（动物学专业论文）一例白变猕猴的病因研究.pdf

中国协和医科大学医学生物学研究所硕士研究生学位论文 中文摘要 猕猴是珍贵的野生动物资源，同时是与人类医学生物及健康密切相关的实验动物。 由于猕猴与人在亲缘关系上极为相近，基因组的同源性大于9 5 ，因此，猕猴自然突变 的疾病家系是理解人类疾病，开展基因研究及基因疗法的极好材料。本研究所用的白 变猕猴表型及发病史极为特殊，与已知的白化病表型有着极大的差异，为一不同寻常 的皮肤和毛发白变。首先，这例白变猕猴为成年后皮肤和毛发变白；其次，与常见的 白化病不同的是，本例白猴眼睛完全正常；再次，它的皮肤，指甲及手掌完全变白， 但毛色却有较少部分为正常色。结合已发现的白化猴的典型症状，推测为后天性突变。 为了弄清其致病分子机理，我们开展了酪氨酸酶活性试验，血液学指标检测，黑色素 含量测定，微量元素含量测定，并对黑色素生成的关键酶酪氨酸酶基因进行分析研究。 结果表明：白猴毛囊酪氨酸酶有活性，血小板及其它血液学指标正常，白毛黑色素含 量仅为正常毛色的6 7 ，与人类头发由于c a ，m g 元素过量，z n ，c u 缺乏导致的暂时性的白 发现象不同的是，白猴血液中f e 的含量显著高于正常值，其分子机理尚不明确。而对 酪氨酶基因的分析研究表明，酪氨酸酶基因1 4 0 g ( g 1 y a s p ) ，2 1 2 t c ( p h e s e r ) ， 4 6 5 g c ( t h r t h r ) ，7 8 l t y a ( a s n t y t ) ，7 8 3 刖c ( a s l l l y s 或t y t s 2 0 p ) ，8 5 97 r a ( s e “t h r ) ， 9 5 5 g a ( g m l y s ) ，9 7 8 g a ( g w g l n ) ，9 8 l t a ( t y “s t o p ) ，1 3 s 3 t c ( t y “t f ) ， 1 5 1 8 g 刖c ( h i s g 1 n g l n ) 等多处发现有杂合位点。有4 个杂合位点产生同义突变，有2 个 可能产生终止密码子，其余均为错义突变，在这些错义突变中，只有一个可能影响酪 氨酸酶的高级结构，但却没有一个纯合突变。结合表型判断，初步认为本例白变猕猴可 能是由于酪氨酸酶基因上的杂合突变积累到一定阶段后，几个杂合子通过一种尚不知 晓的组合方式影响到了黑色素的生成，从而导致白变表型。 中国协和医科大学医学生物学研究所硕士研究生学位论文 a b s t r a c t r h e s u sm 伽l k e yi sr a r ew i l da i d m a lr e s o u r c e s ，甜sak i n do fl a 由o r a t o r ya l l i m a lf o r s m d y i n gm c d i c a lb i o l o g ya n du f es c i e l l c ew h i c ha s s o c i 砒e dw i t lh u m a n h e a l 1 舡i th a s o v e r9 5 g e n o 1 i cs i m i l a r i t yw i 出血a to fh u m a nb e i 】唱，m e r ea r es om a i l yg e n e t i cc h a m c t e r s s h a r 酣b e t 、) i ，e e nr h e s u sm o n k e ya i l dh u m a n b e i n g a sar e s u l t ，吐l e 铲n e a l o g yo fn a n l r a l m u t a t e dr h e s u si n o i l k e yb e c o m et l l ev e r yi d e a lm o d e l0 fd i s c l o s i i l ge i o l o g yf b rs 锄eh u m a i l d i s e a s e s ，ca r 】啊n go ng e n em u 诅n o nr e s e a r c h 柚dg e n em 锄p y h 也i sp 印e r ，an o v e lw 1 1 i t e f i 】rr h e s u sw h j c h 砌m f k a b l yd i 胁t 缸) mk n o w na m i l l i s mo n 血ep h 肌。