（水产养殖专业论文）三种鳜属鱼类gh基因的序列及多态性研究.pdf

摘要 本研究以翘嘴鳜( s i n i p e r c ac h u a t s i ) 、大眼鳜( s i n i p e r c ak n e r i ) 、斑鳜( s i n i p e r c as c h e r z e r i ) 为研究对象，采用长片段p c r 技术及t - a 克隆技术，首次成功克隆获得三种鳜属鱼类g h ( 生 长激素) 基因含完整阅读框d n a 全序列，对其序列结构、编码氢基酸序列、序列间差异及 系统发育等进行了研究并根据g h 基因各区域序列特征综合运用p c r s s c p 、p c r r f l p 、 微卫星、内含子长度多态性检测及测序等多种方法对三种鳜属鱼类东洞庭湖野生群体进行 了g h 基因多态性检测及群体遗传结构分析。这些研究从生长激素基因的角度揭示了三种 常见养殖鳜类阃生长性状差异的分子遗传背景，为鳜鱼的分子育神奠定了基础。主要研究 结果如下： 1 翘嘴鳜g h 基因序列全长5 5 4 8 b p ，大眼鳜g h 基因序列全长5 4 8 3 b p ，斑鳜g h 基因 序列全长5 7 8 9 b p ，均含有6 个外显子和5 个内含子。将三个序列作为翘嘴鳜、大眼鳜、斑 鳜g h 基因序列提交g e n b a n k 数据库，经审核通过，获得注册号，分别为e f 2 0 5 2 8 0 、e f 2 0 5 2 8 1 、 e f 4 4 1 6 2 3 。在本研究中，采用长片段p c r 技术直接从基因组d n a 成功克隆较大的基因，显 示了该技术在后基因组时代生物基因组研究中的良好应用前景。 2 、经对三种鳜属鱼类g h 基因d n a 序列迸行比较，发现三者差异主要存在于第l 、2 、 3 内含子。第4 、5 内含子及外显子差异较小。三种鳜鱼g h 基因序列差异主要表现为邻近 序列的重复、d n a 片段的缺失或插入及单碱基差异。 3 、从g h 基因d n a 序列推导氨基酸序列，翘嘴鳜与大眼鳜在g h 氨基酸序列水平上不 存在种间差异，两者与斑鳜间仅存在第1 5 0 位氨基酸差异。在该处，斑鳜为蛋氨酸( m ) ， 翘嘴鳜、大眼鳜均为亮氨酸( l ) 。 4 、在三种鳜鱼g h 基因第二内含子中，均发现a g 微卫星重复序列。经在群体中检测， 该位点具有较高多态性。成功开发出了鳜属鱼类位于已知功能基因内部的具有丰富多态性 的微卫星位点。该微卫星标记极有可能与生产性状相关。 5 、在三种鳜鱼g h 基因第三内含子末端，均发现一处第三内含子与第四外显子交界处 3 7 b p 极端保守序列的重复。从g e n b a n k 数据库下载的其余十一个物种g h 基因中，除尖吻 鲈g h 基因在第三内含子末端具有该序列的不完全重复外，4 种鲈形目鱼类及6 种非鲈形目 脊椎动物g h 基因均缺少该重复序列。 6 、经采用p c r s s c p 、p e r r f l p 、微卫星、内含子长度多态性检测及测序五种检测方 法结合对翘嘴鳜、大眼鳜、斑鳜三个群体进行序列多念性检测，七个位点共检测到3 8 个 单倍型。其中，3 1 个单倍型为单个物种独有单倍型。各单倍型在种问的分布具有较强的物 种特异性。 7 、经序列比较及群体中多态性检测发现，g h 基因第1 、2 、3 内含子长度在三种鳜鱼 间具有种问特异性。 8 、在g h 基因7 个位点中，斑鳜的多念位点数为6 个，其他两个物种的多态位点数为 i 。 5 个。斑鳜、大眼鳜、翘嘴鳜的位点平均等位基因数分别为2 4 3 个、2 4 3 个、1 8 6 个， 平均有效等位基因数分别为】5 个、】3 5 个、1 3 6 个。斑鳜遗传多样性( 0 4 4 ) 略大于翘 嘴鳜( 0 3 8 ) 及大眼鳜( 0 3 5 ) 。 9 、在三种鳜鱼野生群体中，对遗传多样性在种间及种内分布情况分析结果表明，种内 多样性占总体多样性的2 9 7 ，种间多样性占总体多样性的7 0 3 。g h 基因多样性主要以 种间多样性形式存在。各位点平均f s t 值( 物种分化指数) 为0 6 8 ，n m ( 基因流) 平均值 为0 1 2 。物种间分化较大，种间基因交流较少。 1 0 、利用三种鳜鱼g h 基因全序列及各位点多态性检测结果分别构建系统发育树，两 者拓扑结构一致。在系统发育树中，翘嘴鳜与大眼鳜首先聚为一支，然后再与斑鳜聚为一 枝，说明在系统进化中，斑鳜可能最先从共有祖先物种中分化出来。 