（微生物学专业论文）深海细菌shewanella+piezotolerans+wp3铁离子调控因子—fur调控蛋白功能研究.pdf

摘要 摘要 深海是一个特殊的生态环境，这里不仅低温、高压、黑暗、寡营养，而且氧 气浓度也较低。深海特殊的生态环境造就了生活在该环境下生物的特异生理代谢 特性，研究该生态系统下的微生物的生理特性，对于了解极端微生物的生活特性， 极端微生物资源的开发利用具有重要的意义。 本文所研究的细菌s h e w a n e l l ap i e z o t o l e r a n sw p 3 为一株分离自西太平洋 1 9 1 4 米深海沉积物中的一株革兰氏阴性菌。w p 3 为一杆状的兼性厌氧菌，属于 r - p r o t e o b a c t e r i u m ，具有5 5 个编码细胞色素c 的基因，比s h e w a n e l l ao n e i d e n s i s m r - i ( 4 2 个编码细胞色素c 基因) 多1 3 个。在有氧培养条件下，w p 3 的菌体 呈现淡紫色，同时逆转录p c r 实验的结果也表明这些细胞色素c 在有氧条件下 也具有一定程度的转录。这个结果表明即使在有氧条件下，w p 3 的厌氧呼吸途 径也在起作用并为其提供生命活动所必须的能量来源。这些细胞色素c 很可能 对w p 3 适应低氧气浓度这一深海特异的生长环境因子具有重要的生理学意义。 如何维持好细胞内的f e 离子浓度的平衡对于所有的细菌均具有重要的生理 意义：一方面，生命活动离不开铁离子。铁离子是一些功能蛋白的结构组成成分， 如异柠檬酸脱氢酶亚基中的f e s 结构域，它还是细胞内重要代谢的催化因子如 d n a 代谢，t c a 循环，糖酵解等都离不开铁离子的参与；另一方面，铁离子尤 其是还原态的二价铁离子浓度过高容易通过f e t o nr e a c t i o n 导致细胞的氧化损 伤。w p 3 的特意的生理特性及其所生活的环境决定了研究w p 3 中f u r 如何调控 细胞内铁离子水平更具重要意义。一方面，w p 3 相对于普通细菌，需要更多的 铁离子。w p 3 所具有的特异的厌氧呼吸途径上的大量细胞色素c 的成熟需要大 量的铁离子的参与，不仅如此w p 3 能够以f e 3 + 作为最终电子受体进行厌氧呼吸。 另一方面，w p 3 所处的原生活环境中可直接利用的铁离子浓度低，铁离子一般 以固态化合物形式大量存在于深海沉积物中而非海水中。与铁离子的存在形式相 反，硫酸盐在深海环境中的浓度高。所以深海是一个低可溶性铁离子高硫酸盐的 特异生理环境。 f u r 是存在于大部分细菌中的调控细胞内f e 离子浓度平衡的一个调控因子， 具有多样的调控方式对目的基因的转录进行调控。同样在w p 3 基因组中，我们 也找到了一个胁基因。为了研究w p 3 的铁离子平衡调控，我们构建了一株f h r 基 摘要 因缺失突变的w p 3 ，简称f u r 。通过基因芯片研究我们发现在w p 3 中该基因具 有重要生理作用，该基因的删除导致了大量基因的差异表达。f u r 的基因芯片结 果与低f e 离子浓度培养的基因芯片结果对比发现：虽然这两个芯片实验的数据 中差异表达的基因中与铁离子转运相关的基因表达方向具有较好的一致性，证明 f u r 在w p 3 中主要起调控细胞内铁离子平衡的作用。但是还有大量的基因在这 两组数据中表达的方向相反，表明如r 的缺失突变与缺铁培养所造成w p 3 的生 理状态具有较大的差异。通过分析，我们发现很可能是细胞内f e 2 + 浓度的不一样 造成。与其他菌株的f u r 调控因子缺失突变结果相似，h 2 0 2 的耐受性实验中f u r 存活率大大低于野生w p 3 ，表明了f u r 细胞内过高f d + 浓度导致更加剧烈的f e t o n r e a c t i o n 反应进而杀伤细胞。通过检测细胞内的f e 2 + 浓度，我们发现缸的缺失 突变的确导致细胞内f d + 水平的上升。 不仅如此，通过检测f u r 突变株的厌氧代谢生长状况发现f u r 的删除突变造成 厌氧呼吸速率受到影响。这是首次发现f u r 的删除突变会影响到希瓦氏属细菌的 厌氧呼吸速率。通过基因芯片数据的分析，发现这很可能是由于血红素合成途径， 及细胞色素c 成熟途径上的基因下调。我们比较了f u r 突变株与野生w p 3 厌氧 条件下的细胞色素c ，发现所有的细胞色素c 的含量在f u r 突变株中均低于野生 w p 3 而不是单个或某些细胞色素c 的低表达所致。通过在以血红素为添加剂的 f u r 培养及c c m c 的删除突变，证实细胞成熟途径上基因的下调很可能就是导致 f u r 厌氧呼吸能力削弱的主要原因。 在本论文中，我们第一次在深海细菌中发现，硫酸盐同化途径对于其铁离子 的吸收具有重要作用。在f u r 突变株中我们发现，与硫酸盐同化作用进而产生半 胱氨酸的代谢途径上的基因全面上调。我们删除掉了该代谢途径上的c y s g 基因 得到了一个c y s g 突变，同时删除了该途径上的c y s n 和c y s d 两个基因，构建了 抑制c y s n d 突变。对这两个突变子的检测发现他们对w p 3 吸收环境中低浓度的 铁离子均具有重要作用。