明e sa n dc a s e m s t q r yw a ss t u d i e d i ts h o w s ，胁t ，n l i s 砒t em o n k e yc h a n g e dc 0 1 0 rm e rb e i n gg r o w nu p ； s e c o n d l y m ee y e so f 吐l i sw h i t em o i l k e yi sc 伽印1 e t e l yn o 胁a l ；血i r d l y ，m es ，丘n g e rn a i l s ， a n d p a h n o f h a n d s w l l i c h i sa i l i 】p 咖t m a r ko f a i b i l l i s ma r e w h i t e ，b u ta p a r t o f h a i r o n 廿l e b a c ka n dh e a dw e r en o n n “h 1o r d e rt om a k ec l e a rm e e t i o p a 血o g e n i s i so fm i sk i n do f p i g m e n td i s o r d e r ，w et e s t e d 廿l ea c t i v 姆o fb t o s i n a s e ；d e t e c t e d 血ec o n v e 埘o n a lh e m a t 0 1 0 9 y i n d e x e se s p e c i a lp l a t e l e tc o n t e n t ；a s s a y e dm e l a n i nc o n t e n ta i l dm a i nm c ee l e m e n t sc o n t e n l a n da n a l y z e dm eq ，r o s i n a s eg e n ew 1 1 i c ht h e k e yg e n eo fm e l 柚o g e n e s i s t h er e s u n ss h o w e d t h a t ：出e r ew a sa c t i “t yo f t ，t 0 s i n a s ei n 出ew h i t eh a i rf o m c l e ；t h ep i a t e l e tc o n t e n t sa 1 1 do t l l e r b l o o di n d e x e sw e r en o r m a l ；m e l a l l i nc o n t e n to fw h j t eh a i rw a s j u s t6 7 o fn o r m a lm o n k e y h a i r s i g l l i 士l c a i l n yd i 瓶r e n t 丘d mn o r i i l a lm o n k e yh 心；a st o l et r a c ee l e m e n t s ，f ee l e m e n t w a s s i g n i f i c a i l u yl l i 曲e r 1 a i ln o r i n a lv a l u e s ，h o w e v e r h u m a nt e m p o r a r yw h i t eh a i rw e r e o v e r d o s ei nc a ，m gc o n t e n t sa n dd e f e c ti n 盈，c uc o n o e n t s ，b u tm e r e l a t i o n s l 卸b e m e e nf e a n dw h i t ef u rs t i l lu n c l e a to n 也eo 也e rh a n d ，w h e nw e s t u d yt h et y r o s i n a s eg e n e ，w ew e r e f o u n ds e v e r a lh e t e r o z y g o s i sm u t a d o n ，也e y w e r e1 4 0 g ( g l y a s p ) ，2 1 2 t c ( p h e ，s e r ) ， 4 6 5 g c ( t h r 仃1 1 r ) ，7 8 1 t a ( a s n 门魄) ，7 8 3 p c ( a s r l l y s 或t s t o p ) ，8 5 9 t 协( s e 以趾) ， 9 5 5 g a ( g l u ，l y s ) ，9 7 8 g a ( g l l l g 1 工1 ) ，9 8 1 t a ( t y r s t o p ) ，1 3 5 3 t c ( d i 门哼r ) ， 15 18 g c ( h i “g m g h ) h 1t h i sm u t a t e ds i t e s ，f o u rw e r es y n o n y r n o u sm u t a t i o n ，t 、v ow e r e p o s s i b l ep r o d u c es t o pc o d e s ，a n do 血e r sw e r ea l lm i s s e n s em u t a t i o n b u to n l yo n e 血s s e n s e m u t a t i o np o s s i b l ya f f e c tt h e h i g h e rs m l c t l l r e ，w h i c ho c c u ra tm e 呦s m e m b e rr e 百o no f y o s i n a s ep r o t e i ns e q u