（农药学专业论文）新型氨基磷酸衍生物抑菌活性筛选及作用机制初步研究.pdf

贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 摘要 本论文采用生长速率法对本中心合成的新型氨基磷酸衍生物进行抑菌活性 筛选，发现了活性较好的氨取代苯并噻唑亚磷酸盐( 0 5 1 4 5 、0 5 1 4 7 、0 5 1 4 8 、0 4 1 7 2 ) 和氨基膦酸酯( 0 5 2 2 3 ) 。借助农药生物活性测定、显微观察和生物化学技术，测 定了它们的抑菌谱和活性水平，并队小麦赤霉病原菌为对象，研究了对菌体生长 量、菌丝形态及菌体内可溶性蛋白、还原糖、n 乙酰葡萄糖胺含量和几丁质酶活 性的影响，为创制新型农用杀菌剂提供参考。初步研究结果如下： 四个苯并嘻唑皿磷酸盐具有较广的杀菌谱，对小麦赤霉病原菌( f g r a m i n e a r u m ) 、辣椒枯萎痫原菌( fo x y s p o r u m ) 、水稻纹枯病原菌( rc u c u m e r i s ) 、 水稻稻瘟病原菌( p o r y z a e ) 、苹果腐烂病原菌( c m a n d s h u r i c a ) 、半夏立枯病原 菌僻s o t a n o 的e c h o 在1 5 0 1 4 8 2 l g m l 1 之间。部分菌丝和分枝出现干瘪、塌 陷。苯并噻唑亚磷酸盐( 3 0 0p g m l - 1 ) 处理小麦赤霉病原菌后1 2 h 内，菌体内还 原糖含量明显降低，几丁质酶活性显著升高，可溶性蛋白和n 乙酰葡萄糖胺含 量先升后降。推测其抑菌机理可能是通过干扰菌体糖代谢使菌体细胞产生糖饥 饿现象，刺激了几丁质酶基因的表达，不断降解菌丝顶端新合成的几丁质，影响 菌丝末端细胞壁的形成，达剜抑制病原菌生长目的。 氨基瞬酸酯0 5 2 2 3 对小麦赤霉病原苗c fg r a m i n e a r m n ) 、辣椒枯萎病原苗 ( fo x y s p o r u m ) 、水稻纹枯病原苗仃e u e u m e r i s ) 、半夏立枯病原菌( 见s m a n i ) 、 水稻稻瘟病原菌( 只o r y z a e ) 、苹果腐烂病原菌( cm a n d s h u r i c a ) 、马铃薯晚疫病 原苗( pi n f e s t a n s ) 、油菜菌核病原苗假s c l e r o t i o r u m ) 、黄瓜灰霉病原菌 c i n e r e a ) 的e c 5 0 在3 1 5 j 9 9 9 i s g t m l 。之间。菌丝变得细弱、扭曲、分枝问距缩短e 菌体生长量随着药剂浓度的升高而明显降低。0 5 2 2 3 ( 3 0 0p g m l - 1 ) 浸泡小麦赤霉 病原菌后，菌体内电解质相对外渗率增大，2 4 h 内菌体内可溶性蛋白和还原糖含 量均先升后降，但降低不明显；此外，n 乙酰葡萄糖胺含量和几丁质酶活性也无 明显变化。推测其可能抑苗机理是破坏质膜选择通透性，胞内电解质和小分子内 含物大量外渗，菌体细胞内环境受到破坏。影响苗体生理功能的正常进行。 关键词：苯并噻唑砸磷酸盐：氨基膦酸酯：抑菌活性；作用机制 分类号：t q 4 5 0 1 贵卅大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 a b s t r a c t a m i n o p h o s p h o n i ed e f i v a m ss y n t h e s i z e di n t h i sr e s e a r c hc e n t e rw e r ea s s a y e d u s i n gt h em y c e l i a lg r o w t hr a t em e t h o d i tw a sf o u n dt h a tb e n z o t h i a z o l e - p h o s p h i t e s ( 0 5 1 4 5 ，0 5 1 4 7 ，0 5 1 4 8a n d0 4 1 7 2 ) s u b s t i t u t e db ya m i d oa n da m i n o p h o s p h o n a t e ( 0 5 2 2 3 ) s h o w e dc e r t a i na n t i f u n g a la c t i v i t i e si nv i t r o 1 1 1 es p e c t r u ma n de x t e n to f t h c k a n t l f o n g a la c t i v i t i e sw e r es t u d i e db ym e a n so f b i o a a s a y , m i c r o s c o p ya n db i o c h e m i s t r y a l s o ，t h em y c e l i u m , t r yw e i g h ta n dt h ec h a n g e so fh y p h a lm o r p h o l o g y , t h em y c e l h l s o l u b l ep r o t e i n , r e d u c i n gs u g a r , d g i c n a cc o n t e n ta n dc h i t i n a s ea c t i v i t i e so f f u s a r i u mg r a m i n e a r u mw e r ei n v e s t i g a t e dt os u p p l yr e f e r e n c e st od e v e l o pl l e w f u n g i c i d e s t h ep r e l i m i n a r yr e s u l t sa t ea sf o l l o w s f o u rb e n z o t h i a z o l c - p h o s p | l i t e sh a db r o a df u n g i c i d a l s p e c t r u m ，w i t h 5 0 e f f e c t i v ec o n c e n t r a t i o n s ( e c s o 、r a n g e df r o m1 5 0t o1 4 8 2p g n l l “a g a i n s tf g r a m i n e a r u m 。f o x y s p o r u m ，t c u c u m e r i s 。p o r y z a e ，c m a n d s h u r i ca n dr s o l a n l p a r to ft h eh y p h aa n dr a m i f i c a t i o nw e r eo b s e r v e ds h r i v e l i n ga n dc o l l a p s i n g a r e r t r e a t m e n tw i t hf o u rb e n z o t h i a z o l c - p h o s p h i t e sa t3 0 0p g m l 1w i t h i n1 2h ，t h em y c e l i a l r e d u c i n gs u g a r c o n t e n td e c l i n e d o b v i o u s l y a n dc h i t i n a s e a c t i v i t y i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y b u tt h es o l u b l ep r o t e i na n dd - g i c n a cc o n t e n ti n c r e a s e di nt h es h o r t t i m ea n dd e c r e a s e ds u b s e q u e n t l y i tc o u l db es p e c u l a t e dt h a tf o u rc o m p o u n d sm a y i n t e r f e r ew i t ht h em e t a b e l i s mo fc a r b o h y d r a t e ，w h i c hr e s u l t e di nt h es h o r t a g eo f g l u c i d e si n d u c i n gt h ee x p r e s s i o no fc h i t i n a s eg e n e t h ef r e s hc h i t i nc o m p o s e da tt h e e n do f h y p h aw a sh y d r o l y z e db ye h i t i n a s e , w h i c hi n f l u e n c e dt h ef o r mo f h y p h a lc e l l w a l ls o a s t o i n h i b i t t h e g r o w t h o f p l a n t p a t h o g e n i c f u n g i i tw a sd i s c o v e r e dt h a tt h ee c s 0o fa m i n o p h o s p h o n a t e0 5 2 2 3a g a i n s tf g r a m i n e a r u m f o x y s p o r u m , t c u c u m e r i s , r s o t a n i , p o r y z a e 。