（生态学专业论文）多菌灵降解菌的降解特性及gfp标记.pdf

摘要 摘要 多菌灵( c a r b e n d a z i m ，m b c ) ，化学名称为n - ( 2 苯并咪唑基) 氨基甲酸甲 酯，是一种高效广谱低毒的内吸性杀菌剂，属于苯胺类苯并咪唑衍生物， 其使用范围较广，既可作为工业杀菌剂，又可作为一种有内吸活性的植 物杀菌剂，用于水果保鲜、蔬菜、果树和谷类作物的病害防治。多菌灵 化学性质稳定，在土壤中降解半衰期较长，能持久地残留在使用部位， 易致累积效应，其在水体和土壤中的累积会对生态环境和人类健康造成 威胁。有研究表明，微生物降解是沉积环境中多菌灵去除的主要途径。 因此寻找并研究多菌灵降解菌是十分必要的。 山西省农药重点实验室已分离筛选出一株细菌n y 9 7 一l ，经试验证 明该菌具有降解多菌灵的特性，若能进一步研究其降解能力、降解条件， 为其在生物修复中的应用提供依据和实验材料，无疑具有重要的理论和 现实意义。绿色荧光蛋i 兰i ( g f p ) 基因作为标记基因，被广泛应用于环境微 生物学方面，由于其表达稳定，容易观测，因此，可以以g f p 作为报告 基因，对菌株n y 9 7 1 进行g f p 标记，为今后研究多菌灵降解菌在自然环境 中的定殖、分布及动态变化打下基础。本文的主要研究内容有如下几个 方面： 1 该菌株n y 9 7 1 的1 6 sr d n a 经同源序列比对，同源性为9 9 以 上，结合生理生化指标鉴定其属于短小芽孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) 。 2 经b a m h i 酶切的启动子探针载体p u c l 9 - g f p 与n y 9 7 一l 基因组 d n a 的鼢甜鲥，酶切片段酶连，酶连产物转化e c o l id h 5 a , 建立b p 的启 动子基因文库。挑选其中的两个强阳性克隆，亚克隆来自短小芽孢杆菌 总基因组的启动子活性片段f 4 、f 5 ，构建大肠杆菌短小芽孢杆菌穿梭 表达载体p n w 3 3 n - g f p 4 ，p n w 3 3 n - g f p 5 。通过电转化得到g f p 在b p 中的两株标记菌株。在荧光显微镜下，观察到了明亮的绿色荧光，证明 活性片段f 4 、f 5 均具有组成型启动子的功能，实现了g f p 基因在b p 中 组成型表达，且遗传稳定，为今后研究多菌灵降解菌b p 在自然环境中 的定殖、分布及动态变化打下了基础。 3 本文研究并建立了多菌灵在降解培养基中的残留检测方法。该方 多菌灵降解军菌的降解特性及g f p 标记 法采用甲醇和水溶液的混合液作提取剂，检测结果表明：该方法的准确 度、精密度和灵敏度等指标均符合农药残留分析的基本要求，同以往所 报道的方法相比具有样品前处理过程相对简单，回收率高，重复性好， 且费用较低等特点，适合于该降解菌的降解能力的检测。 4 本文对多菌灵降解菌株n y 9 7 1 的降解性能进行了研究。结果表 明：该菌株对多菌灵有较强的降解能力。细菌菌株n y 9 7 1 在多菌灵浓度 为1 0 0m g l 。的条件下，3 0 振荡培养2 4h ，多菌灵的降解率达7 8 6 6 。 外界条件对降解菌的降解也有显著影响。培养基初始p h 在6 1 0 的范 围内均可以高效降解多菌灵，p h 为4 时，对降解起较大的抑制作用。在 多菌灵的浓度为1 0 3 0 0m g l 。时，菌株n y 9 7 1 对多菌灵的降解率为 4 2 4 4 9 0 0 7 。在3 5 4 0 时对农药降解率最高，经高温高压处理后 的菌液对多菌灵仍有降解作用，说明对降解起主要作用的物质耐热性好。 共存底物有机氮可以促进菌株n y 9 7 1 的降解能力，而无机氮源尿素对 菌株n y 9 7 一l 的降解能力起抑制作用。 5 。实验证明菌株n y 9 7 。1 是一株多功能菌株，不仅具有降解多菌灵 的功效，而且对多种枯萎菌具有拮抗效果。对番茄枯萎菌( f u s a r i u m o x y s p o r u m ( s c h l ) fs p l y c o p e r s i c i ( s a c c js n y d e re th a n s e n ) 、青椒枯萎菌 ( f u s a r i u mo x y s p o r u m ( s c h l ) f s p v a s i n f e c t u m ( s n y d e th a n s ) ) 、西瓜枯萎 菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m f s p n i v e u m ( e e s m i t h ) s n y d e re th a n s e n ) ，仙客 来枯萎菌( f u s a r i u ms 功、一品红枯萎菌( f u s a r i u ms p ) 、黄瓜枯萎菌 ( f u s a r i u mo x y s p o r u m ( s c h l ) ，：印c u c u m e r i n u mo w e n ) 的抑制率分别为 5 0 8 ，5 0 8 ，5 4 1 ，3 7 5 ，3 1 6 ，4 2 5 。 6 多菌灵单剂对供试的六种枯萎菌菌丝生长具有明显的抑制效果， 但1 0 的n y 9 7 1 活体菌液与多菌灵混配会降低多菌灵的毒力，表现为 混配剂3 d 及7 d 时e c 5 0 均比多菌灵单剂的e c 5 0 大。这表明n y 9 7 一l 与多 菌灵共存时主要表现其降解作用。该结果对指导n y 9 7 1 的合理使用有 重要意义。尽管其具有生防与降解双重功效，但在实际应用中仍以降解环 境中残留的多菌灵进行生物修复为主。 7 研究了多菌灵处理土壤的盆栽黄瓜子叶期及开花期不同器官中 超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g p ) 【) 、 a t p 酶活性的变化。