e n c e t h e r eh a sn oa n yh o m o z y g o s i sm u t a t i o nd i s c o v e r i e d w h e n a s s o c i a t e dw i mp h e n o 明e s ，w ec o n c l u d e d 血a tt h i sw h i t em o n k e yc a s em a yb er e s u l t 盘o m 4 中国协和医科大学医学生物学研究所硕士研究生学位论文 a c c u m u l a t i o no fs e v e r a l h e t e r o z y g o s i s 删t a d o n ，m e s em u 伽o n sf b 珊e ds o m eu m m o w n c o m b i i l a t i o n ，t h e i ra 1 1 i e de 疵c tr e 血c e dm em b l a l l i np r o d u c t i o n ，a i l d1 e a dt ow 1 1 i t e p h e n o 呻e 5 中国协和医科大学医学生物学研究所硕士研究生学位论文 前言 恒河猴是极其珍贵的实验动物。由于与人类的亲缘关系极为相近，有9 5 以上的 基因序列与人类相似或相同，人类相关疾病几乎都在恒河猴上找到类似的病例1 1 ( 林 昆化，2 0 0 4 ) ，因此，恒河猴已成为非常难得的实验动物，它是许多重大疾病的攻克及 研究和新药开发研究的首选实验动物，并为人类疾病机理研究做出过重大贡献。因此， 开展对具有特定自发疾病的恒河猴的研究，揭示其致病机理，不仅可应用于药物实验和 基因治疗，而且可根据其相关的疾病性状基因克隆人类相关疾病或性状的基因，使其 可能成为寻找人类新基因的最便宜、最有效的途径。 人类皮肤和毛发黑色素病是困扰人类的一大亚健康难题，基于人类黑色素相关基 因设计的化妆品、保健品和药物在全球有着潜在的巨大市场f 2 1 ( 杨继章，2 0 0 4 ) 。人 类黑色素疾病( p i g m e n td i s o r d e r ) 的研究主要以小鼠为实验动物模型，通过研究及寻 找小鼠的色素相关基因再寻找人类的相关基因。但小鼠与人类亲缘关系较远，且小鼠 动物模型的构建也较困难，目前对黑色素相关基因的认识还远远不够。黑色素病变猕 猴模型迄今尚没有，不过猕猴疾病模型大多由自然突变产生，再通过一定的选育手段 将其保留下来，由于猕猴与人的亲缘关系相近，因此研究猕猴自然遗传病变，并使这 些基因在培育过程中保存下来，不但是极好的实验动物模型，而且为寻找相关表型的 基因，并研究其功能提供的非常便捷的方法。 在我所灵长类中心发现的此例自猴，是经人工养殖后，繁殖出的子代雌性猴，其 父母均为野外捕捉的表型正常恒河猴。此例白猴现已性成熟，1 0 岁，1 9 9 4 年出生，1 9 9 9 性成熟，2 0 0 2 年至2 0 0 5 年共生小猴四只，用于本例研究为稍大的三只，分别为雄性 后代m ，雌性后代f f l 、f x ，表型均为正常( 图l 所示) 。 中国协和医科大学医学生物学研究所硕士研究生学位论文 0 4 “1 4 0 s 3 4 0 图1 ：白化猴家系圈，圆圈代表雌性，方框 代表雄性。带斜线表示已死亡，带三角黑 框代表白化，其余为正常。8 4 2 为白猴编号， 0 2 5 8 2 l 为雄性后代m ，0 3 4 1 0 9 0 为f d ， 0 4 0 4 1 4 0 5 3 4 0 为r 。 f 培1 l r e l ：t h e g e n e a l o g y o f ( h ew h i t e m o n k e y c j r c l e ss i g n 缸m l e ，s q u a r e ss i g n l a l e w i mo b h q u e1 i e s i g nd i e d ， w i 血 蕾i a n 9 1 es i g nw l l i t ep h e n o t y p e 8 4 2i st l l ec o d e o fn i ew h i t em o n k e y ，0 2 5 8 2 1 i sm ，0 3 4 1 0 9 0i s f d ，0 4 0 4 1 4 0 5 3 4 0i 8r 。 此例白猴及其后代已形成本研究的自发白化皮肤毛发色素疾病的家系材料。发病情况 如下：2 0 0 2 年8 月至2 0 0 4 年8 月期间，全身大面积毛色逐渐变白，胸、背、腹部及 四肢为白色，指甲白色。但其头顶毛发约3 4 c m 颜色呈灰色，尾部毛色为淡黄色。 眼底镜检查显示：眼睛虹膜颜色正常，脉络膜正常，无眼震颤，无斜视( 如图2 所示) 。 图2 ：一例新奇的自变猕猴：全身皮毛变白，手掌，指甲，胸部黑斑完全变白。