个不同的固定透膜方法处理，来选择最佳的检测条件。表l 中列举了每一个抗体的最适的固定透膜方法。文章中每个抗体的图片都是来自于最 适方法处理过后免疫组化的结果。 免疫组化步骤如下： 1 0 上海交通大学 邢凤英 收集不同时期胚胎 上 p b s + 0 3 b s a 洗3 遍 7 弋 方法a ：室温下4方法b ：0 2 5方法c ：用方法d ：方法e ： 的p f a 固定1 的t r i t o n1 f p a +用1 0 0 用7 0 小时然，后用x - 1 0 0 冰上 o 2 丙酮的乙醇 p b s + 0 3 b s a 洗透膜5 分钟， t r i t o n 固定透固定透 3 遍，室温0 5 然后再用4 x 一1 0 0 室温膜膜 的t r i t o nx 一1 0 0p f a 室温固固定透膜1 透膜1 0 分钟。定l d , 时小时 ，r 一 - 、 、i l 一一 _ 一 p b s + 0 3 b s a 洗3 遍 上 一抗、正常血清或正常i g g4 c 过夜 上 p b s + 0 3 b s a 中洗3 遍 土 c y 3 或f i t c 标记的二抗室温处理l 小时 上 p b s + 0 3 b s a 中洗3 遍 上 d n a 染料d a p i 染色1 5 分钟，负染核 上 抗衰减封片剂( 5 0 甘油+ d a b c 0 ) 0 在o l y m p u s ( o l y m p u s ) 激光共聚焦显微镜6 0 倍水镜下观察，拍照 1 2 7 抗体的来源 t r y 3 抗体和抗原的产生根据以前的研究【4 9 1 。b r f le d n a ( 全长；g e n b a n k 转录谱重编程及染色质结构重组2 0 0 8 年5 月 a c c e s s i o n n o b c 0 5 8 1 1 2 ) 用p c r 扩增，然后在b r f l g s t 融合蛋白中表达，纯化过 的肽段免疫兔子来制备抗体，在小鼠胚胎上用w e s t e r nb l o t 验证了抗体的特异性，产 生的抗体也可被纯化的免疫原阻断。所有其他抗体和阻断的肽段均从公司购买( 表 1 ) 。 1 2 8 免疫组化特异性的检测 用下列方法来检测抗体标记的特异性。1 ，正常的山羊或兔的血清，或者小鼠的 i g g 用来做为每个抗体的阴性对照。核内表达某些g f p c f s 的n i h 3 t 3 细胞作为阳 性对照。 1 2 9 肽段阻断 阻断的肽段从公司购买或自己合成，能得到的肽段一共有1 0 个。每一个抗体对 应的肽段以抗体使用浓度的1 0 倍和抗体一起孵浴，室温l 小时，然后再把这个抗体 应用在样本上。正对照实验是同时在样本上使用不加肽段的抗体。 1 2 1 0 细胞培养 n i h 3 t 3 细胞的培养使用e f m 培养液，当细胞长满后用0 0 5 的胰酶进行消化处 理，合适密度传代到新的培养皿内继续培养。 1 2 1 1g f p o c f s 表达载体的构建 一共构建7 个g f p c f 融合蛋白，包括g f p t b p ， g f p f r f 3 ， g f p t f i i p ， g f p b r f1 ，g f p 肿1 p ，g f p m e c p 2 和g f p h 2 b 。免疫化学和生化分析表明这 些融合蛋白的表达类似内源性的因子( w w w n u c l e a r - r e p r o g r a m m i n g t o m o n ) 。表达的 载体用l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 ( i n v i t r o g e n ，c a ，u s a ) ，转染n i h 3 t 3 细胞，选取有 微弱荧光的细胞用于核移植实验。 1 2 1 2g v 卵和m i i 期成熟卵母细胞核移植过程 将单个带荧光的n i h 3 t 3 细胞注入去除颗粒细胞的g v 期卵母细胞的卵周隙中。 1 2 上海变通大学 邢风英 然后用2 次2 4 0 v c r a 电压、2 0 u m 脉冲的直流电( b t x ，c e u m a n i p u l a t o r 2 0 0 1 ) 进行 融合。重组的g v 卵放入添加i b m x 的成熟培养液中培养6 - 8 小时后，大部分卵母 细胞处在p s n 阶段或s n 阶段2 ，”。重组的g v 卵在无l b m x 抑制剂中继续培养2 - 5 或1 2 小时。 