（发育生物学专业论文）多基因植物表达载体构建方法的研究.pdf

山东农业大学硕士学位论文 摘要 随着基因工程技术的发展，动植物品种特性的改良越来越多的需要靠 转化多个基因来实现，于是杂交法、分次转化法、共转化法等多基因转化 方法应运而生。但目前为止，所有这些方法都存在着费时、繁琐、转化效 率低、需要不同的筛选标记基因等缺点。将多个基因串联在同一表达载体 上进行一次性转化则显得非常有优势。然而，构建含有两个或多个基因表 达盒的载体目前依然存在着许多困难。由于同尾酶酶切可获得相同的粘性 末端，重组连接后，重组位点上原酶切位点消失，不能再被原同尾酶切开。 本研究利用同尾酶这一特点，发明了一种简单易用的新方法，成功解决了 多基因聚合技术这一难题，理论上可在同一载体上连接无限个基因表达 盒。 首先以p c r 2 1 t o p o ( i n v i t r o g e n ) 为骨架，构建了一个上游带3 5 s 启动子，下游带t n o s 终止子，两者之间为多克隆位点序列( m c s ) 的辅 助载体p c r ( - x b a i 3 5 s m c s t n o s - s p e i - x b a i ) 。目的基因l 、2 、3 分别 亚克隆到该辅助载体的m c s 上，相应带有目的基因的重组质粒分别命名 为p c r e c l 、p c r e c 2 、p c r e c 3 。这样每个基因表达盒两端都带有x b a i 位点，并且在t n o s 终止子与下游的。勋口i 酶切位点之间有一个勋p i 酶切 位点。由于劢口i 和印p i 是同尾酶，二者酶切后可获得相同的粘性末端。 所以x b a i 酶切p c r e c 2 得到基因表达盒e c 2 ，可连接到p c r e c l 的s p e i 位点上，得到带有两个基因表达盒的新质粒p c r ( - x b a i e c l - s p e i x b a i e c 2 s p e i - x b a i 一) 。又由于新连入的e c 23 末端仍然带有一个s p e i 酶切位 点，从而可以再连接由x b a i 从p c r e c 3 质粒酶切而来的第三个基因表达 盒e c 3 。利用这种方式，可以依次连入多个基因表达盒。最后用x b a i 从 该辅助载体上酶切下构建好的包含多个基因表达盒的d n a 片段，连接到 植物双元表达载体p c a m b i a 2 3 0 0 上，从而获得包含多个基因表达盒的植物 表达载体。 为了验证此方法的可行性，我们构建了含有报告基因g 淞、p 及 筛选标记基因b a r 的3 基因表达载体p c a m b i a 3 e c ，同时我们还将此法应 多基冈植物表达载体构建方法的研究 用到长链不饱和脂肪酸e p a d h a ( 鱼油的主要有效成分) 的植物反应器 研究中，构建了包含e p a 合成代谢途径中的4 个关键基因的植物表达载 体p c a m b i a 4 e c ，并初步进行了拟南芥转化验证。p c r 及酶切鉴定证明构 建的表达载体带有全部目的基因。我们分别把两个表达载体转化到根癌农 杆菌g v 3 1 0 1 中，并且进行了拟南芥遗传转化，2 6 棵三基因和5 8 棵四基 因转基因拟南芥分别在除草剂和卡那霉素培养基上检测出，转基因情况正 在鉴定之中。以上研究结果表明：此法不但理论上简单可靠，实践上也简 单可行。通过设计，我们仅用两个同尾酶姗越和印p i 就解决了多基因聚 合载体的构建难题，为今后科学研究与基因工程改良植物的生产实践提供 了一种简单、易用、灵活、可靠、低成本的多基因表达载体构建的新方法。 关键词：多基因表达；同尾酶；拟南芥；e p a 2 山东农业大学硕士学位论文 an o v e lm e t h o df o rt h ec o n s t r u c t i o no f p l a n tm u l t i g e n e t r a n s f o r m a t i o nv e c t o r s a b s t r a c t w i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n to ft h eg e n e t i ce n g i n e e r i n g ，r e s e a r c h e r sh a v e n o ws h i f t e df r o mt r a n s f o r m a t i o no fs i n g l e g e n et ot r a n s f o r m a t i o no f m u l t i g e n e st op l a n t s t om e e tt h e i rr e s e a r c hd e m a n d s t h e r e f o r en e wa n d e f f e c t i v et e c h n o l o g i e st oa c h i e v et h e s ea l eu r g e n t l yn e e d e d s i n c es e x u a l c r o s s i n gb