但眼睛正常 f i g u r e2 ：an o v e lw h i t em o n k 8 y ：s y s t 锄i cw h i t ef u rw i t hw h i t ep 8 l m $ t n 丑i 1 5 ，8 dd a r k8 p o to nt h ec h e s t 山u tt h ee y e s w e r en o r m a l 宅旦协碴科大学医学生物学研究所硕士研究生学位诠寸 图2 ：已确定为酪氨酸酶基因发生突变的白化病l 型“珍珍”，全身皮毛变白，包括胸部黑斑，手脚掌及指甲，视网 膜缺乏色素，完全透明，视网膜中央凹发育不良，斜视，畏光 本照片由白寿昌老师馈赠】 f i g u r e3 ：ad e 虹n i t eo c a h y p er h 瞄u sm o n k e yn a m e d “出e n z h 即”，w k c l ll e a d e db yt y r o s i n a s 。g e n ei n u t 且t i o n ，i tw a s 5 y s t e m i cw h i t e ，i n c l u d i “go h e s t ，p 8 l m 8o fh a n d s8 n df o o t s ，6 “g e ru b i l s ，a n dr “n aw 盯ec o m p l er e l y5 h o r t 。fp 培m e n t ， f o v e a lh y p 。p l a 5 i a ，s t r a b i l i s m u s a n dp h o t o p h o b i a ( t h 话p i c t u r ew a sb n d l yp r e n t e db yp m b a is h o u c h a l l g ) 变白的原因可能有多种，其中最常见的有衰老，精神紧张，微量元素缺乏等多种 因素肿1 ( 曹卉，1 9 9 9 ：姜秀梅，2 0 0 5 ；苟勇，1 9 9 9 ) 。还有一个重要的原因是遗传引 起的色素病变。遗传所致的色素病变除了常见的十多种白化病m 1 ( j fo k l l l i c z2 0 0 3 ； r i c h a r da s p r i t z2 0 0 3 ) ( s u 8 a nm c a r d e n1 9 9 8 ) ，就目前已知的来说，与色素病变有关 的位点在小鼠上有6 0 个以上f 9 1 ( z e i n e ba l h a i d a r i1 9 9 9 ) ，而已经克隆的皮毛颜色 变化基础的基因有3 0 多个与人是相对应的p 州( r i c h a r da s t u r m2 0 0 1 ) 。本例白变猕猴 是否是遗传性的色素病呢? 在白寿昌等著的珍奇白猴纵横谈一书中对所观察到的 白化动物进行了比较和描述，他认为判断是否是遗传性变白的主要特征一是全身性的 皮毛颜色变化，二是对于白化猕猴来说，重要表型是眼睛、皮肤和毛发黑色素缺陷。 但是胸部黑斑、手掌、手指指甲颜色变白，和全身性的皮肤变白是衡量是否是遗传病 变的重要指标f 1 1 1 ( 白寿昌，1 9 9 6 ) 。k i n gr a 旧也认为无论何种原因导致的色素疾病， 全身性的色素缺乏病变必然以基因的突变有关。我们在考察了本例白变猴后，发现除 了眼睛正常以外，作为白化判断重要标准，周身性皮肤变白，尤其是胸部无黑斑，手 中国协和医科大学医学生物学研究所硕士研究生学位论文 脚掌和指甲均完全缺乏黑色素是重要标志( 见图1 ) 。因此，本例白变猴可以初步推测 为遗传因素引起的白变，即是白化病。 此例白猴是哪一种白化病( 0 c m o c u t a n o u sa i b 缸l i s m ，o c a ) 昵? 白化病首先是一种 色素疾病。黑色素产生于树突状黑色素细胞，成黑色素细胞前体从神经顶端迁移到表 皮基层，黑色素在特殊的黑色素体中合成，新生的黑色素体在核周围靠近高尔基叠片 附近区域，接受酶或其它黑色素合成机制完成组装。黑色素生物合成的限速步骤是被 黑色素体酶即酪氨酸酶催化，其它的酶只起很小的作用。当黑色素体累积黑色素以后， 转运到黑色素细胞的树突状细胞中。最后在树突细胞周围，充满黑色素的成熟黑色素 体在细胞间转移，从黑色素细胞到皮肤和毛囊的角化细胞，其间的加工过程至今未完 全清楚。黑色素体在这个复杂的加工转运过程中，可能出现许多遗传中断的可能。黑 色素疾病分类为：第一类：黑色素细胞形成( d e v e l o p m e n t ) 疾病；第二类：黑色素细 胞功能疾病( 包括黑色素体功能缺陷及黑色素体生物合成及加工缺陷) ；第三类黑色素 细胞残存( s u i v a l ) 疾病。第一类疾病有白斑病及各型w a a r d e n b u r g 综合症( w s ) ， 均为显性遗传。白斑病由k i t 基因控制。各型w a a r d e n b u r g 综合症( w s ) ，其中w s l 由p a 3 基因控制，w s 2 由m i t f 及s l u g 基因控制，w s 3 由p a x 3 基因控制， w s 4 由e d n 3 、e d n r b 及s o x l o 基因控制；第二类，为现在定义的1 3 种类型的 白化病，均为隐性遗传，包括眼皮肤白化病( o c u i o c u t a n e o u sa l b l n i s m ) o c a l 4 型、 h e r m a n s k y - p u d i a k 综合症h p s l 6 型、c h e d i a k - h i g a s h i 综合症( c h s ) 。