半胱氨酸是合成s i d e r o p h o r e s 所必须的，而s i d e r o p o r e s 是细菌铁离子转运所必须的化合物，所以半胱氨酸对于f e 离子的转运具有重要 的作用。在细菌中半胱氨酸的获得途径比较多样，其中最主要的是通过其他氨基 酸转化或直接从外界吸收而来，通过硫酸盐同化途径仪仅是细菌获得半胱氨酸的 个不重要的分支。我们分析硫酸盐同化途径对于w p 3 的铁离子吸收很重要， 这是由于在深海寡营养的生态环境下w p 3 可直接利用的得半胱氨酸很少而硫酸 摘要 盐相对丰富，通过硫酸盐同化途径合成半胱氨酸对w p 3 适应其所生活的深海环 境具有重要意义。 关键词：s h e w a n e l l a p i e z o t o l e r a n sw p 3 ；f u r 调控因子；基因芯片；细胞色素c ； 铁离子； i a b s t r a c t a b s t r a c t d e e p - s e ai sas p e c i a le c o s y s t e mf o ri t sp e r m a n e n tc o l d n e s s , h i g hp r e s s u r e ， d a r k n e s s ，l o wi nt h en u t r i e n ta n do x y g e n t h es p e c i a lm e t a b o l i cc h a r a c t e r i s t i c so f d e e p s e am i c r o b e sa r ed e t e r m i n e db yt h i ss p e c i a ld e 印一s e ae c o s y s t e m i ti si m p o r t a n t t os t u d yt h ep h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fd e e p s e am i c r o b e sf o ru n d e r s t a n d i n g s p e c i a la s p e c t so fd e e p s e am i c r o b e sa n de x p l o i t a t i o no f e x t r e m em i c r o b i a lr e s o u r c e t h ed e e p s e ab a c t e r i u mu s e di nt h i ss t u d yw a si s o l a t e df r o md e e p - s e as e d i m e n t s o f1914 md e p t hi nw e s tp a c i f i c t h ep h y l o g e n e t i ea n a l y s i sa n dm o l e c u l a rs t u d ys h o w s t h a tt h eb a c t e r i u mi sap s y c h r o p h i l i ca n dp i e z o t o l e r a n tm i c r o b ew i t ht h et e r m 勰 s h e w a n e l l ap i e z o t o l e r a n sw p 3 w p 3b e l o n g st oy - p r o t e o b a c t e r i u ma n dc o n t a i n s5 5 c y t o c h r o m ecg e n e s ，w h i c ha r e1 3m o r et h a ns h e w a n e l l ao n e i d e n s i sm r - 1 t h e s t r a i n sc o l o ra n dr t - p c rr e s u l t so fc y t o c h r o m ecg e n e si n d i c a t et h a tt h e s e c y t o c h r o m ecp r o t e i n sa r ee x p r e s s e da n df u n c t i o n a sp r o v i d e ro fe n e r g yf o rw p 3e v e n u n d e ra e r o b i cc o n d i t i o n t h e s ec y t o c h r o m ecg e n e sa r es u p p o s e dt ob ei m p o r t a n tf o r i t sa d a p t a t i o nt os u b a n a e r o b i cd e e p - s e ae n v i r o n m e n t t h ep h y s i o l o g i c a li r o nh o m e o s t a s i si si m p o r t a n tf o ra l lm