e t w e e np l a n t sc a r r y i n gd i f f e r e n tt r a n s g e n e s ，s e q u e n t i a lr e t r a n s f o r m a - t i o no rc o - t r a n s f o r m a t i o nw i t hp l a s m i d sc o n t a i n i n gi n d i v i d u a lt r a n s g e n e sa r e v e r yt i m e c o n s u m i n g ，l o wt r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c ya n d o rr e q u i r i n gt h eu s e o fd i f f e r e n ts e l e c t a b l em a r k e rg e n e s ，i tw o u l db ea d v a n t a g e o u st ot r a n s f e r m u l t i g e n e st h a ta r es t a c k e d i n t oas i n g l et r a n s f o r m a t i o nv e c t o rt op l a n t h o w e v e r , t oc o n s t r u c ts u c hav e c t o ri st e c h n i c a l l yc h a l l e n g i n g h e r ew er e p o r t as i m p l ea n du s e rf r i e n d l ym e t h o df o rt h ec o n s t r u c t i o no fas i n g l ev e c t o r c o n t a i n i n g3o rm o r et r a n s g e n e sf o ro n es t e pt r a n s f o r m a t i o no fp l a n t w ef i r s tc o n s t r u c t e da l la u x i l i a r yv e c t o rp c r ( - x b a i 35s - - m c s - t n o s s p e i - x b a i 一) b a s e d o nt h ec l o n i n gv e c t o rp c r 2 1 - t o p o ( i n v i t r o g e n ) i t c o n t a i n sa3 5 sp r o m o t e r , an o st e r m i n a t o r ( t r i o s ) ，a n dam u l t i c l o n i n gs i t e ( m c s ) i nb e t w e e n r e s t r i c t i o ns i t e sx b a iw a sa d d e db e f o r et h e3 5 sa n d 勋8 i 勘a 1w e r ea d d e da f t e rt h et n o st oa i dc l o n i n go fi n d i v i d u a le x p r e s s i o n c a s s e t t e s t h eg e n e so fi n t e r e s tc a nb ei n d i v i d u a l l ys u b c l o n e di n t ot h em c so f t h i sv e c t o r , r e s u l t i n gi nt h en e wp l a s m i d sp c r e c1 ，p c r e c 2 ，p c r e c 3e t c a s e a c he x p r e s s i o nc a s s e t t ew a sf l a n k e db yt w o 劢a is i t e s ，t h ee c 2e x p r e s s i o n c a s s e t t ec a nb er e l e a s e db y 肠a if r o mt h ep c r e c 2 ，a n dl i g a t e di n t op c r e c1 t h a tw a sp r e d i g e s t e dw i t hs p e lb e c a u s e 劢魂( t c t a g a ) a n d 印p i ( 1 a g t ) c a np r o d u c ec o m p a t i b l ec o h e s i v ee n d s ，t og e n e r a t et h ep l a s m i d c o n t a i n i n g2e x p r e s s i o nc a s s e t t e se c 1a