cm a n d s h u r i c a ，p i n f e s t a n s ，只s c l e r o t i o r u ma n db c i n e m ar a n g e df r o m3 0t o 1 0 0p g - m l a l t e r t r e a t m e n t ，h y p h ab e c a m es l i m m e d ，f r a g i l ea n dr a m i f i e dc r o o k e d l y , a n dt h es p a c e b e t w e e n h y p h a l b r a n c h e sw a s f o u n ds h o r t e n e d w i t ht h e i n c r e a s eo f a m i n o p h o s p h o n a t eu o n e e n t r a t i u n ，t h em y c e l i u md r yw e i g h td e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y 贵州大学2 0 0 6 届硬士研究生学位论文 a f t e rt h em y c e l i u mw a sd i p p e di nt h es o l u t i o no fa m i n o p h o s p h o n a t e0 5 2 2 3a t3 0 0 p ga l l 1 ，t h er e l a t i v ep e r m e a b i l i t yr a t eo fe l e e t r o l y t ei n c r e a s e d d u r i n g2 4h o u r so f t r e a t m e n t ，t h em y c e l i a ls o l u b l ep r o t e i na n dr e d u c i n gs u g a rc o n t e n ti n c r e a s e di n i t i a l l y a n ds l i g h t l yd e c r e a s e dl a t e r a l s ot h ed - g i e n a cc o n t e n ta n dc h i t i n a s ea c t i v i t y c h a n g e ds l i g h t l y i ts u p p o s e dt ob et h a tc o m p o u n d0 5 2 2 3m i g h ti n t e r f e r ew i t ht h e s e l e c t i v i t yo fc y t o p l a s m i cm e m b r a n e ，w h i c hr e s u l t e di nt h ec y t o p l a s m i ce l e c t r o l y t e a n ds m a l l m o l e c u l ei n c l u s i o n sh e a v i l y l e a k i n gf r o mm y c e l i u mc e l l s t h ei n n e r e n v i r o n m e n to fm y c e l i u mc e l l sw a sd e s t r o y e ds ot h a t t h ep h y s i o l o g i e a lf u n c t i o n h a r d l yc a r r i e do u tn o r m a l l y k e yw o r d s ：b e n z o t h i a z o l e - p h o s p h i r e ；a m i n o p h o s p h o n a t e ；a n t i f u n g a la c t i v i t y ；a c t i o n m e e h a n i s m i 丹i 大学2 q q 6 届项士研究生学位论文 刖吾 氨基磷酸衍生物是天然氨基酸的含磷类似物，对其的合成及生物括性的研究 是有机磷化学中近几十年来的重要组分。由于酶表面或活性中心的不对称性导致 酶与化合物( 底物或抑制剂) 的结合表现出立体特异性，因此化合物的立体结构 与其生物活性之间有密切关系。而氨基磷酸衍生物中舍有四面体结构的磷原子， 与酶相互作用后可带来生物活性的巨大差异。 5 0 多年以来，人们对氨基磷酸衍生物的合成方法和生物活性进行了广泛研 究。发现该类化台物具有广泛的生物活性，如氨基膦酸酯具有抗植物病毒、抗肿 瘤、植物生长调节、除草、杀菌、抑制酶、抗氧化及破坏生物细胞膜等多种生物 活性，但目前尚无商品化的农用杀菌剂出现。