结果表明多菌灵对花期不同器官中s o d 、c a t 、g p x 、 摘要 a t p 酶活性所产生的诱导作用显著大于子叶期的。多菌灵对花期根茎叶 及子叶期叶中s o d 活性诱导作用明显。多菌灵对花期根叶及子叶期叶中 c a t 有明显的诱导作用，对花期茎及子叶期茎有明显的抑制作用。而g p x 花期及子叶期茎中有明显的诱导作用。这说明随着黄瓜的生长其抵抗逆 境的能力也在增强。在子叶期，子叶在抵抗逆境的过程中发挥着重要的 作用。 关键词：多菌灵：生物降解：短小芽孢杆菌；g f p 标记：抗氧化酶系统 i l l a b s t r a c t c a r b e n d a z i m ( c 9 h 9 n 3 0 2 ；m e t h y l - 2 - b e n z i m i d a z o l ec a r b a m a t e ；m a c ) i s w i d e l yu s e da sa na g r i c u l t u r a la n dh o r t i c u l t u r a lf u n g i c i d ea r o u n dt h ew o r l d i t i sas y s t e m i cb e n z i m i d a z o l ef u n g i 【c i d et h a tp l a y sav e r yi m p o r t a n tr o l ei n p l a n td i s e a s ec o n t r 0 1 c a r b e n d a z i mi su s e dt oc o n t r o lab r o a ds p e c t r u mo f d i s e a s e so na r a b l e c r o p s ( c e r e a l s ，o i l s e e dr a p e ) ，f r u i t s ，v e g e t a b l e s a n d o r n a m e n t a l s i ti sa l s ou s e di np o s t - h a r v e s tf o o ds t o r a g e ，a n du s e da sas e e d p r e p l a n t i n gt r e a t m e n t c a r b e n d a z i mw o r k sb yi n h i b i t i n gt h ed e v e l o p m e n to f f u n g ip r o b a b l yb yi n t e r f e r i n gw i t hs p i n d l ef o r m a t i o n a tm i t o s i s ( c e l ld i v i s i o n ) c a r b e n d a z i mi saf u n g i c i d eo fm a j o rc o n c e r nd u et oi t ss u s p e c t e dh o r m o n e d i s r u p t i n ge f f e c t s c a r b e n d a z i mh a sah a l f - l i f e ( t i m et a k e nf o rh a l ft h es a m p l e t od e c a y 、o f6 1 2m o n t h so nb a r es o i la n d3 - 6m o n t h so nt u r fa n di sm a i n l y d e c o m p o s e db ym i c r o o r g a n i s m s m i c r o b i a ld e g r a d a t i o ni sc o n s i d e r e dt ob e a ne s s e n t i a la p p r o a c hi nt h e i rd e c o n t a m i n a t i o n s oi ti sn e c e s s a r yt od i s c o v e r a n ds t u d yt h ec a r b e n d a z i md e g r a d a t i o nm i c r o b e s t h eg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( g f p ) i sau n i q u et o o lt h a tp e r m i t st h e m o n i t o r i n go fg e n ee x p r e s s i o na n dp r o t e i nl o c a t i o ni nl i v i n gc e l l s g r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i ni ss t a b l e ，d o e sn o t r e q u i r ec o f a c t o r sf o ra c t i v i t ya n dc a l lb e f u n c t i o n a l l ye x p r e s s e di nd i f f e r e n tb a c t e r i a ls p e c i e s b e c a u s eo fg f pu n i q u e p r o p e r t i e s ，i tc a nb eu s e da sar e p o r t e ro fg e n ee x p r e s s i o n ，d y n a m i cp r o c e s s e s d u r i n gb a c t e r i a ld e v e l o p m e n t ，a