i c r o b e sf o rt w or e a s o n s f i r s t , i r o ni si m p o r t a n t i ti sn o to n l yc o m p o n e n to fs o m ep r o t e i n s ，s u c ha si s o c i t r a t e d e h y d r o g e n a s e ，b u t a l s ot a k e sp a r ti nd n am e t a b o l i s m ，t c ar e c y c l ea n dg l y c o l y s i se t a la st h ec o f a c t o r a n di r o ni sa l s ot o x i c f e 冲c a np r o d u c eh i g h l yr e a c t i v eo x y g e n s p e c i e st h r o u g hc a t a l y z i n gf e n t o nr e a c t i o n s ok e e p i n gi r o nh o m e o s t a s i s i si m p o r t a n t f o rm i c r o b e s s e c o n d w p 3n e e d sm o r ei r o nt h a no t h e rn o r m a ls t r a i n sf o ri tc o n t a i n s m u c hm o r ec y t o c h r o m ec sw h i c hn e e dm o r ei r o nf o rt h e i rm a t u r a t i o n ，a n de n e r g y p r o d u c i n gw h i l et h ed e e p - s e ae n v i r o n m e n tc o n t a i n sl o w e ri r o nl e v e l s t h ep h o fs e a w a t e ri sh i g h e rt h a nf r e s h w a t e r , al i t t l eh i g h e rt h a n7 0 ，a n dd i f f i c u l tf o rt h ed i l u t i o no f f e 3 + s ot h eb i o a v i l a b l ei r o ni sl e s si nd e e ps e at h a no t h e re n v i r o n m e n t s d i f f e r e n t f r o mi r o n ，t h ec o n c e n t r a t i o no fs o ? - i sh i g hi nd e e ps e ae n v i r o n m e n t s o ，t h ed e e ps e a e n v i r o n m e n tc o n t a i n sl e s ss o l u b l ei r o na n dm o r e5 0 4 2 。i tw o u l db ei n t e r e s t i n gt o k n o wh o ww p 3c o n t r o li r o nh o m e o s t a s i sf o rs u c hb a l a n c e i ti sr e p o r t e dt h a tf u ra c tt h r o u g hd i v e r s er e g u l a t i o nw a y sa sa l li n t r a c e l l u l a ri r o n h o m e o s t a s i sr e g u l a t o r t h i sr e g u l a t o re x i s t si nm o s to fm i c r o b e s ，s oa si n 帅3 af u r c o d i n gg e n e s w p 2 9 3 8w a sf o u n di nw p 3 sg e n o m ea n dk n o c k e do u tt oc o n s t r u c ta m u t a n t - f u rm u t a n t i no u rs t u d y , m i c r o a r r a yt e c h n o l o g yw a sa p p l i e dt os t u d yt h e f u n c t i o n so ff u ro fw p 3 a n df u n c t i o n so ff u rw e r ef o u n dd ok e e p i n gt h ei r o n i v a b s t r a c t h o m e o s t a s i s ，t h r o u g hc o m p a r i n gf u r w p 3a n dw p 3w i t