m i i 期卵母细胞的核移植过程是首先将卵母细胞放入h c z b + s u g m 1 的c b 中， 在p i e z o 辅助显徽操作系统( p m a s c t l 5 0 ，p r i m e t e c h l i d ) 下将卵母细胞核去除， 然后将单个的n i h 3 t 3 细胞注入卵周隙。融合过程与g v 卵一致，融合后立刻将卵母 细胞放入c z b 培养液中培养。 1 2 1 3b r u t p 的掺入 b r u t p 的掺八是根据已经报道过的方法来进行的 5 0 l 。用免疫组织化学方法检测 掺入的b 岍p 。胚胎转移n 3 m g m l b s a p b s 中，用p b s b s a 洗5 次。小鼠抗b r u 抗体( 1 ：2 0 用b s m p b s 稀释) 中孵育l d 时后，用p b s b s a 洗5 次，再用c y 3 标记 的驴抗小鼠二抗( 1 ：2 0 0 用b s a j p b s 稀释) 孵育l d , 时，用b s a y p b s 洗5 次，用d n a 染料d a p i 负染核。最：明d a b c o 封片，在o l y m p u s 激光共聚焦显微镜6 0 倍油镜观察。 1 2 1 4 数据的收集 用激光共聚焦显微镜系统收集图片，活细胞观察时激光强度和扫描时间降到最 低，以减少对细胞的破坏。 1 3 实验结果 1 3 1 转录停止伴随着第一次减数分裂中广泛的转录因子和转录调节因子的解离 小鼠中，转录活性的停止发生在染色质e hn s n 向s n 结构转变过程中咐4 ”。n s n 阶段卵母细胞的转录活性是很高的，随着染色质的浓缩，转录活性开始降低，直到 s n 阶段转录停止【1 。5 】。我们通过对b r u t p 的掺入实验也证实了这个观点( 图2 ) 。 转i 谱程染色质结构重组 圈2 染色质浓缩过稗中转录是连步停i 的。b r u t p 的掺入( 绿色) 在s n s n 期和部分n s n 期的g v 卵母细胞中是肯很高讦性的，专絷也质浓缩时转采活性开始降低仆1 1 在s n 期的6 v 划卵母细胞 完全消失。c 芷盯舱，第行芷h u 两行的替加幽。b a r - 5u m ， f i g u r e2t m n s c f i p t i n nr e m a t e sg r a d 峨l l yd 山i n gc h r o m a t i nc o n d e n s a t i o n b r u t pi n c o r p o r a t i o n ( g r e e n ) e a c t i v eu ls m a l l s i z e g vo o c y t e s ( s n s n ) a n d i nap o r t i o n o f n s n g vo o c y t e s f n s n ) i tr e d u c e dd u r i n gc h m m a t i n ( n d ) c o n d e n s a t i o na n dv a n i s h e de v e n i l 】a l l yi ns ng vo o c y e sc ，c o n t r o l t h e t h i r dt o w i ne a c hp a n e lc o n t a i n e d m m g e s m e r g e d f r o m t h e l o p t w or o w sb a f 5u m 我们首先想知道转录停止的时候转录机器是否还是完整的。往n s n 阶段的核内， 转录是有衍性的( 豳2 ) ，8 个通h j 转录因子( g t f s ) 包捐t b p t r f 3 ，t a f i t a f 4 t f i i a t f i i b p o l i i ，和b r f i 都还存在( 图3 ，n s n ：表2 ) 。州此在这个阶 段转录机器一定仍在染色质上，还在行使它的功能。在口s n 和s n 的核上，染色质逐 渐凝集。染色质的运动，使我们有机会检测到g f f s 和染色质的关系。就像图3 所示， t a f l 在染色质浓缩过程中与d n a 是其定位的：g v b d 后，所有线球期( d i a k i n e s i s ) 的染色件染色质都能检洲 i j t a f l 的信号；在p r o - - m i 期约有半的卵母细胞的染也 体上有t a f i 的信导，而在m 1 期的卵母细胞内t a f l 的信号点是完全缺失的( 表2 ) 。 这些结果表明，t a f i 在染色质浓缩过程中是与d n a