n dt h eb e h a v i o ro fs i n g l eb a c t e r i ai nc o m p l e x e n v i r o n m e n t s b a s e do nt h ea b o v e - m e n t i o n e dc o n s i d e r a t i o n ，t h ea u t h o ru s i n ga c a r b e n d a z i m d e g r a d i n g b a c t e r i a ls t r a i nn y 9 7 - l ，i s o l a t e db ys h a n x ik e y l a b o r a t o r yo fp e s t i c i d es c i e n c e ，c o n d u c t e das t u d yo nc h a r a c t e r i s t i c so fa c a r b e n d a z i md e g r a d i n gb a c t e r i u ms t r a i na n dg f pm a r k i n g t h em a i n c o n t e n t sa n dc o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s ： 1 c a r b e n d a z i m d e g r a d i n gb a c t e r i u mn y 9 7 1t h e 1 6 sr d n aw a s a m p l i f i e db yp c rt h e nc l o n e di n t op m d l 8 一tv e c t o ra n ds e q u e n c e d u s i n g 1 v a b s t r a c t b l a s ts o f t w a r e , c o m p a r i s o nr e s u l t ss h o w e di s o l a t e dn y 9 7 - ls h o u l db e i d e n t i f i e da sb 口c 讲淞p l 删i f 嬲 2 i n o r d e rt oc o n s t r u c tt h e p r o m o t e rg e n el i b r a r i e s o fb p u m i l u s d i g e s t e df r a g m e n t so f t o t a ld n a o f n y 9 7 - it h a tw a sd i g e s t e db ys a u 3 a 1w a s l i g a t e dt op u c 19 一g f pt h a tw a sd i g e s t e db yb a m hi ，a n dt h ep r o d u c tw a s t r a n s f o r m e dt ot h ee c o l id h 5 ac o m p e t e n tc e l l s s e l e c t e dt w o s t r o n gp o s i t i v e c l o n e s ，s u b c l o n e db p u m i l u sp r o m o t e rf u n c t i o n a lf r a g m e n t sf 4 ，f 5 ，a n dt h e n c o n s t r u c t e de s c h e r i c h i ac o l i b a c i l l u ss h u t t l ev e c t o rp n w 3 3 n f 4 一g f p 、 p n w 3 3 n f 5 - g f p t h e y w e r et r a n s f o r m e di n t o c a r b e n d a z i m d e g r a d i n g b a c t e r i u mb a c i l l u s p u m i l u m n y 9 7 - 1 b ye l e c t r o p o r a t i o n t h e y w e r e e x p r e s s e dw e l li nn y 9 7 1t h r o u g hf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e t h ef u n c t i o n a l f 4f 5s h o w e dc o n s t i t u t i v e p r o m o t e r e l e m e n t s t h er e s u l t s p r o v i d e d f u n d a m e n t a ld a t aa n dm a t e r i a l sf o rt h ef u r t h e r s t u d yo nt h ee c o l o g i c a l b e h a v i o ro f c a r b e n d a z i m d e g r a d i n gb a c t e r i u mn y 9 7 1 3 c a r b e n d a z i ma n a l y s i s ：c a r b e n d a z i mi nc u l t u r em e d i u mw a sa n a l y z e d b yh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r 印h y ( h p l c ) w i t ha nh vd e t e c t o r s a m p l ep r e p a r a t i o n ：c u l t u r em e d