hi r o nd e p l e t i o n w p 3w i t h i r o nr e p l e t i o nt h e s et w om i c r o a r r a yr e s u l t s h i g h e ri n t r a c e l l u l a rc o n c e n t r a t i o no ff e 2 + i nf u rm u t a n tw a si n d i c a t e db ym i c r o a r r a yr e s u l t sc o m p a r i s o n a n dt h i ss u s p e n s i o n w a sd i r e c t l yd e m o n s t a t e db yi n t r a c e l l u l a rv e + c o n c e n t r a t i o nl e v e l sc o m p a r i s o n b e t w e e nf u rm u t a n ta n dw p 3 t h ea n a e r o b i cr e s p i r a t i o na b i l i t i e sw e r ew e a k e n e di nf u rm u t a n t ，a n dt h i si st h e f i r s tr e p o r tw h i c hd e s c r i b e s f u rg e n ed e l e t i o ni m p a c t sa n a e r o b i cr e s p i r a t i o na b i l i t i e so f s h e w a n e l l as p e c i e s i no u rs t u d y , t h eg e n e s d o w n r e g u l a t i o no fb o t hh e m eb i o s y t h e s i s p a t h w a y a n dc y t o c h r o m ecm a t u r a t i o np a t h w a yw e nf o u n d a n db o t ho ft h e mw e r e p o s s i b l et oc o n t r i b u t et oi m p a c t i o no fa n a e r o b i cr e s p i r a t i o n t h r o u g has e r i e so f e x p e r i m e n t sa n da n a l y s i s ，t h a tt h ed o w nr e g u l a t i o no fc y t o c h r o m ec m a t u r a t i o ng e n e s w a st h em a i nf a c t o rl e a d st oi m p a c t i o no ff u rm u t a n t sa n a e r o b i cr e s p i r a t i o na b i l i t i e s w a sd e m o n s t r a t e db yo u rs t u d y i no u rs t u d y , t h ec o n t r i b u t i o no fs u l f a t ea s s i m i l a t i o nt oi r o nt r a n s p o r t a t i o ni nd e e p s e ab a c t e r i u m w p 3w a sf i r s t l ys t u d i e d g e n e si na s s i m i l a t i o no fs u l f a t ep a t h w a yw e r e a uu pr e g u l a t e di nf u rm u t a n t ，w h i c hc a t c hu po u ri n t e r e s t i no r d e rt o t e s tt h e i r r e l a t i o n s h i pw i t hw p 3 si n t r a c e l l u l a ri r o nh o m e o s t a s i s ，g e n e si nt h i sp a t h w a yw e r e s t u d i e d t w om u t a n t sw e r eg o tt h r o u g hk n o c ko u tc y s gg e n ea n dc y s n - dg e n e s ，a n d t h ep h y s i o l o g i c a lt e s ti n d i c a t e dt h o s eg e n e sw e r ei m p o r t a n tf o rt r a n s p o r t a t i o no fi r o n i nw p 3 s t r