因此，对氨基磷酸衍生物的研究与 开发，有着广阔的发展前景。 为了系统地研究氨基磷酸衍生物的结构和生物活性的关系，寻找高效抑菌 活性的先导化合物，本中心合成了一批氨基磷酸衍牛物。本研究正是对这些衍生 物进行抑菌活性筛选，用活性测定结果指导进一步的药物设计与合成。现筛选出 离体抑菌活性较好的氨取代苯并噻唑亚磷酸盐和氨基膦酸酯类化合物。 通过查阅国内外文献，发现尚没有关于苯并噻唑亚磷酸盐抑制植物病原真菌 效果及作用机制的研究报道。关于氨基膦酸酯生物活性的报道已有很多。但未见 其在防治植物病原真菌作用机制方面的研究报道。而研究新化合物抑菌机理，是 研发与现有杀菌剂无交互抗药性以及与环境生物具有良好相容性的新型农用杀 菌剂的关键。因此，本论文借助农药牛物活性测定、显微观察技术和生物化学技 术，进行了话性化合物抑菌效果及作用机理的初步研究，内容包括：测定活性化 合物的揶菌谱、抑制中浓度和对菌体生长量的影响，观察对菌丝生长形态的影响； 初步研究活性化合物作用后菌体细胞结构( 细胞壁、质膜) 、代谢物质( 糖) 和物 质合成( 蛋白质) 等生理指标的变化。 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 一氨基膦酸酯生物活性研究进展 氨基磷酸作为天然氨基酸的含磷类似物，具有重要的生理功能。近年来，人 们发现其衍生物具有广泛的生物活性，因此寻找高活性的氨基磷酸衍生物已成为 当前新药研发的热点。本文筛选出具有较好抑菌活性的氨基膦酸酯，下面将国内 外关于氨基膦酸酯生物活性研究进展综述如下： 1 1 杀菌活性 1 9 8 9 年，杨华铮等( 杨华铮等，1 9 8 9 ) 合成了3 8 个口氨基膦( 次膦) 酸类衍生 物。2 0 0 斗g m l 。的含毒介质试验表明，这些衍生物对腐霉菌、小麦赤霉菌和水稻 纹枯菌均有一定的抑制作用。 c z e r w o n k a 等( c z e r w o n k a ，e t a l ，1 9 9 7 ) 合成了含甲酸基、苄基的芬尼菌素氨 基磷酸衍生物，发现其具有抑制假单胞杆菌、葡萄状球菌、埃希氏菌生长的活性。 但是，假单胞杆菌能够降解该化合物，从而降低它的抑制活性。 张克胜等( 张克胜等，1 9 9 9 ) 合成了具有氨基膦酸酯结构片段和吡唑杂环的 化合物，该类化合物具有不同程度的抑制植物病毒及病原真菌活性。对活体小株 烟草上花叶病毒的抑制活性在1 0 , , - 4 2 ；离体平皿法表明，该化合物在5 0p g m l l 下对小麦赤霉病原菌生长抑制率在5 0 左右。 卢水明等( 卢水明等，1 9 9 9 ) 利用2 氨基5 一烷基- l ，3 ，4 一噻二唑、芳香醛和亚 磷酸三苯酯的麴v l a n n i c h 反应合成了1 6 个l ，3 ，4 噻二唑的新型瑾一氨基膦酸酯衍生 物，对小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌、棉花立枯病菌、甜菜褐斑病菌和芦笋褐斑 病菌均有不同程度的抑制作用。对小麦赤霉病菌的抑制率在7 0 - - 9 0 之间，尤其 对水稻纹枯病菌的杀菌活性较高，5 0p g m l 抑制率在8 0 - 1 0 0 。 汪焱钢等( 汪焱钢等，1 9 9 9 ) 将5 巯基- 2 氨基噻二唑的s c h i f f 碱与亚磷酸二 乙酯加成，得到l o 个新的含噻二唑环的a 取代氨基膦酸酯类化合物，并进行了室 内生物活性试验。结果表明，部分化合物表现出较好的杀菌活性，对芦笋褐斑病 菌的抑制率接近常用杀菌剂粉锈宁。 齐传民等( 齐传民等，2 0 0 1 ) 合成了四个新手性( + ) 吨( 3 莰一2 - 基脲基) 氨基卤 苄基膦酸二烃基酯，采用含毒介质法测定了对小麦赤霉( g i b b e r e l l az e a e ) 、番茄 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 早疫( p h o m aa s p a r a g o 、棉花立枯( r h i z o c t o n i as o l a n o 、苹果轮纹( p h y s a l o s p o r a p i r i c o l a ) 、花生褐斑( c e r c o s p o r ab e t i c o l a ) 等五种病原菌的离体抑菌活性，结果 表明，该手性化合物浓度在5 0 g m l l 下对五利，病原菌无明显活性。 1 2 抑制生物酶活性 法国学者v i d a l 等( v i d a l ，e t a l ，1 9 8 5 ) 研究了二氧磷基丙胺酸抑制大鼠肝脏 磷酸丝氨酸磷酸酯酶的活性情况，发现二氧磷基丙胺酸能够抑, 佑t j d 型和l 型磷酸 丝氨酸的水解，并抑制转移酶和l 型丝氨酸和l 型磷酸丝氨酸问的反应。 