i u mw e r es a m p l e da f t e rr e a r i n gf o r2 4h r s ， d e c a n t e da n dc e n t r i f u g e da t1 2 ，0 0 0 9f o r5m i na t4 c ，a n dt h e ns u p e m a t a n t f l u i do f1 o m lw a sc l e a n e du p t h r o u g hs p e - c l8c o l u m n ( 5 0 0 m g ) ，w h i c h w a sc o n d i t i o n e dw i t h4 0 m la c t o n e ，m e t h a n o la n dd i s t i l l e dw a t e r r e s p e c t i v e l yi na d v a n c e a d d i n g1 0m ls a m p l ea n de l u t e d w i t hc a 2 m l m e t h a n o l ，t h ev o l u m ea d j u s t e dt o3 0 m lw i t hm e t h a n 0 1 c a l i b r a t i o nc u r v e ： c a r b e n d a z i ms t a n d a r dw a sf i r s ts o l u t e dw i t hd r o p sd i l u t e dh y d r o c h l o r i ca c i d s o l u t i o n ( 1 ：1 1 ，v v ) a n dt h e ns t o c ks o l u t i o no fc a r b e n d a z i mw a sp r e p a r e di n m e t h a n o la t10 0 0 m g l w o r k i n gs o l u t i o n so f p e r t i n e n t c o n c e n t r a t i o n s ( 1 ，1 0 ，1 2 5 ，2 5 ，3 0 m g l ) w e r em a d eb yas e r i a ld i l u t i o no fs t o c ks o l u t i o n sw i t h m e t h a n 0 1 a l ls t a n d a r da n ds t o c ks o l u t i o n sw e r es t o r e di ng l a s s s t o p p e r b o t t l e sa t4 c t h es p i k e ds a m p l ep r e p a r e db ya d d i n gk n o w na m o u n to f c a r b e n d a z i ms t o c ks o l u t i o n st oc u l t u r em e d i u m t h ec a l i b r a t i o nc u r v ew a s m a d e b yi n j e c t i n g k n o w nc o n c e n t r a t i o n so fw o r k i n gs o l u t i o n so f c a r b e n d a z i m c a r b e n d a z i mw a sq u a l i f i e dt h r o u g hc o m p a r i n gt h er e t e n t i o n v 曼! ! 竖堡! ! 壁! 壁! ! ! ! 竺! ! ! ! 兰! 竺! ! l 墅塑! ! g ! 竺! ! 塑! 竺! ! 翌塑苎q ! ! 里坐! ! g t i m eo fs t a n d a r d sa n ds a m p l ep e a k s t h ec o n c e n t r a t i o nw a sc a l c u l a t e du s i n g t h es t a n d a r dc a l i b r a t i o nc u r v eo fc a r b e n d a z i m h p l cc o n d i t i o n ：t h e c h r o m a t o g r a p h i c c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：k r o m a s i lc18 5 9 m ( 2 5 0 x 4 6 m m ) ( i d 5 “) t h em o b i l ep h a s ew a sm e t h a n o l ：w a t e r ( 9 0 ：1 0v v ) a tf l o wr a t eo f0 8 m l m i n t h ei n j e c t i o nv o l u m ew a s2 0bla n dh vd e t e c t o r w o r k e da t2 8 4 n m 4 t h ei n f l u e n c eo fe n v i r o n m e n t a lf a c t o r so nt h ep e r f o r m a n c eo f c a r b e n d a z i md e g r a d a t i o n b yb a i l l u s p u m i l u ss t r a i nn y 9 7 - 1w a si n v e s t i g a t e d f o rt h i sp u r p o s e ，e x p e r i m e n t sw e r ec o n d u c t e du n d e ra e r o