n de c 2p c r ( - x b a i e c 1 - s p e i x b a i 3 多基因植物表达载体构建方法的研究 一e c 2 - s p e i - x b a i 一) h o w e v e r , t h en e w l yf o r m e ds e q u e n c ea c t a g a ( s p e i x b a l ) w a sn ol o n g e rd i g e s t i b l eb ye i t h e re n z y m e s b e c a u s ean e w 印e ls i t ew a s i n t r o d u c e df o l l o w i n gt h el i g a t i o no fe c 2 ，i nt h es a m ew a y , t h et h i r de x p r e s s i o n c a s s e t t ee c 3c o n t a i n i n gt h et h i r dg e n ec a nt h e nb el i g a t e di n t ot h i sp l a s m i dt o p r o d u c eap l a s m i dw i m 3e x p r e s s i o nc a s s e t t e f o l l o w i n gt h es a m er u l e ，s e v e r a l g e n ec a s s e t t e sc a nb es t r u n gt o g e t h e ri n t ot h i sa u x i l i a r yv e c t o r f i n a l l y , t h e s e s t a c k e dg e n ec a s s e t t e sc a nb er e l e a s e db yx b a if r o mt h i sa u x i l i a r yv e c t o ra n d l i g a t e di n t ot h ep l a n tb i n a r yv e c t o rp c a m b i a 2 3 0 0p r e d i g e s t e db yx b a it o o b t a i nap l a n tt r a n s f c l r m a t i o nv e c t o rc o n t a i n i n gm u l t i g e n e s t oc o n f i r mt h e f e a s i b i l i t y o ft h ea b o v em e t h o d ，w ec o n s t r u c t e da t r a n s f o r m a t i o nv e c t o rp c a m b i a 3 e cc o n t a i n i n gt h r e et r a n s g e n e s ，i n c l u d i n gt w o r e p o r t e rg e n e s ( g u s , g f p ) a n das e l e c t a b l em a r k e rg e n e ( b a r ) w ea l s o c o n s t r u c t e da n o t h e rt r a n s f o r m a t i o nv e c t o rp c a m b i a 4 e cc o n t a i n i n gf o u rg e n e s t h a ta r er e l a t e dt ot h eb i o s y n t h e s i so fv e r yl o n gc h a i np o l y u n s a t u r a t e df a t t y a c i de p a ( t h em a i ni n g r e d i e n to ff i s ho i l ) b o t hp c ra n dr e s t r i c t i o nd i g e s t i o n h a v ec o n f i r m e dt h a tb o t hv e c t o r sc o n t a i na l lt h eg e n e so fi n t e r e s t a r a b i d o p s i s w e r et r a n s f o r m e dw i t ht h ep c a m b i a 3 e ca n dp c a m b i a 4 e cc o n s t r u c t sv i at h e a g r o b a c t e r i a m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o ns t r a t e g i e s 2 6b a s r ah e r b i c i d er e s i s t a n t p l a n t sa n d5 