d u n c a n 等( d u n c a n ，e t a l ，1 9 8 8 ) 研究了沙门氏杆菌d 型丙氨酸的氨甲基膦酸 酯和氨基膦酸酯等两种类似物与d 型丙氨酸之间的竞争作用，发现该类似物是一 种潜在的位点抑制剂，能够同d 型丙氨酸竞争，可能是链合酶的引物被抑制。 l e j c z a k 等( l c j c z a k ，e t a l ，1 9 8 9 ) 合成t 3 0 多个亮氨酸的磷酸类似物一氨基 乙烷基膦酸酯，通过抑制酶活性的研究发现，这些酯均能有效地抑制神经元细胞 酶的活性。动力学参数显示出了抑制机理的两个阶段，紧跟着第一阶段酶的缓慢 异构化之后是酶和抑制剂的迅速结合。其中，2 位被n 环己烷取代的产物是最有 效的抑制荆，它对微神经元细胞的氨基肽酶的抑制常数k 沩0 8 7m 。 张峰等( 张峰等，1 9 9 7 ) 并f l h a r p e r 等( h a r p e r , e ta 1 ，2 0 0 1 ) 进行t a - 氧代膦酸 衍生物影响酶活性的初步研究，发现取代苯氧基乙酰氧基烃基膦酸酯n e t b p 和 u c e 对水稻幼苗的抗氧化酶有很强的抑制作用。 s i e n c z y k 等( s i e n c z y k , e ta 1 ，2 0 0 4 ) 新合成了一种精氨酸的芳香族类似物( n 保护的a 氨基烷基膦酸酯) ，研究发现该氨基膦酸酯是胰蛋白酶的抑制剂。 谭宏亮等( 谭宏亮等，2 0 0 5 ) 做了不同浓度( 1 0 气1 0 - 7 9 - m l l ) 的o - 甲基一( 2 ， 4 二氯苯氧基乙酰氧基) 甲基膦酸酯单钠盐在体外处理水稻幼芽和影响从水稻 线粒体中提取的丙酮酸脱氢酶复合体的试验，发现高浓度下对水稻的呼吸、丙酮 酸脱氢酶活性抑制较强，而低浓度则对其抑制相对较弱，1 5 0 为2 9 1 4p m o l l - 1 ，结 果表明该化合物是丙酮酸脱氢酶的强抑制剂。 1 3 抗植物病毒活性 龙韫先等( 龙韫先等，1 9 9 6 ) 采用无溶剂法通过活性基团拼接合成了含吡唑 啉酮基吨氨基膦酸酯化合物( 1 ) ，生物活性测定结果表明，当化合物浓度在 1 0 1 0 7 2 0 x l f f 7 t o o l l 1 时对烟草花叶病和黄瓜花叶病表现出良好的抑制作用。 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 其中1 b 、l e 、1 哟活性均在5 0 以上，l a 、l b 、l d 贝, l j 表现出较好的除草活性。 器粥 r ：ah ；bo c h 3 ；cp - c i ；dm - n 0 2 ；e2 , 4 - c 1 2 ；f o 。c 1 ；gp - c h 3 ；hp - o hl 戴庆等( 戴庆等，1 9 9 7 ) 报道了n - 对甲苯磺酰基a 一氨基膦酸及其单酯中某些 化合物表现出较好的抗烟草花叶病( t m v ) 活性，部分化合物在5 0 肛g m l l 下对 t m v 的抑制率分别达5 0 和5 3 。 h u i y i n gl i 等( h u i y i n gl i ，e ta 1 ，1 9 9 7 ) 将氨基磷酸盐引入磷甲酸和磷乙酸 中，合成了一系列的n 烷氧羰基m 氨基膦酸酯衍生物，初步生物活性测试表明， 衍生物均有较好的抗t m v 活性，活性好于已商品化的抗植物病毒药剂d h t ( 六 氢1 ，3 ，5 - 三嗪2 ，4 - 二酮) 。 李在国等( 李在国等，1 9 9 9 ) 合成了n - ( 2 - 苯并噻唑基) - a 氨基烷基膦酸二乙 酯，室内离体半叶法活性测定表明，其具有较好的抑制烟草花叶病毒( t m v ) 活 性，浓度为1 1 5 x 1 0 4 m o l l - 1 下对烟草花叶病的防效可达4 5 。 b a o a ns o n g 等( b a o a ns o n g ，e ta 1 ，2 0 0 3 a ) 合成了2 1 个新型含氟q 氨基烷基 膦酸酯，田间试验表明，部分化合物具有抗烟草花叶病( t m v ) 活性。在1 0 0 0 倍液浓度下，施药第十四天后对烟草花叶病的防效分别达到7 0 9 和1 4 2 3 。 b a o a ns o n g 等( b a o a ns o n g ，e t a l ，2 0 0 3 b ) 合成了0 ，o - 二乙基一一( 4 三氟甲基 苯基) 氨基- 4 氟苯基甲基膦酸酯，田间试验表明具有抗t m v 活性，5p g m l l 时 抑制率能达到6 7 0 3 。 1 4 抗肿瘤活性 l a v i e l l e 等( l a v i e l l e ，e ta 1 ，1 9 9 1 ) 合成了长春碱的氨基磷酸衍生物，并进行 了离体和活体的抗肿瘤活性测试，发现所有化合物均具有离体抗肿瘤活性，活性 程度强烈地依赖于化合物的空间结构。 刘学军等( 刘学军等，2 0 0 2 ) 设计合成了一系列含抗癌活性基团的5 - 氟尿嘧 啶1 基磷三肽化合物，并进行了抗癌活性研究。