b i cc o n d i t i o n s ，a n d c a r b e n d a z i md e g r a d a t i o np e r c e n t a g ei nc u l t u r em e d i u mw a sc h a r a c t e r i z e db y h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) w i t hh vd e t e c t o r a ni n i t i a l c a r b e n d a z i mo f10 ，3 0 ，5 0 ，10 0 ，3 0 0 m g l w e r ef o r t i f i e di nm i n e r a ls a l t m e d i u m ( p h7 0 ) w i t ht h ed e g r a d a t i o nr a t eo f4 2 4 4 ，4 8 9 7 ，7 7 1 9 ，7 8 6 6a n d 9 0 0 7 w e r eo b t a i n e di n2 4h r sr e a r i n ga t3 0 c s u p p l e m e n t i o nw i t hl i r l e a m o u n to fo r g a n i cn i t r o g e n o u ss o u r c eh a das i g n i f i c a n te f f e c to nt h e c a r b e n d a z i md e g r a d a t i o n ，w h i l et h e i n o r g a n i cn i t r o g e n o u s s o u r c eh a d n e g a t i v ee f f e c t c a r b e n d a z i md e g r a d a t i o nr a t ev a r i e df o r m6 1 5 5 t o8 7 7 6 w h e np hv a l u ew i t h i nt h er a n g eo f4 10a f t e ra d d i t i o no fo r g a n i cn i t r o g e n ， t h el o w e s tc a r b e n d a z i md e g r a d a t i o np e r c e n t a g eo f61 5 5 w a so b t a i n e do n t h ep h4 c a r b e n d a z i md e g r a d a t i o na b i l i t yw a se n h a n c e dw i t ht e m p e r a t u r e i n c r e a s i n g f u t u r ec h a r a c t e r i z a t i o no fs t r a i nn y 7 9 一lp r o v i d e sa l lo p p o r t u n i t y f o ri t sd e v e l o p m e n ti nb i o r e m e d i a t i o no f c a r b e n d a z i mc o n t a m i n a t i o n 5 t h ee f f e c to fn y 9 7 - 1f e r m e n t a t i o no nt o x i c i t yo fc a r b e n d a z i mt o d i f f e r e n tp a t h o g e n sw a sm e a s u r e d t h er e l a t i v ei n h i b i t i o nr a t e so ft h e n y 9 7 - la g a i n s tf u s a r i u mo x y s p o r u m ( s c h t ) fs p l y c o p e r s i c i ( s a c c ) s n y d e r e th a n s e n f u s a r i u mo x y s p o r u m ( s c h l ) f s p v a s i n f e c t u m ( s n y d e th a n s ) f u s a r i u mo x y s p o r u m f s p n i v e u mn e s m i t h ) s n y d e re th a n s e n ，f u s a r i u m s p , f u s a r i u ms p , f u s a r i u mo x y s p o r u m ( s c h z ) f s p c u c u m e r i n u mo w e nw e r e 5 0 8 ，5 0 8 ，5 4 1 ，3 7 5 ，31 6 ，4 2 5 6 d e g r a d a t i o na b i l i t yo fc a r b e n d a z i ma n db i o c o n t r o le f f i c a c ya g a i n s t s i xf u s a r i u mw i l td i s e a s e so fm u l t i f u n c t i o n a lb a c t e r i a ls t r a i nn y 9 7 1w a s v i a b s t r a c t e s t i m a t e d t h ee c 5 0e s t i m a t e so f1 0 n y 9 7 一lf e r m e n t a t i o n c a r b e n d a z i m m i x t u r e si