关键词：翘嘴鳜：大眼鳜：斑鳜；g h 基因；克隆；d n a 序列；多态性 a b s t r a c t s i n i p e r c ac h u a t s i ，s i n i p e r c ak n e r ia n ds i n 由e r c as c h e r z e r iw e r es t u d i e dw h i l el o n gp c r a n dt ac l o n i n gt e c h n i q u ew e r eu s e dt oc l o n eg h ( g r o w t hh o r m o n e ) g e n ec o n t a i n i n gc o m p l e t e r e a d i n gf r a m eo ft h r e ef i s h e so fs i n i p e r c a t h e ns e q u e n c es t r u c t u r eo fg hg e n e ，a m i n oa c i d s e q u e n c ee n c o d i n gb yd n a d i f f e r e n c eb e t w e e ns e q u e n c e sa n d p h y l e t i ce v o l u t i o nw e r es t u d y i n g p o l y m o r p h i s md e t e c t i o n so fg hg e n ea n ds t u d i e so fh e r e d i t a r yc o n s t i t u t i o no fp o p u l a t i o nw e r e u n d e r t a k e ni nw i l dp o p u l a t i o n sc o m i n gf r o me a s t e r n d o n g t i n gl a k eu s i n gp c r s s c p , p c r - r f l p s s r ，p o l y m o r p h i s md e t e c t i o no fi n t r o na n ds e q u e n c i n g t h e s es t u d i e sr e v e a l e dt h e m o l e c u l a rh e r e d i t i s mb a c k g r o u n do fg r o w t hd i f f e r e n c eb e t w e e nt h r e ef i s h e so fs i n i p e r c aw h i c h w e l ef a r m e di nc h i n aa sw e l la se s t a b l i s h e df o u n d a t i o nf o rm o l e c u l a rb r e e d i n go fm a n d a r i n f i s h t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 1 1 l r e em a n d a r i n f i s h sc o m p l e t eg hg e n e sw e r ee l o n e ds u c c e s s f u l l yu s i n gl o n gp c r r e c o m b i n e dc l o n e sw e r es e q u e n c e d t h el e n g t ho fg h g e n eo fs c h u a 坫il s k n e r ia n ds ，s c h e r z e r i w e r e5 5 4 8 b p ，5 4 8 3 b pa n d5 7 8 9 b pr e s p e c t i v e l y t h e s es e q u e n c e sh a v eb e e nv e r i f i e da n dg i v e n a c c e s s i o nn u m b e r sa f t e rt h c yw e r es u b m i t t e dt og e n b a n k t h e i ra c c e s s i o nn u m b e r sw e r e e f 2 0 5 2 8 0 e f 2 0 5 2 8 1a n de f 4 4 1 6 2 3r e s p e c t i v e l y l o n gp c rd i s p l a y e dg o o d p r o s p e c t si n g e n o m i cs t u d yi np o s tg e n o m i cp e r i o da si tc o u l db eu s e dt oc l o n el o n gg e n ef r o mg e n o m i cd n a d i r e c t l y 2 m a i nd i f i e r c n c ew e r ef o u n di nt h ei s t 2 n da n d3 r di n t f o nw h i l et h r e eg hg e n e sw e r e c o m p a r e d n e4 t ha n d5 t hi n t r o nh a dl i t t l ed i f f e r e n c e t h e s ed i f i e r e n c ec a m ef r o mr e p e a t so f n e a rs e q u e n c e d e l e t i o n so ri