8k a n a m y c i nr e s i s t a n tp l a n t sw e r er e c o v e r e df r o mp c a m b i a 3 e c f r o m p c a m b i a 4 e c t r a n s f o r m e d p l a n t s ，r e s p e c t i v e l y t h e s ep u t a t i v e t r a n s f o r m a n t sw i l lb eg r o w no ni ns o i lf o rf u r t h e rc o n f i r m a t i o nf o rt h e e x i s t e n c eo ft h et r a n s g e n e s o u rr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tu s i n gi s o c a u d o m e r s c o u l ds o l v et h ed i f f i c u l t i e sf i n d i n ga p p r o p r i a t eu n i q u er e s t r i c t i o ns i t e sw h e n t h r e eo rm o r eg e n e sn e e dt ob el i n k e do rf u s e dt om a k eam u l t i g e n ec o n s t r u c t k e y w o r d s ：m u l t i g e n ee x p r e s s i o n ；i s o c a u d o m e r ；a r a b i d o p s i s ；e p a 4 英文缩写 d 9 e t 0 彳8 d e s 厶5 d e s a 1 5 d e s y e p x - g a l 强s s d s r r - p c r n 0 s m s m c s k a r l i p t g g 嬲 g f p e d l a e c d n t p d e p c c d n a b p 3 5 s 英文缩略表 英文名称 a 9e l o n g a s e 8d e s a t u r a s e 5d e s a t u r a s e l5d e s a t u r a s e y e a s te x t r a c ta n dp e p t o n em e d i u m 5 - b r o m o 一4 一c h l o r o - 3 - i n d o l y l - d d - g a l a c t o s i d e t r i s h y d r y x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r n o p a l i n es y n t h a s e m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i u m m u l t i - c l o n i n gs i t e k a n a m y c i n i s o p r o p y l t h i o p d - g a l a c t o s i d e i b - g l u c u r o n i d a s e g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n e t h y l e n ed i a m i n et e t r a , a c e t i ca c i d e x p r e s s i o nc a s s e t t e d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e c o m p l e m e n t a r yd n a b a s ep a i r 35 sp r o m o t e ro fc a u l i f l o w e rm o s o i e v i r u s 中文名称 a 9 链延长酶 a 8 去饱和酶 a 5 去饱和酶 a 1 5 去饱和酶 y e p 培养基 5 一溴4 氯一3 一吲哚p d 半 乳糖苷 三羟甲基氨基甲烷 十二烷基硫酸钠 反转录p c r 胭脂碱合成酶 m s 培养基 多克隆位点 卡那霉素 异丙基b d 硫代半乳糖 苷 d 葡萄糖苷酸酶 绿色荧光蛋白 乙二胺四乙酸 表达盒 脱氧核糖核苷三磷酸 焦碳酸二乙酯 互补d n a 碱基对 花椰菜花叶病毒3 5 s 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ；、 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：岔选童 导师签名：童童：盘 e t 期：佥墨鱼旦 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 植物基因工程技术的迅速发展和广泛应用为植物的遗传改良开拓了 广阔的前景。