n c r e a s e da t3 da n d7 dc o m p a r e dt ot h o s ei nt h et r e a t m e n t sw i t h c a r b e n d a z i ma l o n e ，s h o w e dad e c r e a s e de f f e c tt ot h ep a t h o g e n s 7 a c t i v i t yo fa n t i - o x i d a t i v ee n z y m e so fc u c u m b e r ( c u c u m i ss a t i v u sl ) w h e nc a r b e n d a z i mw a s a p p l i e da ss o i ld r e n c ha tad o s a g eo fo ，5 ，5 0a n d1 0 0 n a gk g - 1w a sd e t e r m i n e d t h ec h a n g e si nt h ea c t i v i t yo fs u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，c a t a l a s e ( c a t ) a n dg l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ( g p x ) e n z y m e sw e r e m e a s u r e di nt h er o o t s s t e m sa n dl e a v e so fc u c u m b e r n ep l a n t sw e r e s a m p l e d a tt h ec o t y l e d o np h a s e ( 1 4d a y s ) a n dt h ef l o r e s c e n c ep h a s e ( 5 6d a y s ) as t r o n gc o r r e l a t i o nb e t w e e na n t i o x i d a n tc o n t e n ta n dc a r b e n d a z i m c o n c e n t r a t i o nw a so b s e r v e d a sc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d t h ea c t i v i t i e so f s o da n dc a ti n c r e a s e di nr o o t sa n dl e a v e s i ns t e m s s o da n dc ：a t a c t i v i t i e sw e r ei n c r e a s e di nt h ef l o r e s c e n c ep h a s ea n dt h e nd e c r e a s e di nt h e c o t y l e d o np h a s e t h ec o n t e n to fg p xi n c r e a s e db o t hi nr o o t sa n ds t e m s a n d d e c r e a s e di nl e a v e s h i g h e rl e v e l so fs o d c a ta n dg p xw e r eo b s e r v e di n c u c u m b e rc o t y l e d o n st h a ni nt h eo l d e rl e a v e s t h ep r e s e n ts t u d ys u g g e s t st h a t c a r b e n d a z i mt r e a t m e n t sh a dd i f f e r e n te f f e c t so nt h ec u c u m b e ra n t i o x i d a n t s y s t e mi nd i f f e r e n tt i s s u e s i tw a sc o n c l u d e dt h a tc o t ) r l e d o n sm i g h tp l a ya n i m p o r t a n tr o l ei ns t r e s sa d a p t a t i o na st h ec a r b e n d a z i mc o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e d ，a n dt h ea b i l i t yo fm a t u r ec u c u m b e rt om a i n t a i nab a l a n c eb e t w e e n t h ef o r m a t i o na n dd e t o x i f i c a t i o no fa c t i v a t e d o x y g e ns p e c i e s s e e m e d e n h a n c e d o nt h eb a s i so fo u ro b s e r v a t i o n s ，w ec o n c l u d et h a ti n c r e a s e ds o d ， c a ta n dg p xa c t i v i t i e sp r o v i d ep l a n t sw i t hi n c r e a s e dc a r b e n d a z i ms t r e s s t o l e r a n c e k e y w o r d s ：c a r b e n d a z i m ；b i o d e g r a d a t i o n ；b a c i l l u sp u m i l l u s ；g f p ； a n t i o x i d a n ts y s t e m v i i 承诺书承话吊 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师指导 下独立完成的，学位论文的知识产权属于山西大学。