n s e r t i o no fd n a f r a g m e n ta n ds i n v i en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m m a i n l y 3 a m i n oa c i ds e q u e n c e sw e r ed e d u c e df r o md n a s e q u e n c e so fg hg e n e ，a n dc o m p a r i s o n s w e r ed o n e i n t e r s p e c i f i cd i f i e r e n c eo fa m i n oa c i ds e q u e n c ec o u l d n tb ef o u n db e t w e e n 量c h u a t s i sg ha n ds k n e r i sw h i l eo n ed i f i e r e n c eo fa m i n oa c i de x i s t e da tl o c u s1 5 0b e t w e e n t h e ma n ds s c h e r z e r i s s c h e r z e r ih a dm e t h i o n i n ei n s t e a do fl e u c i n ew h i c ht h eo t h e rt w oh a d l e u c i n ea tt h i s1 0 c u s 4 m i c r o s a t e l l i t ew h o s ec o r es e q u e n c ew a sa gw a sf o u n da m o n ga l l2 n di n t r o no fg hg e n e o ft h r e em a n d a r i n f i s h d e t e c t i o n a m o n gp o p u l a t i o n sp r o v e d t h a tt h el o c u sh a dh i 曲 p o l y m o r p h i s m 0 n em i c r o s a t e l l i t el o c u s i n gi nm a i nf u n c t i o n a lg e n ew a sd i s c o v e r e di nf i s h e so f s i n i p e r c a t h i sl o c u sh a dp o s s i b l et oc o r r e l a t ew i t he c o n o m i cc h a r a c t e r 5 0 n ec o n s e r v a t i v es e q u e c ee x i s t e di nb o u n d a r yb e t w e e n3 r di n t r o na n d4 t he x o nw h o s e l e n g t hw a s3 7b ph a do n er e p e a ta tt h ee n do f3 r di n t r o no fa l lt h r e eg hg e n e s o t h e r1 0g h g e n e so fv e r t e b r a t es e p c i e sd o w n l o a d e df r o mg e n b a n kh a d n tt h er e p e a tw h i l et h eb a r r a m u n d i 伍c a l c a r f 尼r ) h a do n ep a r t i a lr e p e a t 6 p o l y m o r p h i cd e t e c t i o n sw e r ed o n ea m o n g t h r e ew i l dp o p u l a t i o n sf r o ms c h u n t s is k n e r i a n ds s c h e r z e r ir e s p e c t i v e l yu s i n gp c r - s s c p , p e r r f u js s r ，l e n g t hp o l y m o r p h i cd e t e c t i o n o fi n t r o n sa n ds e q u e c i n g 3 8 h a p l o t y p e sh a db e e nf o u n da t 7i o c u s e s 3 1 h a p l o t y p e sw e r e p o s s e s s e do n l yb yo n es p e c i e sa m o n gt h e s eh a p l o t y p e s d i s t r i b u t i o no fh a p l o t y p e sb e t w e e n s p e c i