a i n s c y s t i n ei si m p o r t a n tf o rt r a n s p o r t a t i o no fi r o n ，b e c a u s ei ti st h em a i n s u b s t a n c ef o rs i d e r o p h o r e sb i o s y t h e s i s b u tb a c t e r i au s e dt og e tc y s t i n et h r o u g h t r a n s f o r m a t i o no fo t h e ra m i n oa c i do rd i r e c t l ya b s o r bi tf r o mc u l t u r e ，n o tt h r o u g h a s s i m i l a t i o no fs u l f a t e t h ei m p o r t a n c eo fs u l f a t ea s s i m i l m i o np a t h w a yi nw p 3r e l a t e s t oi t ss p e c i a ll i v i n ge n v i r o n m e n t - d e e ps e ae c o s y s t e mw a ss u g g e s t e di no u rs t u d y t h e l o wi nn u t r i e n t sa n dh i g hc o n c e n t r a t i o no fs u l f a t ei nd e e ps e ae n v i r o n m e n t ，d e t e r m i n e s w p 3c a nn o tg e te n o u g hc y s t i n et h r o u g hu s u a lp a t h w a y s ，b u ts u l f a t ea s s i m i l a t i o n s o p r o d u c i n gc y s t i n et h r o u g ht h ea s s i m i l a t i o no f s u l f a t ei sas p e c i a lc h a r a c t e ro fd e e p - s e a a d a p t a t i o nf o rw p 3 k e y w o r d s ：s h e w a n e l l ap i e z t o l e r a n sw p 3 ，f e r r i cu p t a k er e g u l a t o r ( f u o ，m i c r o a r r a y , c y t o c h r o m ec ，i r o n v 缩写词表 b p p c r d n t p d d h 2 0 r ap p c r d n a r n a g + c m 眦 t a q t e 秭s d e p c 肛垭 g t c m o p s 心 姆 t e m e d s d s p l a g e c y 3 - d c t p c y 5 一d c t p r n a s i n m 衅 u p l ，u p 2 k b m m m i u i 缩写词表( a b b r e v i a t i o n s ) b a s ep a i r 碱基对 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 d e o x y r i b o n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e 脱氧核苷三磷酸 d o u b l ed i s t i l l e dw a r e 双蒸水 r n a a r b i t r a r i l yp r i m e dp c rr n a 随机引物p c r d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 r i b o n u c l e i ca c i d 核糖核酸 g 啪i l l e + c y t o s i 鹏鸟嘌呤+ 胞嘧啶 n 诅f k e r 分子量标记 t r i s a c e t a t ee l e c t r o p h o r e s i sb u f f e rt r i s 醋酸电泳缓冲液 t h e r m o sa q u a t i c u s 热聚合酶 t r i s e d t at r i s e d t a 缓冲盐溶液 t r i s ( h y d r o x y m e t h y i ) a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 d i e t h y p y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙脂 i 良- m e r c a p t o e t h a n o