如 果今后以其他单位名义发表与在读期间学位论文相关 的内容，将承担法律责任。除文中已经注明引用的文献 资料外，本学位论文不包括任何其他个人或集体已经发 表或撰写过的成果。 学位论文作拳。磐：张丽诊 2 0 0 7 年f 月日 7。、 第一章前言 第一章前言 我国是一个农业大国，为保证产量，人们广泛使用各种杀虫剂、杀菌剂、除草 剂等有机化合物。这些化合物品种繁多，结构复杂，且大多数及其中间代谢产物有 毒，具有致畸、致癌、致突变的作用，对生态平衡和人类生存造成很大的威胁。微 生物由于其在生物圈进化中发挥着巨大的作用，地球上天然的以及合成的各种物质 最终均可以被微生物利用。利用高效降解菌治理环境污染不仅成本低，见效快，且 不会造成二次污染。因此生物降解在治理环境污染越来越受到人们重视。近年来， 国内外学者在生物降解菌的分离及生物修复应用研究方面得到了较大进展。本文就 生物降解研究方案的确定、实验方法的设计、及生物修复应用等方面介绍了研究微 生物降解能力时的思路与方法。 1 生物降解 1 1 微生物在生物圈进化中的作用 微生物体积小、分布广、表面积大、新陈代谢旺盛、基因多样性、生长速率快、 无可比拟的酶产物及营养成分，使微生物在生物圈进化进程中发挥着巨大的作用。 在p h 、温度、盐度、氧压、氧化还原电位、水压等物理化学条件千差万别的环境中 分布着各种各样的有机物( 如碳水化合物、脂肪、蛋白、磷脂、核酸、碳氢化合物 等) 和无机物( 如s 、n 儿、h 2 、c h 4 等) ，这些资源和环境条件的选择压力使微生物进 化多样性成为可能。最终地球上天然的以及合成的各种物资均可以被微生物利用。 1 2 生物降解及生物降解能力 有机化合物的生物降解是指在微生物作用下其分子结构被部分简化或完全破 坏。通常通过实验室摇瓶接种微生物纯培养体、混合微生物培养体或环境样品( 如 土壤、水、污泥、工业废水) ，利用化学方法和生理方法来检测生物降解。在判断生 物降解和检测生物降解能力之前需调查采样点附近的环境背景值，这样才能对可能 的底物和产物心中有数。此外，只有当热力学熵值达到阈值时，微生物的催化反应 才能进行。 生物降解能力是指在微生物作用下底物变化的具体数量，底物可以是有机物， 也可以是无机物。底物的变化由以下几个原因引起：一，微生物生长必需的细胞内 或细胞外酶促反应，如该反应底物作为碳源、氮源、能源或电子接受体；二，发挥 积极作用的酶促反应，如可分解代谢细胞周围有毒物质的酶促反应；三，对微生物 多菌灵降解菌的降解特性及g f p 标记 生长没多大作用的酶促反应，如共代谢反应中底物诱导产生的酶会意外地破坏其它 化合物的分子结构；四，微生物次生代谢物的非酶促反应能引起地球化学变化，如 氧气消耗、次生代谢产物发酵、酸碱度改变。 1 3 生物降解与微生物生理活动 生物降解的检测指标通常包括细胞生长速率、底物减少量、电子终受体的消耗 数、中间代谢产物和代谢终产物的生成量。用“生物降解”这一术语而非“生理分 析”这一术语，原因在于：一，检测对象适用于野外采集到的样品。如土壤、水、 污泥、工业废水等；二，降解底物化学结构与微生物新陈代谢产物的结构不同；三， 降解底物的环境浓度较低( l m gl - 1 ) ；四，当研究微生物的自然种群时，种群密度 对新陈代谢的影响作用未知。五，当研究微生物纯培养体对污染物的降解时，已分 离出了具有降解能力的菌株。 1 4 检测生物降解能力的原则 设计的生物降解方案要确保能确定、证明、探究发生的纯化学变化和微生物使有 机污染物发生一系列变化的胞内反应的细节。图1 概括了生物降解研究的目的、规 则、方法。 根据研究的深度分为两个阶段。阶段一将环境样品如土壤、水、污泥等当作一个 “黑箱”，通过人为添加污染物来研究其是否会降解。阶段二以分离纯化的具有降解 能力的菌株为研究对象，研究其生理学、酶学、分子学方面的特性，最终的目的是 揭示生物降解基因表达及调控的分子机理。 表1 生物降解设计方案的两个阶段及步骤 f i g 1 t w op h a s eo fp r o c e d u r e sf o ru n d e r s t a n d i n gb i o d e g r a d a t i o n 2 第一章前言 第一阶段：从环境样品开始，实验室富集培养并证明代谢污染化合物的能力 1 野外采集土壤、水、污泥等样品。 2 无污染的采集样品并运回实验室。 3 分别设定生物降解处理和非生物反应对照。 4 如果有必要，人为添加放射性同位素标记的或无标记的待测污染物【l l 。 5 定期应用分析化学法和生理指标法检测待测污染物和共反应剂的消耗 量、代谢物的生成量、生理代谢的终产物【2 l 。 6 比较生物降解处理和非生物反应对照中获得的时间过程数据。 7 进一步分析解释变化的原因 第二阶段；分离纯化培养菌，分别从生理、生化、分子角度 研究污染物新陈代谢情况 8 分离纯化具有降解能力的微生物【3 】。 9 研究分离菌株在污染物存在时的生长速率、生物量、诱导表达特性等生 理特性1 4 5 酣。 1 0 提取、鉴定与污染物代谢相关的代谢产物、酶及共反应因子i 刀。 1 1 无细胞条件下检测代谢产物、酶及共反应因子例。 1 2 通过克隆d n a 文库、转座子突变等技术确定与污染物代谢相关的基因 组、质粒d n a 。 1 3 通过杂交、限制性酶切图谱、d n a 序列分析等技术寻找开放阅读框、 相似基因的系统进化关系等关键信息【1 0 1 。 1 4 通过转座子突变、构建克隆表达载体、擦入失活、诱导表达、报告基 因等手段阐明基因表达及调控细节【i l 】。 1 5 利用环境样品和纯