其中 o c a l 4 型分别由t y r 基因，p 基因，酪氨酸酶相关蛋白基因( t y r p ) 及m a t p 基 因控制；h e r m a n s k y _ p u d l a k 综合症h p s l - 6 型，分别由h p s l 基因、a p 3 8 1 基因、 h p s 3 基因、h p s 4 基因、h p s 5 基因、h p s 6 基因控制。c h e d i a k h 旧a s h i 综合症( c h s ) 由c h s l 基因控制，g r j s c e s y n d r o m e ( g s l - 2 型) 由r a b 2 7 a 及m y 0 5 a 基因控 制。第三类为白癜风( v l t l | i g o ) 疾病，至今未清楚其基因结构，可能为多基因控制 7 ( r i c h a r da s p r i t z ，2 0 0 3 ) 。 研究表明【6 】【8 】【1 3 】( j f0 k u l i c z ，2 0 0 3 ；s u s a nmc a r d e n ，1 9 9 8 ；u t ar u n d s h a g e 力， 2 0 0 4 ) ，从现在所知的色素疾病中，导致周身白化的主要分为o c a l ，2 ，3 三种类型， 它们分别由t y r 基因，p 基因和t y r p l 基因控制。以上三种均为眼皮肤白化，通常 患病个体眼睛都受到不同程度的损伤。作为本研究的研究对象的恒河猴为后天形成， 且除眼睛正常外，其它表型均与以上三种白化导致的皮肤毛发变自一致，所生育的四 只后代表型均为正常。所以推断就是t y r 基因突变导致，或者可以通过表型判断锁定 9 中国协和医科大学医学生物学研究所硕士研究生学位论文 在t y p ，p 和t y r p l 三个基因上，但都很不确切。 对白猴的基因突变型的有关研究情况，邹淑荃“。( 邹淑荃，1 9 8 9 ) 等从8 0 年代起 就开始培育白化猴家系，认为恒河猴白化现象迄今为止有报道的研究只有眼皮肤白化 一个类型，该型的鉴定标准为：白化恒河猴不仅皮毛变白，尚伴随先天性眼睛色素异常， 出生时就表现出白色。根据张亚平等1 6 1 ( 张亚平，2 0 0 0 ；b od i n g ，2 0 0 0 ) 对白化 恒河猴的研究表明：迄今所发现的白猴均为酪氨酸酶基因控制。w m i a m 1 7 1 ( w i l l i 锄s 0 e t t i n g ，1 9 9 4 ) 等认为白化病的判断不能仅以皮肤和毛发色素的有无来判断，还应根 据眼底眼睛色素异常与否来判断。分析发病史，本例白猴的白化现象为后天形成，且眼 睛正常，那么是否也是酪氨酸酶突变引起的昵? 如果不是，又是那一种白化病呢。是 否由于个体之间的差异，人的表型和猕猴表型的差异，本例猕猴也是由于酪氨酸酶基 因突变引起的呢? 无论如何，利用表型进行基因型的判断和推理是很不准确的，即便 我们初步认为这种改变可能不是由t t 的改变所致，也首先对酪氨酸酶基因进行研 究，只有排除酪氨酸酶基因导致突变的可能以后，才能开展下一步的工作。 中国协和医科大学医学生物学研究所硕士研究生学位论文 一、实验材料和方法 ( 一) 实验材料 1 白猴家系及5 只正常猴血液样品 白猴及1 0 只正常猴毛囊 白猴背毛及1 0 只正常猴背毛 2 p u c m - t 载体 p e g m - t 载体，d h 5 a 菌株 中国医科院医学生物学研究所灵长类 中心一部 中国医学科学院医学生物学研究所灵 长类中心一部 中国医学科学院医学生物学研究所灵 长类中心一部 大连宝生物有限公司 中国医学科学院医学生物学研究所疫 苗研究室赠送。 3 酶类 e x t a q 酶，b a m hi 限制性内切酶，连接酶，r n a 酶等购自大连宝生物 4 引物设计及合成 表1 ：酪氨酸酶基因5 对外显子引物 t a b l e1 ：t h 8p r i m e r sf o re m p l i f v5e x o so f 秒m s i n 口s 89 8 n e 5 主要试剂及试剂盒 5 1 酪氨酸酶活性实验 p b s p h ( 6 8 ) ；l 一i 匆o s i n e ( 上海生物化学工程有限公司即上海生工，下同) l d o p a ( 昆明全新生物制药厂提供) ； t r i t o n x 1 0 0 ( 上海生工) ； 5 2 黑色素含量测定 l m ll m n a 0 h 5 3 d n a 提取试剂及试剂合盒 主璺堡塑墨型查兰垦堂竺塑兰堕壅要堡主里壅皇兰竺笙苎 华舜小量d n a 提取试剂盒； 5 0 t a e ： 陆 2 4 2 9 冰乙酸5 7 1 m l e d t a ( 0 5 m ，p h 8 o ) 1 0 0 i n l 5 4d n a 凝胶回收和纯化 a ：细胞裂解缓冲液 1 0 m m o l lt r i s c i ( p h 8 0 ) ；1 l 姗o l ，le d t a ( p h 8 o ) ；o 1 ( 础) s d s ； b ：乙醇( 7 0 ) ；异丙醇；醋酸钾溶液( 醋酸钾，上海生工) c ：红细胞裂解缓冲液 2 0 m m 0 1 l r r i s c 1 ( p h 7 6 ) ；1 0 t e ( p h 7 6 ) ；l o o m m o l lt r i s - c l ( p h7 4 ) ；l o m m 0 1 ，l e d 7 i a ( p h 8 o ) ； d ：酶及缓冲液 无d n a 的r n a 酶b o v i n ep a c c r e a s ；蛋白酶k 上海生工 e ：透析袋d 4 6 经济型t x o l l l ( 7 r a k a r a ) 5 5 克隆转化 噬菌体d n a 连接酶( t a k a r a ) ；t 载体p u c m - t ( t a k a r a ) ；胰蛋白胨( b b i ) 酵母提取物( a m r e s c 0 ) ；m g c l 2 ( s a n g o n ) ： 5 6 质粒提取 主要溶液及试剂的配制： ( 1 ) l b 培养基( l u r i a b e r t a n i 培养基) ： 细菌培养用胰化蛋白胨( b a c t o 由y p t o n e )1 0 9 细菌培养用酵母提取物( b a c t o y e a s t e x t r a c t )5 9 n a c l 1 0 9 加去离子水至8 0 0 m 1 ，搅拌，使溶质完全溶解，用5 m 0 1 ，l n a 0 h 调节p h 至7 4 加入去离子水至总体积为1l ，1 5 l b f i i l 2 ( 1 0 3 4 1 0 s p a ) 高压灭菌2 0 m i i l 。 ( 2 ) l b 固体培养基： 在l b 培养基配制中加入1 5 的细菌培养用琼脂( b a c t o a g a r ) ， 1 2 中国协和医科大学医学生物学研究所硕士研究生学位论文 1 5 l b 2 ( 1 0 3 4 1 0 5 p a ) 高压灭菌2 0 m i l l ，冷却至5 0 以下( 若为氨苄青霉素或卡 那霉素抗性，此时方可加入氨苄青霉素或卡那霉素) 可倒平皿。 ( 3 ) t e ( p h 8 0 ) ： n i s 。c l 1 0 m m ( p h 8 o ) e d7 i a 1 m m ( p h 8 0 ) ( 4 ) 溶液i ： 葡萄糖s o m m t r i s h c l 2 5 m m ( p h 8 0 ) e d t a 1 0 m m ( p h 8 o ) ( 8 磅、1 5 m i n 高压灭菌) ( 5 ) 溶液i i ： n a 0 ho 2 m m s d sl ( 用前由l o m n a 0 h 和1 0 s d s 新鲜配制) ( 6 ) 溶液i i i ： 乙酸钾( 5 m ，p h 5 2 ) 6 0 i n l 冰乙酸1 1 5 m l 去离子水2 8 5 m l ( 7 ) t e ： t r i s h c l ( p h 8 o ) 1 0 m m l o l e d t a ( p h 8 0 ) l m m o 儿 ( 8 ) 5 0 t a e ： t r i s2 4 2 窑 冰乙酸5 7 1 m l e d 7 i a ( 0 5 m ，p h 8 o ) l o o m i ( 9 ) 氨苄青霉素溶液( 1 0 0 m g “) ： 1 9 氨苄青霉素溶于l o m l 去离子水，o 2 2 m 滤器过滤除菌后分装，2 0 保存。 ( 1o ) ：s t e l o m m o 】lt r i s - c l ( p h 8 0 ) ，o 1 m 0 1 ，ln a c l ，1 m m o l le d 7 i a ( p h 8 0 ) 5 7 阳极溶出伏安法测微量元素 1 3 中国协和医科大学医学生物学研究所硕士研究生学位论文 z n ( n ) 标准溶液：济南开发区齐力分析仪器厂 6 、主要仪器设备 ( 1 ) p c r 扩增仪：p e d 【i n e l l n e f 公司产品； ( 2 ) 高速离心机：e p p e n d o r f 公司产品 ( 3 ) 水浴、空气浴摇床：江苏太仓实验仪器厂产品； ( 4 ) 无菌操作台：苏州净化设备公司 ( 5 ) 荧光显微镜、恒温培养箱及各型电泳槽 ( 6 ) b a c k m a nd u 7 5 0 0s p e c t r o p h o t om e t e r 测黑色素含量 ( 7 ) q l 8 0 0 微量元素分析仪，济南开发区齐力分析仪器厂测微量元素 ( 8 ) 血液常规分析仪 测血常规 ( 9 ) 变性高效液相色谱分析仪美国t r a n s g e n o i l l i c 公司 突变检测 ( 二) 基本实验方法 1 白化病的表型判断 关于白化病的分型和判断一直以来就没有形成一个可靠的标准，最早在人们对白 化病的认识知之甚少的情况下，主要认识的白化病类型是0 c a l ，o c a 2 ，和o c a 3 型， 在这三种白化病类型中，在大多情况下，0 c a l 型为酪氨酸酶阴性，而o c a 2 和o c a 3 型为酪氨酸酶，所以在1 9 6 0 年代，d r c a r lw i t k o p 曾发展了一种叫毛囊孵化试验的方 法以分区有色素和无色素的o c a ，其方法是将白化患者的新鲜毛囊拔下来，在装有酪 氨酸或多巴的试管中孵育几个小时后，观察其毛囊细胞中是否有黑色素的形成。