部分化合物( 浓度为1o - 5 m o l l - 1 ) 具有一定的抑制癌细胞( h l 6 0 和b e l7 4 0 4 ) 作用，x , j h l 6 0 的抑制率在8 5 以 上，对b e l7 4 0 4 的抑制率在8 0 - 8 5 之间。 l i n h o n gj i n 等( l i n h o n gj i n ，e ta 1 ，2 0 0 6 ) 采用m t l 祛对合成的一系列o ，0 二 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 烷基吨一( 含取代基苯并噻唑2 ) 氨基氟取代苯基甲基膦酸酯) 进行了抗p c 3 、 a 4 31 、a 3 7 5 秉q b c a p 3 7 等癌细胞的离体抑制活性研究，发现部分化合物对p c 3 癌 细胞有较高的抑制活性，对a 4 3 l 癌细胞抑制活性中等。 1 5 植物生长调节活性 k a f a r s k i 等( k a f a r s k i ，e ta 1 ，1 9 8 9 ) 研究了芳香族氨基酸( 苯丙氨酸、酪氨酸 和二羟基苯丙氨酸) 含磷类似物的植物生长调节活性，结果发现这些类似物均不 同程度地促进了黄瓜根部的生长，对胚轴的影响很小，而缩氨酸的含磷类似物未 显示植物生长调节活性。 新型氨基膦酸酯引起黄瓜子叶电解质渗漏，同时影响叶绿素含量和愈创木 酚、焦倍酚过氧化物酶的活性，活性随着氨基膦酸酯的结构和使用浓度的变化而 发生变化。当长链烷基取代氮原子或p r 离子取代磷原子时，氨基膦酸酯的这种活 性增强( b i c l e c k i ，e t a l ，2 0 0 1 ) 。 刘绪峰( 刘绪峰，2 0 0 5 ) 合成t c t ( 4 氯1 萘氧基乙酰氧基) 烃基膦酸酯系列 化合物，大多数化合物显示出较好的生长素类激素作用，质量浓度为0 1g l 1 时， 其中一个化合物对小麦胚芽鞘的抑制率为- 2 0 3 ，促进率为2 5 8 。 石德清等( 石德清等，2 0 0 2 ) 采用活性子拼接原理，将具有广泛生物活性的旺 氨基膦酸酯引入脱落酸类似物中，设计合成了弘氨基膦酸的脱落酸酰胺类似物， 并进行t l o m g l 。浓度t x , j , b 麦芽- 鞘伸长影响( 以空白样品作参照) 的试验，发 现这些类似物均具有一定的抑制植物生长活性。此外，部分类似物在l om g 。l 。 浓度下对黄瓜子叶生根抑制率为1 0 0 。 1 6 除草活性 t a n a k a 等( t a n a k a ，e t a ，1 9 8 6 ) 合成了一系列a 一和脚氨基酸( 天冬氨酸、谷氨 酸、氨基乙酸、苯基甘氨酸) 的膦酸酯衍生物，这些类似物显示出较好的防除农 田杂草活性。但是氨基乙酸、苯基甘氨酸类似物在田间除草中，对水稻和杂草没 有选择性，对水稻药害较严重。 陈茹玉等( 陈茹玉等，1 9 9 2 ) 设计并合成了含双磷的二肽( 2 ) 和含单磷的二 肽( 3 ) 。采用盆栽法对除草活性进行了测定，结果表明，二肽( 2 ) 和( 3 ) 的除草 活性低或无除草活性，但二肽( 2 ) 对亚麻的幼芽有一定的抑制作用，抑制率为 4 0 0 ，二肽0 ) 对油菜幼芽抑制作用更强，抑制率为4 6 0 。苗后茎叶处理活 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 性较高，二肽( 3 ) 除草活性比二肽( 2 ) 高。肽键连接的i 型氨基酸活性比d 型的 高，对禾本科植物的除草活性高于对阔叶植物，并且对双子叶油菜安全，显示出 一定的选择性除草活性。例如，二肽( 3 ) 对高粱的抑制率为8 9 6 ，而对油菜仅 为2 5 7 。 n or o 皿赫啦n 击出慨b 肚蛐，e t ；贮h ，p h ，_ 兰卜c ，卜。c h ： ( 。幻) 2 3 c h j n h c h ：4 l n h d l c o or r ：m 岛e tr ：h ，m 。，c h ：r n 3 无环的氨基甲基磷酸衍生物具有植物毒性，毒性取决于它的疏水性参数和 n 、p 原子取代物的电性参数( w i e c z o r e k ，e t a l ，2 0 0 0 ) 。 石德清等( 石德清等，2 0 0 2 ) 通过芳氧丙酸与n 氨基膦酸二苯酯的缩合反应 合成了8 个氨基膦酸酯，初步的生物活性测定结果表明，目标化合物具有较好的 除草活性。当取代基为苯环时，在浓度为l om g l 1 下对单、双子叶植物的抑制率 接近于2 ，4 d 。 微摩尔浓度的氨基芴膦酸酯抑制小麦的生长，活性相当于草甘膦，而氨基烷 基膦酸酯的抑制效果不明显。当氨基烷基膦酸酯或氨基芴膦酸酯单独与草甘膦混 合时，只有少数混合出现协同作用，其它大多数均出现拮抗作用( b i e l e c k i ，e t a l ， 2 0 0 4 ) 1 抗氧化活性 梅星元等( 梅星元等，1 9 9 8 ) 曾报道，o ，o - - 7 3n - ( 4 - 氯苯氧乙酰氧基) 苄基 膦酸酯高浓度时对一系列抗氧化酶：超氧物歧化酶( s o d ) 、过氧化物酶( p o d ) 活性有较强的抑制作用，同工酶谱带也相应减弱；低浓度时则对p o d 、s o d 活 性有一定的激活作用，同工酶谱带相应增强。