l9 一巯基乙醇 g u a n i d i n et h i o c y a n a t e 异硫氰酸胍 3 羽蚺m o r p h o l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i ca c i d3 - ( n - 吗啉代) 丙磺 酸 a m m o n i u mp e r s u l f a t e 过硫酸胺 a l k a l i n ep h o s p h a t a s e 碱性磷酸酶 n ，n ，n j n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n en ，n ，n ，n 一四甲基 乙二胺 s o d i 2 u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 c y 3 标记的胞嘧啶脱氧核苷三磷酸 c y 5 标记的胞嘧啶脱氧核苷三磷酸 r n a s ei n h i b t o rr n a 酶抑制剂 m a g e p a 兆帕 u n i v e r s a lp r i m e r l , 2 通用引物1 ，2 k i l o b a s e 千碱基对 m i l m o l a r 毫摩尔 m i l i l i t r e 毫升 m i c r o l i t r e 微升 缩写词表 ug m l n o i 强 r p m s w v a a d t t e d t a d m s o i p t g x g a i m r n a o d r n a s e r t p c r b s a c d n a d m s o 最c o l i l b m i c r o g r a m 微克 m i n u t e 分钟 o p e nr e a d i n gf r a m e 开放读码框 r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 转分钟 s e c o n d 秒 w e i g h t v o l u m e 重量体积 a m i n oa c i d 氨基酸 d i t h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醇 e t h y l e n ed i a m i n e - t e t r a - a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲亚砜 i s o p r o p y l t h i o - d - g a l a c t o s i d e 异丙基一d 半乳糖苷 5 一b r o m o - 4 - c h o r o - 3 一i n d o l y l p i ) 呻l a c t o p y r a n o s i 5 溴4 - 氯- 3 吲哚b d - 半乳糖吡喃 m e s s e n g e rr i b o n u e l e i ca c i d 信使核糖核酸 o p t i c a ld e n s i t y 光密度 d b o n u c l e a s er n a 酶 r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p c r 反转录聚合酶链式反应 b o v i n es e r u ma l b u m i n 小牛血清白蛋白 c o m p l e m e n t a r yd n a 互补d n a d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲亚砜 e s c h e r i c h i ac o l i 大肠杆菌 l u d ab o r t hm e d i u m 肉汤培养基 i 厦门大学学位论文原创性声明 另外，该学位论文为( 蠢湘 ) 课题( 组) 的研究成果，获得( 商7 ；f 仪) 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在( 武际且 ) 。实l 验 室i 完成。( 请在以上括号内填写课 声明人( 签名) ：剞。 沙1 年e 朔31 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦f - 1 x 学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 | ( 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“ 或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) 习蜂 沙1 争明3 7 日 f 前言 1 前言 1 1 深海微生物研究概况 1 1 1 深海环境的特点 海洋是地球生命的摇篮，生物进化的历程表明，地球上的生命起源于海洋。 它覆盖着地球表面积7 1 ，海水总体积占地球总水量9 7 ，提供了了生物9 9 的 可栖息生境。它不但是海洋生物的庇护所，而且主宰着地球的气候变化和物质循 环，是地球生态链中不可或缺的一环。