e sh a ds t r o n gs p e c i f i c i t y 7 t tw a sf o u n dt h a tt h el e n g t ho ft h ei s t 2 n da n d3 r di n t r o nh a ds p e c i f i c i t yb e t w e e ns p e c i e s w h e ns e q u e n c ec o m p a r i s o n sa n dp o l y m o r p h i cd e t e c t i o n sa m o n gp o p u l a t i o n sw e r eu n d e r t a k e d 8 s s c h e r z e r ih a d6p o l y m o r p h i cl o c u s e s a n dt h eo t h e rt w oh a d5p o l y m o r p h i cl o c u s e s r e s p e c t i v e l ya ta l l7l o c u s e s s s c h e r z e r i 。s k n e r ia n ds c h u a t s jh a d2 4 3 ，2 4 3a n d1 8 6a v e r a g e i i i a l l e l e s a n dh a d1 5 ，1 3 5a n d1 3 6a v e r a g ee f f e c t i v e a l l e l e s r e s p e c t i v e l y s s c h e r z e r i s p o l y m o w h i ci n d e xw a s0 4 4 ，h i g h e rt h a ns c h u a t s iw h i c hw a s0 3 8 ，a p p r o x i m a t e t os k n e r i s 0 3 5 9 t h ea n a l y s i sa b o u td i s t r i b u t i o no fg e n e t i cp o l y m o r p h i s mi n t h r e ew i l dm a n d a r i n f i s h p o p u l a t i o n si n d i c a t e dt h a ti n t r a s p e c i e sp o l y m o r p h i s ma n di n t e r s p e c i e sp o l y m o r p h i s ma c c o u n t e d 7 0 3d e r c e n ta n d2 9 7p e r c e n ti nw h o l ep o l y m o r p h i s mr e s p e c t i v e l y g hg e n ep o l y m o r p h i s m d i s p l a y e da si n t r a s p e c i e sp o l y m o r p h i s mm a i n l y a v e r a g ef s t ( s p e c i e sd i f f e r e n t i a t i o ni n d e x ) w a s 0 6 8 a v e r a g en m ( g e n ef l o w ) w a so 1 2 t h r e es p e c i e s h a ds t r o n gd i f f e r e n t i a t i o na n dl i t t l e e x c h a n g eo fg e n eb e t w e e nt h e m 1 0 p h y l o g e n e t i ct r e ew e r ec o n s t r u c t e db a s i n go ns e q u e n c ec o m p a r i s o n 硒w e l la sg e n e t i c d i s t a n c eb e t w e e np o p u l a t i o n sw h i c hw e r ec a l c u l a t e da c c o r d i n gt h e r e l u i to fp o l y m o r p h i c d e t e c t i o n t 1 l et r e e s t o p o l o g yw e r ei d e n t i c a l k n e r ia n di s _ c h 口坫fc l u s t e r e db e f o r ee l u s t e rw i t h s s c l l e r z e ni nt h et r e e s i ti n d i c a t e dt h a ts s c h e r z e r id i f f e r e n t i a t e df r o mc o m m o na n c e s t e re