不同浓度处理水稻幼苗细胞时相 对存活率为高浓度有很强的抑制作用，低浓度有一定的激活作用 k l e s z c y n s k a 等( k l e s z c y n s k a ，e t a l ，2 0 0 0 报道，氨基膦酸酯能够在某种程度 上防止红细胞质膜的过氧化活性。 1 8 破坏生物细胞膜 新型无环的氨基瞵酸酯比环状的氨基膦酸酯的溶血毒性大，作用位点可能是 红血球细胞膜的脂质层，并具有轻微的抗膜质过氧化活性，可成为很有潜力的杀 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 虫剂( k l e s z c z y n s k a , e la ，2 0 0 0 ) 。 t r e l a 等( t r e l a , e t a l ，2 0 0 1 ) 研究发现，1 0 - - 1 0 0p m 的氨基膦酸酯能引起藻类 质膜去极化、电导率增加，也影响红血球细胞膜的流动性。高浓度的氨基膦酸酯 引起红细胞的溶血现象，可能由于该酯影响质膜的脂质层或促使质膜结构发生改 变。 k l e s z e z y n s k a 等( k l e s z c z y n s k a ，e t a l ，2 0 0 1 ) 研究发现，氨基膦酸酯具有溶血 毒性，这种毒性取决于氨基膦酸酯的空问构型和疏水性，可能是该酯作用于红血 球细胞膜的脂质层，引起质膜流动性增加。 s a r a p u k 等( s a r a p u k , e ta 1 ，2 0 0 2 ) 研究发现，某些氨基膦酸酯诱导了黄瓜子 叶细胞质膜静息电位的去极化，影响藻类质膜的电导特性和叶片中叶绿素的含 量，同时引起黄瓜子叶电解质的渗漏。这种现象可能是由于氨基膦酸酯破坏了黄 瓜子叶细胞的脂质层以及相应的结构变化引起的。 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 = 研究路线设计 2 1 研究目的和意义 氨基磷酸衍生物因其广泛的生物活性，成为当前新药研发的热点。本论文针 对本研究开发中心合成的新型氨基磷酸衍生物进行抑菌活性初筛，及时为化学合 成反馈信息，旨在寻找高效抑菌活性的先导化合物。而搞清化合物对病原真菌的 作用机制，是研发与现有杀菌剂无交互抗药性以及与环境生物具有良好相容性的 新型杀菌剂的关键。因此，本研究结合当前农用杀菌剂作用机制的研究方法，从 药剂作用后菌体细胞生理生化指标的变化入手，初步研究了活性化合物抑菌机 制，为氨基磷酸衍生物进一步的结构优化以及深入探索其作用机理提供参考。 2 2 拟解决的问题 进行新型氨基磷酸衍生物的初筛，寻找具有高效抑菌活性的化合物，并对所 得数据进行科学的分析和讨论：研究活性化合物n - q n n 的抑菌机制，为研究开发新 型农用杀菌剂提供参考。 2 3 研究内容 1 、选取三种植物病原真菌小麦赤霉病原菌( f u s a r h mg r a m i n e a r u m ) 、辣椒 枯萎病原菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) 和马铃薯晚疫病原菌( p h y t o p h t h o r a i n f e s t a n s ) ，做为新化合物离体抑菌活性初筛的供试菌种。 2 、选取植物病原真菌三大亚门( 半知菌亚门、子囊菌亚门、鞭毛菌亚门) 中 8 个属的9 种真菌，做为测定活性化合物抑菌谱和活性水平的供试菌种，包括： 小麦赤霉病原菌( f u s a r i u mg r a m i n e a r u m ) 、辣椒枯萎病原菌( f u s a r i u m o x y s p o r u m ) 、水稻纹枯病原菌( t h a n a t e p h o r u sc u c u m e r i s ) 、半夏立枯病原菌 ( r h i z o c t o n i as o l a n o 、水稻稻瘟病原菌( p y r i c u l a r i ao r y z a e ) 、苹果腐烂病原菌 ( c y t o s p o r am a n d s h u r i c a ) 、马铃薯晚疫病原菌( p h y t o p h t h o r ai n f e s t a n s ) 、油菜菌核 病原菌( s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ) 和黄瓜灰霉病原菌( b o t r y t i sc i n e r e a ) ，求出活性 化合物对病原菌的抑制中浓度，与商品药剂比较，评价其抑菌效果。 