海洋中生物资源极为丰富，生物活性物质 种类繁多，已引起世界各国的重视。仅在过去1 0 年中，有近5 ，0 0 0 种新的海洋天 然产物被发现，大多数都分离自海洋微生物，且许多是陆地生物所没有的，显示 出巨大开发潜力。因此，海洋微生物资源研究已成为海洋资源研究的重要内容之 一【l 】。 所谓深海，是指1 0 0 0 m 以下的海洋，营养相对贫乏，占地球海洋总体积的 7 5 。海洋的平均深度为3 8 0 0 m ，最深的海沟为11 0 0 0 m ，而6 0 0 0 m 以下的深海只 占海洋总体积的0 1 ，因此地球上绝大部分的深海都为1 0 0 0 - 6 0 0 0 m 深。深海 占据世界海洋8 5 的地域以及9 0 体积，其中7 9 的生物圈位于1 0 0 0 米以下。海 洋海底地貌主要包括：深海沉积物、深海热泉、冷泉、海底山、海沟、冷水珊瑚 及海绵礁等 2 ，3 】。海洋生态环境具有如下特征： 高压由于地球引力的作用，每下降1 0 米，压力就增加1 个大气压。因此生长 在5 ，0 0 0 米深度的生物，必须能耐受5 0 0 个大气压( 即5 0 m p ) 的压力。 低温除海底火山口及其附近的地方，深海的温度一般始终保持在3 1 范围内( 少数例外，如s u l u 海的海底温度为9 8 ，地中海的海底温度为1 3 5 ) ，有人称之为世界上最大的冷藏箱。在这里生存的生物必须能耐受低温。但在 海底火山口上及其附近的地方，温度高达1 0 0 - - - 4 0 0 ，在这里生活着世界上最嗜 热的微生物。 黑暗在l ，0 0 0 米以下的深海，完全没有太阳光，这里仅有的光线是少量的生 物发光和同位素产生的射线。因此在深海没有进行光合作用的生物存在。 寡营养由于光线只能到达水深3 0 0 米，因此光合作用也只能在3 0 0 米以上 前言 的海水中进行。据估计，海洋中光合作用产生的有机物9 5 在3 0 0 米以上被消耗。 在深度3 0 0 - - 1 ，2 0 0 米的海域内，4 的有机物被分解掉，只有1 的光合作用产物 可达1 ，2 0 0 米以下的深海和海底。 低氧浓度随着深度的增加，氧气在海水中的浓度逐步降低，并达到一个相 对低的稳定值，尤其是在深海沉积物中，随着深度的下降，氧气浓度急剧减少。 盐度深海的大部分地方的盐度同海水一样为3 左右。 总之，深海环境一般为高压、低温、黑暗、低氧浓度、高盐、寡营养，生活 在这种特殊环境下的微生物必然有特殊的生理代谢机制 2 】。由于深海的这些极 端特征，人们一直认为深海是没有生命存在的不毛之地。更由于技术手段的落后， 这一错误的猜想一直被延续到了十九世纪中叶。 1 1 2 深海微生物研究的历程 1 8 8 4 年，c e r t e s 在t a l i s m a n 探险活动中，第一次采集到深海沉积物和深海 海水样品，并从1 0 0 个海水样品中发现了9 6 个耗氧细菌。直至u 1 9 3 8 年， m a c h e b o e u f 和b a s s e t 才首次应用生物化学的方法来研究海洋中的微生物 ：4 ， 5 】。1 9 4 6 年，z o b e l 提出了检测原位微生物活性的观点，其认为生理活性是反 映微生物状态的最好参数。海洋微生物研究进入以生理、生态为基础的阶段。1 9 4 8 年，同样才是z o b e l ，发现了压力对海洋细菌的生长有着重要的影响，并提出嗜 压微生物的概念 6 1 。1 9 5 7 年，z o b e l 和m o f i t a 第一次尝试去分离和培养海洋中的 专性事压菌，但是一直都没有成功 7 ，8 】。直至u 1 9 7 9 年，随着实验技术的进步和 前人工作积累的经验，y a y a n o s 等人设计、改进高压培养罐分离出深海嗜压菌 【9 1 1 】。这一事件才真正标志着深海微生物这一学科的建立。 另一方面，生物学研究手段的发展为海洋微生物学的深入研究提供了动力。 1 9 7 7 年，以w o e s e 、s t e t t e r 、f o x 和z i l l i g 为代表的科学家，他们以称之为 细菌“化石的1 6 sr r n a 的核苷酸序列分析为主的研究结果提出了以真细菌 ( e u b a c t e r i a ) 、古细菌( a r c h a e a ) 1 2 ，1 3 和真核生物( e u c a r y a ) 为分类单元的三界学说 【1 4 ，1 5 】，三者之间的进化距离几乎是相等的，彼此的1 6 sr r n a 核苷酸序列相似 性( s a b 值) 均在0 1 左右。基于不可培养的1 6 sr d n a 分子技术是目前研究环境 微生物多样性不可替代的方法。海洋中s a r l l 类群【1 6 和大量不可培养古菌 1 7 】 的发现便是这一方法应用的发现。同时，基于此方法发展的原位杂交技术，为研 究独立细胞个体( 多样性) 在群落结构中的生理作用开启了大l - j 1 8 】。在研究微生 2 前言 物生态多样性中使用最广泛的分子生物技术还有：限制性片段长度多态性分析 ( r f l p ) 、末端限制性片段长度多态性分析( t - r f l p ) 和变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 在蕾 奇。 