a r l i e r t h a n 旦k n e r ia n ds c h u a t s i k e yw o r d s ：s s c h e r z e r i ；s k n e r i ；s c h u a t s i ；g hg e n e ；c l o n e ；d n as e q u e n c e ；p o l y m o r p h i s m 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 研究生签名： 考ft 向 时间： 枷7 年多月，日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文 的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：南商 时白j ： 矽7 年z 月口同 导师签名 ，) 弘k 吼 州：易。7 。年石月，腑 1 前言 1 1 鳜鱼养殖及研究现状 1 1 1 鳜类分类地位及起源 鳜类属于硬骨鱼纲、鲈形目，关于其分类地位仍未有统一意见。国内常将其归于鲐科 ( s e r r a n i d a p ) 。g o s l i n e 根据形态、生理特征，将鳜类等2 0 个属j 0 个种从鲳科中独立出来， 另设暖鲈科( p e r c i c h t h y i d a 0l ”。r o b e r t s 贝o 建议将鳜类独立成鳜科( s i n i p e r c i d a 曲i2 1 。 鳜类分为两属( 鳜属和少鳞鳜属) 或三属( 少鳞鳜属、鳜属、长体鳜属) 1 3 】，其天然分布 区北至黑龙江流域，南至海南岛北部，东至是日本本洲岛，西至金沙江下游带。鳜类最 早的化石发现于始新世地层，代表种为湖南省临澧县始新世地层中发现的秀丽洞庭鳜及下 湾铺洞庭鳜i ，】西村三郎( 1 9 6 7 ) 对鳜类的起源和进化进行了研究，认为鳜类中的少鳞鳜属 最为古老，分布于包括日本的整个东亚地区。鳜属鱼类均起源于东亚大陆，其中最后分化 出来的是翘嘴鳜。由于被海洋阻隔，分化较迟的鳜属在日本没有分布l ”。 1 1 2 鳜鱼养殖现状 鳜鱼是我国名贵淡水食用鱼类，经济价值高消费需求大，近年来，国内鳜鱼养殖发 展迅速，成为淡水水域主要特种水产养殖对象之一【5 6 1 。我国现有鳜鱼养殖种类有翘嘴鳜 ( s i n i p e r c as c h e r z e r i ) 、大眼鳜( s i n i p e r c ak n e r i ) 、斑鳜( s i n i p e r c ac h u a 括i ) 等几个物种。 这几种鳜鱼同属鳜属，外形特征相似，生活习性基本相同，但生长速度、抗病力等有关性 状差异较大。其中，翘嘴鳜生长速度最快，大眼鳜次之，斑鳜最慢。斑鳜虽然生长速度较 慢，但抗病力较强，肉质好，并在国外尤其是韩国拥有较大市场i ”。 尽管鳜鱼养殖发展迅速，但其作为一种有很大发展潜力的养殖对象，与常规养殖鱼类 相比，也具有明显的不足。鳜鱼是肉食性鱼类，喜活食，生长速度较慢( 在长江天然水域 中2 龄鱼仅达3 0 0 克) ，饵料系数较大( 5 左右) ，饵料成本较高。同时，现有鳜鱼养殖中 苗种来源混杂，捕捞野生苗、野生亲鱼繁殖鱼苗、人工养殖亲鱼多代近亲繁殖鱼苗都被应 用于生产。尚未见有人工育成鳜鱼品种用于养殖生产的报道。在人工繁殖中，近亲交配、 有意或无意的种问杂交使种质开始退化1 7 ，鄹。人工繁殖的后代逃逸进入天然水体也可能对 种质资源造成污染。 为促进鳜鱼养殖健康可持续发展，有必要培育生长快速、种质纯正的优良养殖品种。 1 1 3 鳜鱼研究现状 迄今为止，对鳜鱼研究主要集中于养殖和疾病防治方面，对其种质资源的研究起步较 迟。孔晓瑜等( 1 9 9 2 ) 对鳜亚科9 种鱼类的l d h 同工酶进行了比较研究。结果表明9 种鱼的l d h 同工酶表型具有明显的种问差异1 9 j 。陈军等( 2 0 0 2 ) 对翘嘴鳜和大眼鳜的年龄生长和繁殖 力进行了比较研究，研究表明，在华南地区，翘嘴鳜的性成熟年龄为2 龄，大眼鳜的性成 熟年龄为3 龄，翘嘴鳜的生长速度和繁殖力均优于大眼鳜i ”】。杨受保等( 2 0 0 3 ) 采用2 0 个 1 随机引物对三个鳜鱼群体进行7 r a p d 检测【1 1 】。唐冬生等( 2 0 0 5 ) 克隆了鳜鱼的3 个r r n a 基 因及其间隔序列，对鳜鱼与其他动物的同源性和进化关系进行了分析，并以间隔序列为靶 位点构建了基因打靶载体【1 2 1 3 l 。陈艺燕等( 2 0 0 4 ) 测定了翘嘴鳜的线粒体细胞色素b 基因 编码序列1 1 4 1 。方展强( 2 0 0 5 ) 用r a p d 技术对鳜野生群体与养殖群体进行了分析，认为养殖群 体的遗传多样性与野生群体相比显著降低【1 5 1 。王伟伟等( 2 0 0 6 ) 扩增得到斑鳜6 个地理群 体m t d n ac y tb 基因的部分序列及5 个群体m z d n a 控制区序列，并进行了比较，认为我国斑 鳜不同地理群体间已产生明显的遗传分化【1 6 t1 7 】。 这些研究为了解鳜鱼的遗传多样性做了一些初步工作，但至今尚未见有与鳜鱼生长、 抗病等经济性状相关的分子标记筛选的报道。