实际 上是观察作为毛囊细胞中是否有黑色素合成关键酶的酪氨酸酶存在，并将酪氨酸或多 巴经过多步催化反应以形成黑色素。这种试验最初将白化病分为酪氨酸酶阳性和酪氨 酸酶阴性的o c a ，但正如后来的研究探明的结果所揭示，在所有的白化病类型中，只 有o c a l 由于酪氨酸酶基因发生突变后，失去了合成酪氨酸酶的能力，才会导致酪氨 酸酶阴性。而酪氨酸酶基因的突变就目前所知有很多种可能，至少有的突变可以使表 达酪氨酸酶的活性完全失活，而有的突变只能让酪氨酸酶部分失活。酪氨酸酶活性试 验也的确验证了这种可能性，在o c a l 型中，根据酪氨酸酶的活性分为o c a l a 型和 o c a l b 型，其中o c a l a 为酪氨酸酶阴性，o c a l b 型为酪氨酸酶阳性。虽然这种简单 的实验可以将白化病分为几种类型，但后来的研究认为用这种方法得到的结果不是很 灵敏，常常有错误的酪氨酸酶阴性和酪氨酸酶阳性判断。 到了1 9 8 0 年代，临床应用上0 c a 的分型则扩展到仔细的皮肤、头发及眼睛的检 中国协和医科大学医学生物学研究所硕士研究生学位论文 查。原因是此时已经从小鼠模型中知道控制小鼠色素生成的基因位点有5 0 多个，仔细 的皮肤、头发和眼睛的检查有助于识别相应的基因型。这个时期识别的0 c a 包括白金 o c a ( p l a t 血u mo c a ) ，最低限度色素o c a ( m i n j m “p i g m e n to c a ) ，黄色0 c a ( ”u o w 0 c a ) ，温度敏感型0 c a ( t e m p e r a t u r e - s e n 8 i _ t i v e0 c a ) ，常染色体隐性眼睛白化病 ( a u t o s o m a l r e c e s s 毗o c l l l a ra l b i n i 咖) 以及黄色o c a ，当时希望每一种疾病由一个不 同的基因控制。但到了1 9 9 0 年代，发现通过头发，皮肤和眼睛的判断分型并不准确， 最好的0 c a 分型方法必须结合特定的基因变化所作的判断。 本例白变猕猴在我们作简单的表型判断以后，初步确定了：一是遗传病；二是， 可能属于0 c a l ，0 c a 2 ，或0 c a 3 中的一种；三，由于o c a l 型发病率较高，引起 0 c a l 的酪氨酸酶基因是黑色素合成的关键酶，在进行其它基因的判断前必须进行酪 氨酸酶基因的研究，另外现在已知的猕猴白化病中主要是由酪氨酸酶引起的o c a l ， 所以在有限的条件下我们首先开展对酪氨酸酶基因的调查。 2 酪氨酸活性实验 通常酪氨酸酶活性试验并不能给予白化病分型以明确的答案，但在我们确定的 o c a l 、0 c a 2 和0 c a 3 中，如果能检测到酪氨酸酶阴性结果，则可以准确的把基因型 定在酪氨酸酶的变化上，如果检测是阳性也不能排除酪氨酸酶基因发生变化。虽然如 此，在白化病的研究中，酪氨酸酶试验作为一种方法，其提示作用也是必须的。 我们在r i c h a r da k i n g f l8 1 ( r i c h a r da k i n ge ta 1 1 9 7 6 ) 的毛囊酪氨酸酶 精确试验的基础上设计了试验方案。r i c h a r da k i n g 的试验表明l 。d o p a 是酪氨 酸酶催化酪氨酸羟基化的辅因子，在没有l d o p a 存在时，1 2 0 分钟内毛囊内没有什 么反应，但l d o p a 存在的毛囊中却有明显的反应，表明毛囊孵化试验是l d o p a 依赖的。在孵化毛囊的酪氨酸中加入1 6 7 1 0 1 6 7 1 0 2m ml d o p a 时反应最为 灵敏。另外，t r i t o n x 。l o o 在活化酪氨酸酶活性方面也被应用到，t r i t o n x l o o 可能是 使酶从黑色素细胞中释放出来从而有利于分析。在孵化混合物中加入o 5 的 t r i t o n x l o o 可以极好地提高检测的灵敏度1 9 1 。( g e r t r u d e e c o s t i n2 0 0 3 ) 3 变性高效液相色谱( d h p l c ) 变性高效液相色谱( d e n a t u 血g 强曲p e m ) m a n c el i q u i dc 1 1 r o m a t o g r a p h y ，d 船l c ) 是一种新型遗传变异筛查技术。就是利用离子对反向液相色谱技术，通过独特的d n a 分离基质，对特定的p c r 反应产物进行分离。在待测样品部分变性和乙氰冲洗梯度呈 线性增加的情况下，带有突变序列的异源双链，与同源双链( 野生型或阴性对照) 相比， 中国协和医科大学医学生物学研究所硕士研究生学位论文 它们的柱保留时间相对较短。因此，带有突变序列的样品呈现出异源和同源双链混合 物的峰型特点，而不含突变序列的样品则只有同源双链的峰型。