海洋微生物的基因组分析，也必将进一步丰富和拓展海洋微生物学。k o o n i n 等通过计算机软件比较了第一个完成的海洋古菌一詹氏甲烷球菌( m e t h a n o c o c c u s j 锄a s c l l i i ) 和另外三个细菌的基因组序列 1 9 ，2 0 。目前，许多海洋生物包括来源 于海洋真光层或海洋底层的病毒、细菌、古菌、蓝细菌、原生动物 2 9 】都完成 了全基因组测序 2 1 2 6 。另外，环境中微生物所有的基因可以看做一个大的微生 物群落基因组即宏基因组( m e t a g e n o m e ) 。宏基因组学可以用于研究包括未培养微 生物的基因组信息、生态多样性、生理多样性等，成为当今研究海洋环境微生物 学的重要手段之一。利用f o s m i d 文库 2 7 】和b a c 文库【2 8 】构建，获取了对不可 培养微生物的基因信息，从而发现了一系列的新基因。后基因组时代已拉开帷幕， 结合基因组信息发展起来的基因芯片技术( m i c r o a r r a y ) 在1 9 9 1 年提出，利用基因 芯片技术，可以用于基因表达分析、比较基因组分析、混合微生物群落的分析、 用于环境毒性物质的监控等 2 9 】。 随着蛋白质组学技术的发展，其正逐渐应用于海洋微生物 3 0 ，3 h ，并推动 了海洋环境蛋白质组学的发展。 2 0 0 7 年4 月，美国建成全长为5 2 千米，主要负责向海洋9 0 0 米深处的科学 设备、摄像机以及水下机器人提供电力的电缆。其将观测平台放到海底，通过光 纤网络向各个观测点供应能量、收集信息，可以进行多年连续的自动化观测。 2 0 0 8 年，r o s s e l l 6 m o r ar 等首次利用高精度质谱技术比较分析来自于不同 海域的全球性海洋细菌s a l i n i b a c t e rt u b e r 的代谢产物，首次将代谢组学 ( m e t a b o l o m i c s ) 应用于海洋微生物研究 4 0 】，这一进展必将推动海洋环境代谢组 学的发展。 因此，未来海洋微生物的发展趋势必将是利用基因组学、蛋白质组学、代谢 组学等方法尽可能获取来自可培养微生物或环境微生物区系的相关信息，从而尽 可能真实的了解多姿多彩的海洋微生物世界。 1 1 3 深海微生物研究的意义和迫切性 在目前已发现的各种极端环境中深海蕴藏着的生物资源极为丰富，其中最 主要的是深海微生物，但这些微生物大部分还鲜为人知。深海环境下极端微生物 前言 的研究不仅是目前生命科学最前沿的领域之一，也是海底深部生物圈研究和海 底流体活动研究重要的组成部分。该项研究将回答生命起源、生物进化、外太空 生命探索等生命科学的重大问题并带动包括2 l 世纪地球科学内的其它学科领域 的重大发展。2 0 0 1 年美国国家科学基金c ns f ) 在其题为“0c e a j - 1s c i e n c ea tt h e n e wm i l l e n i u m 的科学发展展望报告中，将海底流体活动研究列为海洋科学今 后十年最重要、最有可能取得重大突破和科学发现的前沿研究方向之一，生命科 学与海底地球物理、地球化学等在上述研究中将占据重要地位。于2 0 0 3 年l o 月 份开始的整合大洋钻探计划( i o d p ) 将深部生物圈和洋底、海底列为该计划中三 大科学课题之- - 3 2 】。 深海深部生物圈的发现是对“生物圈 广泛范围的进一步了解。虽然海底采 集沉积柱状样已经有近8 0 年的历史，大规模的系统研究开始于1 9 6 8 年的深海钻 探计划。“深海钻探( d s d p , 1 9 6 8 - 1 9 8 3 ) 、“大洋钻探( o d p , 1 9 8 5 - - 2 0 0 3 ) 和 “综合大洋钻探( i o d p , 2 0 0 3 - - 至今) 等深海研究的三部曲，是国际地球科学历 时最长、规模最大，也是成绩最为突出的合作研究计划。大洋钻探计划o d p 以 独特的视角为我们呈现出另外一个生命世界掩埋在洋底沉积物中和地壳中 的生物圈。在数千米深海海底存在着由微小的原核生物组成，数量极大的生物群， 有人估计其生物量相当全球地表生物总量的1 l0 。与热液口“自养 的微生物不 同，深部生物圈的原核生物依靠地层里的有机物实行“异养。深海大洋中生物 圈的发现，让人类认识到地球生态系统的真正基础在于原核生物。正是这些原核 生物多种多样的新陈代谢过程，产生了多种多样生物地球化学效果，在此基础上 建立了地球的生态系统 3 2 1 。 微生物总是出现在它们能够生存的一切物理、化学、地质环境中，这似乎是 一条基本规律。那些在极端环境中生长并通常需要这种极端环境正常生长的微生 物被统称为极端微生物。极端环境涵盖了物理极端环境( 如温度、辐射、压力、 磁场、空间、时间等) 、化学极端( 如干燥、盐度、酸碱度、重金属浓度、氧化还 原电位等) 和生物极端( 如营养、种群密度、生物链因素等) ，海底被认为是上述极 端环境中的极端。在深海环境中广泛存在着嗜酸( p h 3 以下) 、嗜碱( p h l o 以上) 、 嗜盐( 2 1 5 m o l m l 以上)