现用于养殖的三种鳜鱼，即翘嘴鳜、大眼鳜、 斑鳜的生长及抗病性状差异较大。生长激素基因是影响鱼类生长性状的主效基因，并与免 疫系统的发育有关限1 9 】。克隆三种鳜鱼g h 基因，对其核苷酸序列进行比较，并在群体中检 测该基因种问特异性和种内多态性，将可能揭示鳜鱼种间及种内经济性状差异的分子基 础，在分子水平对鳜鱼的种质资源特性进行研究，为鳜鱼的分子育种提供科学的理论依据 和相关技术。 1 2 生长激素基因研究进展 1 2 1 生长激素蛋白质结构及生理机能 1 2 1 1 生长激素蛋白质结构 生长激素首次于1 9 4 5 年从垂体中分离鉴定，是由脑垂体前叶合成和分泌的多肽类激素 由1 9 0 个左右氨基酸组成，分子量约2 2 k d 。人的成熟g h 蛋白由1 9 1 个氨基酸组成，分子 量2 2 0 0 5 d a ，具有4 个半胱氨酸( c y s ) ，组成2 对二硫键c 5 4 c 1 6 5 ，c 1 8 2 一c 1 8 9 2 0 j 。对各种 动物g h 一级结构同源性分析表明，同目、同科物种之间g h 序列高度同源，硬骨鱼类不同 目之间的同源性较低，只有5 3 - 5 5 2 ”。川鲽g h 仅有1 7 2 个残基，是迄今发现的脊椎动物 中氨基酸残基最少的g h ，鱼类g h 从1 7 2 ( 川鲽) 个到1 9 0 ( 鳗鲡和鲟) 个氨基酸不等，但 大多数由1 8 7 1 8 8 个组成。鱼类g h 中有4 4 个严格保守的残基，其中2 8 个在所有脊椎动 物g h 中都存在，保守残基在2 3 2 5 、8 8 - 9 9 、1 3 4 - 1 4 4 和1 8 8 2 1 5 ( 与其他脊椎动物g h 校 准后编号) 残基间聚集成区。 1 2 1 2 生长激素生理机能及作用途径 生长激素是调控动物生长发育和代谢的重要激素，在动物生长及糖、蛋白质、脂肪代 谢等过程中起到重要作用，可促进肌肉、骨骼生长，降低肌体脂肪含量，提高饲料报酬， 并对免疫系统发育和维持有重要影响阻2 ”。在鱼类中，生长激素能促进鱼体生长，提高淋 巴细胞的抗病毒能力及鱼体的抗感染能力，并同洄游性鱼类的海水适应过程有关l 吲。在人 体中，由于g h 通过与其受体结合，刺激i g f - 1 及其结合蛋白i g f b p 的产生，进而对细胞的 增殖、分化和凋亡进行调节，其在癌症的发生和发展中起到重要作用p 。 2 生长激素的分泌受丘脑下部生长激素释放激素( g h r h ) 和生长激素释放抑制激素 ( g h r i h ) 双重调节i 绷。g h 的作用途径主要有两条，它可直接作用于靶细胞，也可诱导肝细 胞等产生i g f l ，再经由i g f 一1 间接起作用。其作用机理主要是通过多种途径调节相关基 因的转录及表达，最终发挥其生理功能，调节过程牵涉到大量基因及细胞因子，其中部分 作用机理至今仍不甚明了 2 8 - 3 0 】。 生长激素可直接作用于肝脏、脂肪组织、肌肉等细胞，促进脂肪分解，刺激葡萄糖进 入肌肉细胞，加速蛋白质合成，增加肌肉重量和蛋白质沉积【3 1 ，3 2 1 。同时，g h 通过降低肌体 内葡萄糖转化为脂肪酸的速度，抑制脂肪酸合成酶r 删a 的转录和乙酰c o a 羧化酶( c b x ) 、 脂肪合成酶的活性，抑制脂肪酸的合成，促进脂肪的分解，从而减少脂肪的沉积【3 3 卅。 在间接作用途径中，g h 分泌出来后，与血液中的生长激素蛋白( g h b p ) 结合( g h b p 能延长g h 的半衰期，缓冲g h 脉冲式分泌的波动) 。g h 通过血液循环运输到体内各组织器 官。由于g h 分子上有两个g h r 结合位点，能同时结合二个g h r 分子，其与靶器官( 主要 是肝脏) 上的生长激素受体( g h r ) 结合，能使两个生长激素受体形成二聚体，通过该信 号途径促进i g f 一1 ( 胰岛素样生长因子) 分泌。i g f 一1 与其受体结合，导致胰岛素受体底 物一l ( i r s 一1 ) 磷酸化，通过丝裂原激活蛋白激酶( r a s m a p k ) 途径和磷脂酰肌醇3 一激酶 ( p 1 3 一k ) 途径，发挥其调节代谢、促蛋白质合成、促生长作用。肝外组织( 如软骨组织) 也能分泌i g f 一1 。g h 通过诱导软骨组织i g f l 的表达促进其生长【3 5 , 3 6 1 。 近年的研究表明，生长激素还可广泛地在淋巴细胞等免疫相关细胞中表达，这种旁分 泌作用可能与免疫系统功能的维持有关1 1 9 】。同时，许多衰老时的生理、病理变化都可能与 g h 分泌的改变有关【3 7 , 3 8 1 。 1 2 1 3 生长激素的种属特异性 g h 具有一定的种属特异性，其种属特异性主要表现在与受体结合的亲和力上。h g h 虽 可促进鱼的生长，但对鱼g h r 的结合能力比鱼g h 低1 5 0 倍，而鱼g h 对哺乳动物g h r 无任 何结合活性【3 9 】。其他物种生长激素对特定鱼种促生长作用并不理想，并可能引起鱼体的免 疫反应。 