目前，大多数转化技术只是将单个基因构建在一个质粒上转 化植物。然而，由于生物体内的代谢途径常常是多步反应，需要多个酶共 同催化，即要求几个相关基因的协同表达，因此将多个基因转化到同一植 物中，就显得很有必要了。目前，部分研究者已经对单基因导入植物转向 多基因导入，发展多基因转化系统，将多个基因导入到植物中进行了探索， 并且成功的实现了多个基因聚合的转化植物。但是由于现有技术条件的限 制，多基因转化仍存在一定的困难( h a l p i nc ，2 0 0 1 ；d a n i e l lh ，2 0 0 2 ；h a l p i n c ，2 0 0 5 ) 。 1 1 植物多基因聚合技术的研究进展 自1 9 8 4 年首次获得转基因烟草( h e r r e r a , 1 9 8 4 ) 以来，以转基因技术为 代表的植物基因工程技术的广泛应用为植物的遗传改良开拓了广阔的前 景。转基因技术克服了植物有性杂交的限制，可将来源于不同物种甚至人 工合成的基因导入植物，从而改良植物性状，培育优质高产作物新品种。 科学家们迄今已成功的创造了抗除草剂( v 瓠i ，1 9 9 2 ；w a n ，1 9 9 4 ；d e n i s e ， 1 9 9 9 ) 、抗病虫害( p e r l a k ，1 9 9 0 ；w i l s o n ，1 9 9 3 ) 、抗逆( s h e v e l e v a , 1 9 9 0 ； f u m j i m o t o ，1 9 9 3 ；s h e n ，1 9 9 7 ) 、延迟果实成熟( o e l l e r , 1 9 9 1 ；h a m i t o n ，1 9 9 2 ； p i e t o n , 1 9 9 3 ) 、雄性不育( m a r i a n i ，1 9 9 0 ) 及作为生物反应器( g a s s e r , 1 9 8 9 ) 等具有新性状的转基因植物，它们中绝大多数是通过单个目的基因的遗传 转化而获得的。然而在自然界中，生物的性状常常是由多个基因共同控制 的，需要多个酶共同催化，即要求几个相关基因的协同表达，因此将多个 基因转化到同一植物中，就显得很有必要了。一般的生化代谢过程需要多 种酶的催化作用才能完成。在酵母中像海藻糖这样简单的双糖，其代谢过 程也需要几个基因产物的直接参与( t h e v e l e i n ，1 9 9 5 ) 。长期以来，培育具 有多种优良品质，如高产、优质、高抗、多抗或具备其它生产上有用特性 的作物品种一直是科学家进行植物遗传改良的共同愿望( h a l p i nc ，2 0 0 5 ) 。 5 多基因植物表达载体构建方法的研究 随着分子生物学技术的发展，人们期望利用基因工程技术来达到这一目 的。为此，多基因组装与转化技术便应运而生，以便将多个目的基因导入 到植物基因组中并在植物中进行表达。 此外，在基础研究方面，多基因聚合技术对研究特定基因对不同代谢 途径、不同发育与生理过程中的作用方面也充当着核心的角色。发育的调 控、代谢的特征以及生物的适应性与抗逆性多依赖于多基因之间的互作。 因此，多基因转化的策略必将成为今后基因工程在基础理论与实际应用研 究中的主流方向( 李宝健，2 0 0 4 ) 。 1 。1 1 多基因聚合的方法 1 1 1 1 杂交法 杂交法( s e x u a lc r o s s i n g ) ，即将不同外源基因先分别转入不同的个体， 再将这些植株采用常规育种手段进行杂交( h a l p i nc ，2 0 0 5 ) ，借助分子标记 辅助选择，可获得转基因纯系，杂交以聚合多个目标基因获得多性状改良 的转基因品种，可以避免共转化中因外源基因经常插入同一位点而彼此影 响表达。采用这种方法已获得含有五个基因的强耐盐性的转基因水稻植株 ( 郭龙彪，2 0 0 6 ) 和多抗虫基因的转基因水稻植株( 马炳田，2 0 0 2 ) ，将杂 交法和基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法等直接转化法结合起来， 可以大大加快具有转基因目标性状的新品系的选育过程。b i z i l y 等( 2 0 0 0 ) 将与汞脱毒相关的有机汞裂解酶基因和汞还原酶基因，通过农杆菌介导法 转入不同拟南芥植株，挑选高表达的转基因植株杂交，获得聚合m e r a 和 m e r b 基因的杂交后代，其对有机汞的抗性比单独转m e r b 基因植株高l o 倍。 h i t z 等( 1 9 9 9 ) 通过杂交法对植物中聚羟基丁酸盐( p o l y h y d r o x y b u t y r a t e p h b ) 共聚体的合成所需的4 个基因进行聚合，但是这一过程需花6 代的时 间，考虑到转基因的位置效应和基因表达的稳定性，通常还必须扩大相应 的育种群体。这种选育纯系再进行杂交的方法费时费力，一般多适用于已 有的转基因纯系。 