出现与野生型或阴性 对照不同的d e 碑l c 冲洗结果，说明检测样品含有突变序列。d l c 技术为确定带有 突变序列的样品提供了一种简便而直观的途径。 d h p l c 能够分析检测已知未知突变和s n p ，技术关键是美国t r a n s g e n 0 面c 的 w a 、，e 核酸片段分析系统，在专利技术的d n a s 印c a m i d g e 分离柱中的基质为聚苯乙 烯二乙烯基苯( p s _ d ) 交联聚合物微球体，固定相为碳一1 8 烷烃链，p s d 微球 体与碳一1 8 烷烃链之间形成碳碳共价键共同组成柱填料，填料是电中性、疏水性的，不 易与核酸发生反应。三乙基铵醋酸盐( t e a a ) 是一种离子对试剂，离子对试剂既是 疏水性的又带正电荷，既能与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应，同时t e a a 的疏 水基团又与固定相碳一1 8 链的疏水基团发生反应。这种离子对试剂是连接核酸和柱基质 之间的桥梁，因此，它作为“桥分子”使d n a 片段吸附在固定相上面。通过改变流动相 中乙氰及离子对试剂的浓度实现d n a 片段的分离。如图四所示，野生型和突变型的 d n a 片段经退火处理后，在复性过程中形成四种不同的组合，这四种不同的组合由于 被乙氰洗脱的效率不同从而产生四种不同的锋型。 w l f d t y p e m u t a n t 扣e e f b d u ：p j 镪x 毫sh o m o d “p l e x e s 十 鑫e i i 瓣 it h e 最 ( ： - - - - ；汉 g丁g e 图4 ：野生型和突变型d n a 样品混合后产生四种不同的组合。 f i g u r e4 ：血e r ea r ef o u rk 试d so fc o m b 曲a 丘0 na f t e rm ew i l da i l di n u t a t i o nd n as a m p l e s n l i x e d _-l-li量-ll“tllllllliil_a ；i；0；。；e，iii ，；_、。a、； 。l-i_-ia l l l l l 中国协和医科大学医学生物学研究所硕士研究生学位论文 图5 ：四种不同的组合由于被洗脱的速度不同从而形成四个不同的峰型。 f i g u r e5 ：f o l 】rd i 触mc o m b i 皿t i o s 虹呲d f o l l rd m r e mp e a k sa f t e rf l u x 疗0 md h p l c 国内外多篇研究报道均认为d h p l c 对突变的检测结果优于s s c p ，c s g e ； d g g e 和直接测序，对突变的检测与克隆测序一致，可达到9 6 。沈岩等认为“虽 然在上述情况下d h h c 无法象酶切检测那样对已知s n p 实现1 0 0 检出，但它在寻找 未知s n p 方面具有明显优势。首先，酶切无法用于搜寻未知位点的碱基改变，而且并 不是所有的s n p 都能找到相应的酶切开；其次，变性梯度凝胶电泳和单链构型多态性 均耗时长、检出率低；测序的成本又较高。而d h p l c 检测一个样品仅需几分钟，且全 自动化操作，因此可以先通过d m ，l c 对大样本进行粗筛，再对其中峰型特异者测序确 认，这样可以降低成本、提高工作效率。” 由于d h p l c 所能检测的片段在3 0 0 b p 左右比较合适，所以我们主要对酪氨酸酶 的外显子2 ，3 ，4 ，5 进行d h p l c 检测，外显子l 长8 1 9 b p ，不适合用d p l c 检测， 而用克隆测序。 4 克隆测序 克隆测序是通过t 质粒载体，连接经纯化后的d n a 片段，然后转化感受态细菌， 使d n a 片段细菌内大量扩增，由于这种扩增方式不向p c r 方法一样产大量的错配导 致的假突变，因此克隆测序是检测突变的最佳方法。将转化的细菌在平板培养基上生 长后，通过挑选阳性克隆将转化有质粒片段的菌落挑选出来，然后裂解细菌分离提取 质粒。对连接有目的片段的质粒进行测序，这样测序还有一个无法比拟的好处：因为 在目前的测序系统( s a n g e r 法) ，需要用一段引物来指导核苷酸残基按要测序的d n a 模板合成大小不同的片段，如果是直接测序时，由于引物通过是p c r 的引物，这个引 物设计时并不是百分之百的与模板匹配，如猕猴的d n a 扩增引物常常是参照人的序 列来设计的，虽然也能扩增出猕猴基因组片段，但引物确并非与模板完全匹配。此时 中国协和医科大学医学生物学研究所硕士研究生学位论文 如用这个引物去测序时，测序结果的前几十个核苷酸常常不准确或者根本就无法读出。 而当目的片段连接到质粒进行测序时，所选引物可以是质粒上的一小段序列，在这段 序列的引导下可以测得目的片段的完整序列，因此是测序的最佳方法。 5 直接测序 对外显子2 ，3 ，4 ，5 分别用直接测序法测序，每测一个片段时，均采用两条引 物从不同的方向进行测序，然后将所得结果进行拼接。、 5 1 全血d n a 的分离提取：酚氯仿抽提法 5 2p c r 扩增 外显子2 ，3 ，4 ，5 由于片段较小，分别为2 1 7 b