1 2 2 生长激素基因序列 1 22 1 生长激素基因家族 生长激素与催乳素( p r o l a c t i o n ，p r l ) 、胎盘催乳素( p l a c e n t a ll a c t o g e n ，p l ) 同 属一个基因家族，广泛存在于各种脊椎动物中【4 0 】。在鱼类中，还有另一个该基因家族成员， 即生长催乳素( s o m a t o l a c t i o n ，s l ) 。 灵长类动物具有g h 基因簇。人g h 基因簇包括交错排列的2 个g h 基因和3 个胎盘催 乳素基因1 4 1 ，4 ”。绒猴g h 基因簇具有8 个类g h 基因及假基因，而卷尾猴则具有4 0 个以上类 g h 基因及假基因【4 ”。在已报道的硬骨鱼类g h 中，大麻哈鱼、r 本鳟鱼、虹鳟、鲑鱼、银 大麻哈鱼、大西洋鳕鱼、鲫鱼、鲤鱼等具有两种不同类型的g h ，由两个g h 基因产生l 删。 鲫鱼、鲤鱼的g hi 与g h 】i 成熟肽都具有1 8 8 个氨基酸，其中，g h l i 具有4 个半胱氮酸残 3 基，与其他脊椎动物相同，而g hi 有5 个半胱氨酸残基。具有两个g h 基因的鱼类在进化 过程中都经历了四倍体阶段【“舶l ，在鱼类中出现两种g h 基因可能与染色体多倍化有关。 其余鱼类中只具有一种g h 基因。 1 2 2 2 生长激素基因结构 哺乳动物的生长激素基因具有5 个外显子，4 个内含子，长约2 k b ，转录起始点上游 具有一个t a t a 盒，从t a t a 盒到起始密码子a t g 间的序列高度保守。g h 基因终止密码子到 加尾信号从t a a a 框间的非编码区序列，也具有一定的保守性。哺乳动物外显子和内含子 之间的剪切序列符合g t - a g 规则，但猪内含子5 端例外，由g c 代替了g ”。鸡具有两 个t a t a 盒，一个为“t a t a a a t ”，位于一1 4 5 b p ；另一个为“t a t a t a a ”，位于一2 4 b p m 】。 鱼类生长激素基因结构具有较大差异，具有3 5 个内含子不等。鳗鲡g h 基因只具有3 个内含子，鲤形目和鲶形目通常具有4 个内含子，而鲑形目和鲈形目具有5 个内含子。但 鲑形目g h 基因与鲤形目比与鲈形目具有更高的同源性1 4 9 l 。鱼类生长激素基因与哺乳类和 鸟类相比，部分鱼类物种序列较长l s o l 。 生长激素基因外显子碱基总数在不同物种间差异较小。内含子长度则在不同物种间尤 其在鱼类物种间差异较大，一般比外显子长，碱基总数大约占基因全长的6 0 至8 0 。哺乳 动物和鸟类的内含子g c 含量大于a t 含量，而鱼类则a t 含量大于g c 含量。 总的来说，鱼类g h 基因与其他脊椎动物相比，具有较高的多态性【5 ”。 1 2 2 3 鱼类生长激素基因研究现状及前景 鼠和人的生长激素基因最早被克隆。至今哺乳动物和鸟类中已有许多物种的生长激素 c d n a 被克隆测序【5 2 1 ，有部分种类已获得d n a 全长序列【5 3 ，5 4 。鱼类生长激素基因研究起步 相对较晚。1 9 8 5 年s e k i n e 等克隆了第一个鱼生长激素c d n a 并将其重组到大肠杆菌中表达。 至今为止，己克隆较多鱼类生长激素c d n a 序列，但只有个别种类获得了d n a 全长序列1 5 ”j 。 翘嘴鳜、大眼鳜、斑鳜g h 基因d n a 序列至今未见报道。张竞男等( 2 0 0 5 ) 克隆了大眼鳜 等鱼类g h 基因c d n a 序列，但仅进行了进化分析，未作进一步研究p 。 在早期，对鱼类生长激素基因克隆和表达的目的主要是为了转全鱼生长激素基因，提 高养殖鱼类生长速度【5 9 6 0 i ；或将生长激素基因通过微生物表达，以期获得大量生长激素添 加于饲料中投喂，达到提高生长速度、降低饵料系数的目的i “彤j 。由于食品安全方面的考 虑，以及基因污染的可能危害，这两条途经在近期都将很难应用于生产。近几年来，在畜 禽生产中，获得主效基因d n a 全长序列、利用主效基因序列的多态性进行分子标记辅助育 种，培育生长加快、生产性能提高的新品种己r 益得到育种界的重视。生长激素基因在动 物生长发育中的重要性，使其成为利用其多念性进行辅助育种的最佳目标基因之一i 的j 。利 用g h 基因多念性进行辅助育种可能成为鱼类g h 基因研究的重要方向。 1 2 3 生长激素基因多态性研究现状 在畜禽中，生长激素基因多态性分析被广泛用于多念性与生产性状相关性研究。k n o r r 通过研究p g h 基因与性状间相关性发现，梅山猪皮特兰猪的杂交后代中，脂肪相关性状 和p g h 基因酶切多态性问存在显著相关旧。p i e r z c h a l a 等对一个参考家系( z s p l w ) 的 研究表明，p g h 基因不同基因型与瘦肉率和胴体性状间存在显著相关1 6 8 l 。c h e n g 等发现桃 源猪日增重和饲料利用率与p g h 基因t a qi 酶切位点多态性显著相关1 6 。宋成义等对姜曲 海猪g h 基因部分突变位点与生产性能关系的研究结果表明，a p ai 酶切的不同基因型个体 7 0 日龄体重和o 一7 0 日龄日增重有显著差异【删。