1 1 1 2 多个表达载体多次转化法 也称连续再转化法( s e q u e n t i a lr e t r a n s f o r m a t i o n ) ，是指经过一次转化 6 山东农业大学硕士学位论文 的植株作为受体接受二次转化，依次多重转化将一个个有用基因反复多次 的导入同一生物中以达到目标基因的聚合( h a l p i nc ，2 0 0 5 ) 。在基因工程诞 生之前，传统的常规育种常采用这种方式，即将多个优良性状逐个、逐次 的累加到某个生产上常用的优良品种中。一般是一个目的基因构建一个表 达载体，需转化多少个目的基因就构建多少个表达载体。这种载体构建方 式，相当于把多个基因的转化变为多个单价基因的转化。这样可以充分利 用现有相当成熟的载体构建以及基因转化技术，不需考虑载体的容量，而 现有的质粒载体就能够满足需要，目的基因的数目也可不受限制。但随着 转化基因的数目增多，工作量将增加，试验周期要延长，得到转多价基因植 株的难度就越来越大。而且由于在转化时进行多次独立的转化，各个基因 的表达水平差异较大。另外，目的基因在植物染色体内的插入一般是随机 的。多次独立的转化事件使得多个目的基因很可能整合在多个遗传位点上， 那么转基因植株后代的分离复杂，其稳定性差，获得同时含多个目的基因 的转基因纯合系比较困难。l a p i e r r e 等( 1 9 9 9 ) 运用这种方法，使杨树的 两个关于木质素合成基因c a d 和c 0 1 砑得到成功抑制。h i r d 等( 1 9 9 2 ) 还用 此方法获得了雄性不育烟草植株。q i 等( 2 0 0 4 ) 将鱼油的主要成分之一的 鱼油e p a 代谢途径中的三个基因a 9e l o ，a 8 d e s 和a 5 d e s 分次转入拟南芥 中，获得了生产鱼油的拟南芥。此重复转化法尽管理论上可行，但由于所 需时间长，不同基因间容易发生分离或诱发沉默，而且每次转化需要不同 的筛选标记，因此较难运用于实践中。 1 1 1 3 多个表达载体的共转化法 所谓共转化( c o t r a n s f o r m a t i o n ) ，就是将位于不同载体上的多个基因 同时转化到同一植物中，是一步法多基因转化( h a d im e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。研究者 利用电激法介导的共转化将两个不同的外源基因( 其中一个为标记基因) 分别构建在两个不同的t i 质粒上，混合后通过电激法转化原生质体，共转 化率为2 0 屹5 ：l e s z e ka ( 1 9 8 9 ) 通过p e g 介导法共转化成功的将位于不 同质粒上的g u s 基因和n p t l i 基因同时转入玉米的原生质体，得到了大量的 共转化的愈伤组织，共转化率为5 0 ；h a d im ( 1 9 9 6 ) 用基因枪介导的共转 化将1 2 个质粒同时转化到大豆的胚发生悬浮培养组织中，多数转基因大豆 7 多基因植物表达载体构建方法的研究 都带有所有的基因，共转化率为4 0 6 0 。利用农杆菌介导的共转化 法：a n nd e p i e k e r ( 1 9 8 5 ) 、k o m a r i ( 1 9 9 6 ) 、吕德杨( 2 0 0 0 ) 等用单菌株单质 粒( 一个菌株中只含有一个质粒) 共转化法，分别获得共转化率6 0 7 0 的转化烟草原生质体、共转化率5 0 的转化水稻、共转化频率在4 3 6 0 之间的通勘r i z o g e n e sa 4 感染转化的苜蓿茎段。d e l e y ( 1 9 9 8 ) 用单菌株 双质粒( 一个农杆菌的细胞中含有2 个t i 质粒) 共转化法，获得共转化率可 达5 0 的转基因油菜和烟草，但是使用这种方法时要考虑农杆菌容纳多个 质粒的能力。d eb l o c k ( 1 9 9 1 ) 、k o m a r i ( 1 9 9 9 ) 、p o i f i e r ( 2 0 0 0 ) 等用双菌株 双质粒( 2 个质粒载体分别位于不同的农杆菌细胞) 共转化法，分别获得共 转化率为3 7 、3 5 、1 6 的转化植株。y e ( 2 0 0 0 ) 等则将b 一胡萝卜素合 成途径相关的3 个基因分置于两个质粒上，通过农杆菌介导的共转化将有 关基因导入水稻胚乳，提高了水稻的营养价值。这种方法共转化率最低， 这可能与农杆菌的侵染机理有关。由于植物细胞壁表面的附着位点数量有 限，不同农杆菌菌株在竞争的过程中一旦抢占到附着位点，就将它的t i 质 粒的一部分d n a 导入植物细胞，菌株之间的差异可能会抑制另一个农杆 菌的吸附，从而使共转化率降低。共转化方法由于简单易用已经成为目前 多基因聚合转化的首选方法。但是共转化的共整合频率不稳定，随不同转 化事件、转化技术，不同的受体，不同的表达载体结构、大小和数量而变化 ( 张宏宇，2 0 0 4 ) 。同时进行转化的目的基因之间的转化率也有较大的差 异，发生共转化的目的基因在受体植物基因组的整合位点也很难确定，但 许多报道发现共转化的多个目的基因整合在一条或者两条染色体的同一 或者少数几个遗传位点上( s h c o c h e r ，1 9 8 6 ；h a d im z ，1 9 9 6 ；戴顺洪等1 9 9 8 ； 冯道荣等，2 0 0 0 ；c h e ne ta 1 ，1 9 9 8 ；m a q b o o le ta 1 ，1 9 9 9 ) ，这一特点对获得 转多价基因植物遗传稳定性是非常重要的。尽管目前对共转化的作用机理 研究得还不清楚，有时难保证将发生共转化的目的基因都能导入到同一受 体中，但是这些成功的事例表明共转化是获得转多基因作物的一种非常有 用的转化方法。 1 1 1 4 多基因单表达载体一次性转化法 针对以上各种方法存在的问题，研究者开始采取下列两条途径将目的 8 山东农业大学硕士学位论文 基因克隆到同一个表达载体上，一是直接将多个基因融合克隆到表达载体 上( 多聚蛋白酶法) ，二是将多个目的基因用表达结构隔开( 独立表达盒 法) 。通过多个基因一个表达载体的方法一次性转化植物，从而获得多基 因聚合的转基因植物。 多聚蛋白酶解法：多个目的基因的d n a 序列融合在一起，使其处于同 一表达框( o r f ) 内，多个基因在同一个启动子下转录成一个转录单元，翻 译后得到一个由不同的功能蛋白拼合在一起而形成的新型多结构域的人 工蛋白。运用这种方式产生的融合蛋白已广泛应用于基因表达、酶学定向 药物设计及构建新的细胞因子等领域( u r v i ne ta 1 ，2 0 0 2 ：d o r o k h o ve ta 1 ， 2 0 0 2 ；j a a ge ta 1 ，2 0 0 3 ) 。考虑到融合蛋白结构和功能的复杂性或有时必须 得到各目的基因独立的表达产物时，还可以在各基因之间插入编码某个蛋 白酶特异识别位点的d n a 序列，这样，融合蛋白一旦翻译成多肽，就可以 通过相应的酶解过程使其分离。由于融合在一起的多个基因处在同一个表 达盒中，缩小了整合进载体的d n a 片段长度，减轻了载体的运载负担，同 时还使各基因的表达完全同步，表达水平相当，因此易于对表达进行控制。 若构建了一个多基因的表达载体，则只要根据所用的受体采用合适的基因 转化方法，通过一次转化事件就可以获得表达多个目的基因的转基因植 物。由于只进行一次基因转化，多个基因一般整合在受体染色体的同一个 遗传位点上，转化后根据与其连锁的选择性标记基因筛选也很简单和方便， 比较容易的获得能稳定遗传的转化多价基因的植物。b o s c h ( 1 9 9 4 ) 等将 c r y l c 和c r y l e 序列通过体内重组方式融合到一起。h o n e e ( 1 9 9 0 ) 等构建了 c r y a 例和c r y l c 的融合蛋白基因，经ec o l i 表达的产物显示出了上述两种 毒蛋白的抗虫活性。后来v a nd e rs a l m ( 1 9 9 4 ) 等将含c r y l c - c r y l a 例融合蛋 白基因表达载体成功的转化烟草和番茄，获得了抗多种害虫的转基因植 株。 独立表达盒法：多个目的基因的两端均具有各自的启动子、增强子、 终止子等转录和翻译调控元件，将它们串联在一起共同组建于一个表达载 体中。这种组合在一起的目的基因由于有各自的表达元件，因此能分别转 录成多个转录单元，并表达出各自的产物。它们之间一般完全连锁，可同时 9 多基因植物表达载体构建方法的研究 表达。通过不同的启动子元件，还可以控制不同基因在表达上的时空特异 性，从而使多基因得到更灵活协调的表达。但具有同源性的启动子序列有 时可能引致基因沉默。因此随着加入基因数的增多，寻找多个合适启动子 的工作将会变得越来越艰巨。此外，调控序列的增加，也将减少载体对外源 基因的相对容量。 多基因单载体的方法避免了前三种方法中存在的费时费力，共转化频 率低，后代中目的基因分离、重组等问题，是实现多基因转化的有效方法 之一。但是，以往构建多基因单载体，大都采用酶切连接的方法，将目的 基因连入多克隆位点中。但是由于多克隆位点上内切酶位点是有限的，且 按序排列，再加上目的基因上酶切位点的影响，使得研究者不能按需要连 入多个基因，制约了多基因载体的构建。为了获得多基因聚合的转化植株， 必需优化发展相应的多基因聚合转化技术，将大容量的载体能够高效的 导入到受体中，并保证多个目的基因与植物基因组整合后不发生分离和丢 失。 1 2 独立表达盒法构建多基因表达载体的研究进展 为了克服费时费力，共转化频率低，后代中目的基因分离、重组等问 题，研究者大都利用多个基因表达盒构建在一个载体上的方法来进行多基 因的转化。但是由于多克隆位点上内切酶位点是有限的，且按序排列，再 加上载体或目的基因上酶切位点的影响，使得研究者不能按需要连入多个 基因，制约了多基因载体的构建。 1 2 1 借助稀有归巢内切酶的方法 基因工程所用的内切酶中，通常将对序列切割频度较低的称为稀有内 切酶。其中有一类内切酶被称为h o m i n ge n d o n u c l e a s e 或 m e g a n u c l e a s e ( b e l f o r t ，19 9 7 ) ，如i - s c e i 、i - c e u i 、i - p p o i 、i - t l i i 和p i p s _ p i 。 