l i 等( 2 0 0 6 ) 对容江猪g h 基因进行了克隆 及序列分析，并以四个西方猪种和九个地方猪种群体为材料，进行了g h 基因酶切多态性研 究，认为第四外显子一处导致氨基酸残基替换的单核苷酸突变可能造成g h 与其受体亲和 力下降i7 0 】。牛g h 基因多态性研究中，发现第1 2 7 、1 7 2 位核苷酸及第5 外显子至3 端部 分位点存在变异。第1 2 7 位变异导致产生两种氨基酸即亮氨酸和缬氨酸。在h o l s t e i n 奶 牛中亮氨酸纯合型产奶量较高”，在s i m m e n t a l 牛中，杂合型个体胴体重显著高于纯合型。 r o c h a 等在杂交肉牛研究中发现，g h 基因用t a qi 消化产生的a 、b 、c 、d 四个等位基因中 b 、c 、d 与出生重、出生肩宽相关1 7 2 j 。f o t o u h i 等对来自于同一基础群，对腹脂性状进行 正反向6 个世代选择形成的高腹脂、低腹脂两个肉鸡品系进行g h 基因多态性研究，发现 四个酶切多态位点，位于外显子或内含子中，其中两个位点在两品系中的频率具有明显差 异，并通过分析证明该差异是由于对腹脂的选择压力造成的t 7 3 1 。o u 等( 2 0 0 7 通过对不同 g h 基因型的梅花鹿鹿茸产量的比较研究，发现基因型与茸产量问存在显著相关【。 在人类中，g h - i 基因内含子剪切位点的单核苷酸突变可形成生长激素缺乏症1 7 5 ，7 6 】，而 基因上游启动子区域及转录因子结合区域的核苷酸突变可能影响基因的表达1 7 ”。w a g n e r ( 2 0 0 5 ) 等的研究表明，人g h 基因启动区域的部分突变与乳癌症患病风险有关1 2 6 1 。w a l p o l e 等( 2 0 0 6 ) 研究发现，人g h 一1 基因第四内含子中处影响g h 分泌量的单核苷酸差异与运 动员赛后体温高低有关1 7 8 】。g l o r i a - b o t t i n i 等( 2 0 0 6 ) 研究表明，人g h 基因酶切多态性 与i i 型糖尿病病人中的体重超重相关1 7 9 i 。 ， g h 基因多态性还可用于系统发育分析。s o d h i 等( 2 0 0 7 ) 通过检测印度瘤牛g h 基因 第三内含子m s p i 酶切多态性，并与欧洲牛种进行比较，证实m s p l ( 一) 单倍型起源于印度 l 舯】。 尽管将基因多态性应用于畜禽育种及人类疾病诊断中取得了丰硕成果，然而，在鱼类 育种中，尚鲜有报道。关于鱼类生长激素基因多态性研究，国内仅有莫赛军等( 2 0 0 4 ) 应 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及p c r s s c p 对鲫鱼生长激素基因内含子多念性进行了检测【8 1 j ： 倪静等( 2 0 0 6 ) 对牙鲆g h 基因外显子应用p c r s s c p 技术进行了多念性检测，发现了两种基 因型，两种基因型个体在体重及头长上存在显著的差异【8 2 j 。 1 3 基因多态性研究方法 进行基因多念性研究，需要选择适当的分子标记方法。理想的遗传标记应陔具备高度 多念、数量多、共显性等特点。最早的d n a 标记为限制性片段长度多念性( r f l p ) ，被称 5 为第一代基因遗传标记。随后，r a p d 、微卫星标记( s s l p ) 、a f l p 等分子标记方法得到发 展，可称为第二代遗传标记。第一代和第二代遗传标记主要检测的是酶切或p c r 产物长度 的多态性，也能检测少量单核苷酸多态性。然而，遗传物质d n a 上的遗传变异更多体现在 单个碱基变异水平，例如人类基因组d n a 多态性中单核苷酸多态性( 指发生在d n a 特定位 置上的单个碱基变异，包括转换、颠换、插入、缺失等) 占总多态性的9 0 左右。单核苷 酸多态性( s n p s ) 在生物基因组中广泛存在，具有多态信息量大、易于检测和统计分析等 优点，在一定程度上弥补了以前各种d n a 分子标记方法的不足，成为具有广泛应用前景的 第三代遗传标记方法惮”。 检测s n p s 的方法根据原理可分为多种类型。较常用的有两类：一种是根据d n a 构象 的不同寻找s n p s ，包括温度梯度凝胶电泳( t g g e ) 、变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 、单链构象 多态性( s s c p ) 以及变性高效液相色谱技术( d h p l c ) ；另一种是基于p c r 和酶切的方法 ( p c r - r f l p ) 。其中p c r r f l p 、p c r - s s c p 操作较为简单，所需条件不高，检测结果准确可 靠而较为常用【洲。此外，由于测序费用的降低，p c r 产物直接测序近年来也得到发展。基 因芯片、质谱仪检测等检测方法费用相对较高，国内一般实验室难以采用旧。 在以上各种标记中，能精确定位于基因的标记称为i 型标记，其他均为i i 型标记。i i 型标记不利于不同物种间的比较，不能通过比较基因组学方法利用模式物种基因组信息来 进行比较作图，不利于遗传图谱与物理图谱的比较和结合，不利于实验室间的交流m j 。因 此，开发i 型标记成为构建第三代遗传