h o m i n ge n d o n u c l e a s e 的识别切割位点有如下特点：识别序列较长，如 i - s c e i 识别1 8 碱基对的位点，p i - s c e i 识另j j 3 9 碱基对的位点，因此在基因或 d n a 片段中自然出现与这些位点完全一致的序列的机率极低：识别序 列是非对称结构，当2 个方向相反的位点之间的片段被h o m i n g 1 0 山东农业大学硕士学位论文 e n d o a u c l e a s e 切除后再将两端连接，产生的连接点将不再是一个完整的识 别切割位点，不能被该酶识别和切割。 吐虹业必盥 图1 - 1 植物转化载体p p z p - r c s 2 、辅助载体o a u x 3 1 3 0 ，p a u x 3 1 3 1 + p a u x 3 1 3 2 。p a u x 3 1 3 3 p a u x 3 1 6 6 ，p a u x 3 1 6 7 p a u x 3 1 6 9 、及辅助载体中的表达盘连接到p p z 艮r c s 2 示意图( g o d c r i s ， 2 0 0 2 ) 。辅助载体中的酶切位点在载体中唯一存在，p p z p - r c s 2 女标示，八个核苷酸识别序列的内 切酶和归巢内切酶。 f i 9 1 - is c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fo 【锄t t r a n s f o m a t i o nv c c t o fp p z p - r c s 2a n d t h ea u x i l i a r ：v c c t o r s p a u x 3 1 3 0 ，p a u x 3 i3 1 ，p a u x 3 1 3 2 ，p a u x 3 i3 3 ，p a u x 3 1 6 6 ，p a u x 3 1 6 7a n dp a u x 3 1 6 9 ( g o d e r i s , 2 0 0 2 ) t h er e s t r i c i f o ne n z y m e s ，m e n t i o n e d i np a u xv e c t o r s , c o n l p n s e t h en e w m u l t i p l ee l 叩i n gs i t e m d a ru n i q u e i n t h e v e c t o r s t h e p o s s i b i l i t i e s f o rc l o n i n g i n t op p z p - r c s 2o fc a s s e h c sc o n s t r u c t e d i n t h e a u x i l i a r yv e c t o r sa r ci n d i c a t e dt h em u l t i p l ec l o n i n gs i t eo fp p z p - r c s 2i si n d i c a t e dh e r e ，o n l yt h e r e c o g n i t i o ns i t e s f o r t h e o c t a n u c l e o t i d e a n d t h eh o m i n ge n d o n u c l e a s e sa y es h o w n 利用这些出现频率极低的酶，g o d e r i s ( 2 0 0 2 ) 用归巢内切酶代替了 其它的载体或基因里常出现的限制性内切酶，克服了载体和基因中酶切位 点复杂等缺点( 图1 1 ) 。构建了两个适用于农杆菌介导植物转化的双元载 体p p z p - r c s i 和p p z p r c s 2 ，两者的区别在于t _ d n a 上多克隆位点顺序的 多基因植物表达载体构建方法的研究 差别。在t - d n a 片段上带有1 3 个六核苷酸识别序列的限制性内切酶位点、 6 个八核苷酸识别序列的限制性内切酶位点和5 个归巢酶位点i 肋d i 、 i - s c e i 、i - c e u i 、p i p s p i 和p i t l i i 。这些归巢酶大都含有1 2 4 0 个识别序列， 因此在自然d n a 序列中出现的几率很低。同时构建了一系列带多克隆位 点的的辅助载体p a u x 3 1 6 6 、p a u x 3 1 3 0 、p a u x 3 1 6 9 、p a u x 3 1 3 l 、 p a u x 3 1 3 2 、p a u x 3 1 3 3 、p a u x 3 1 6 9 。每个多克隆位点的两侧各带有与 p p z p r c s 多克隆位点上对应的归巢内切酶。这样，就大大减少了因为酶 切使载体序列或插入的序列被切开的几率。在进行多基因转化时，可以把 每个基因的表达盒连接入辅助质粒相应的酶切位点，然后由两端的归巢内 切酶切下，直接连接到植物转化载体p p z p r c s 相应的位点。 该方法用的归巢内切酶不易买到，并且价格昂贵，且聚合几个基因就 得构建几个辅助载体，并且植物表达载体多克隆位点上的归巢内切酶数量 决定着可以接入外源基因的数量。因此，较难用于实践中。 1 2 2 利用c r e l o x p 重组系统的方法 c r e l o x p 重组系统来自于埃希氏大肠杆菌噬菌体p 1 ，由于其不需要其 他辅助因