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 3 、运用显微观察技术，在扫描电镜和光学显微镜下观察活性化合物作用病 原菌后菌丝生长形态的变化，研究对病原菌生长发育的影响。 4 、借助农药生物测定技术，测定不同浓度活性化合物抑制菌体干重的效果， 评价其对菌体生长量的影响。 5 、采用细胞生物化学技术，研究活性化合物对病原菌的可能作用位点，即 将化合物作用于小麦赤霉病原菌g r a m i n e a r u m ) 菌体后，研究对菌体细胞结 构、物质合成和代谢等方面的影响，探讨其抑制植物病原菌的作用机制。 2 4 技术路线 图2 - 1 技术路线 f i g 2 - 1t h et e c h n i c a lr o u t e 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 三实验部分 3 1 实验材料 3 1 1 供试病原菌 小麦赤霉病原菌( f u s a r i u mg r a m i n e a r u m ) ，辣椒枯萎病原菌( f u s a r i u m o x y s p o r u m ) ，水稻纹枯病原菌( t h a n a t e p h o r u sc u c u m e r i s ) ，半夏立枯病原菌 ( r h i z o c t o n i as o l a n o ，水稻稻瘟病原菌( p y r i c u l a r i ao r y z a e ) ，苹果腐烂病原菌 ( c y t o s p o r am a n d s h u r i c a ) ，马铃薯晚疫病原菌( p h y t o p h t h o r ai n f e s t a n s ) ，油菜菌核 病原菌( s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ) ，黄瓜灰霉病原菌( b o t r y t i sc i n e m a ) ，均由南开 大学元素有机化学研究所馈赠，本室保存。 3 1 2 供试化合物 本论文所测定的新化合物均由本中心合成。 3 1 3 商品药荆 腈菌唑( 2 5 乳油) 江苏省宜兴市生物化工厂 眯酰胺( 2 5 乳油) 江苏辉丰农化股份有限公司 甲基硫菌灵( 7 0 可湿性粉剂) 日本曹达株式会社 多菌灵( 5 0 可湿性粉剂) 江苏苏化集团新沂农化有限公司 广枯灵( 3 恶甲水剂) 贵州贵大科技产业有限公司 恶霉灵( 9 4 可湿性粉剂) 贵州贵大科技产业有限责任公司 3 1 4 仪器 生物洁净安全柜江苏苏净集团安泰公司 超高速冷冻离心机2 k 1 5 型德国s i g m a 公司 全自动新型生化培养箱z s d 1 2 7 0 型上海智城分析仪器制造有限公司 调温调湿培养箱3 0 2 a 型上海实验仪器厂有限公司 紫外分光光度计u v 2 1 0 0 型尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 超级水浴恒温振荡器h z s - h 型哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 倒置光学显微镜日本o l y m p u s 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 扫描电子显微镜k y k y - 1 0 0 0 b 北京科仪中心 x 射线能谱仪s y s t e ms i x 美国t r a c o rn o r t h e r n - 4 0 c 超低温冰箱日本s a n y o 高压蒸汽灭菌器中国宁波开普电子仪表发展公司 台式电导仪d d s 1 l a 型上海伟业仪器厂 电热恒温水浴锅d k s 1l 型上海伊欧斯实业有限公司中新电器厂 精密p h 计p h s - 3 c 型上海精密科学仪器有限公司 磁力搅拌器j b z 1 2 型上海大普仪器有限公司 超声波清洗仪k q 5 2 0 型河南巩义予华仪器公司 二次蒸馏水发生器上海亚荣生物仪器有限公司 旋涡混合器q l 9 0 1 型江苏海门市麒麟医用仪器厂 万分之一电子天平s a r t o r i u sb a s i c 德国 t r i p e t t e ：2 - 2 0p l 2 0 - 一2 0 0t t l 1 0 0 - 2 0 0i t ls o c o r e x ( a c u r a 8 2 5 1 瑞士 1 0 0 0 - 5 0 0 0 “le 0 9 0 0 2 9 8 2 日本 移液枪头( 1m l 、2 0 0h 1 ) f i s h e r b r a n d 离心管( o 5 m l 、1 5 m l 、1 5 m l ) i m e c 3 1 s 试剂 考马斯亮蓝( 3 - 2 5 0b i o r a d 公司 对- n ，n - _ - - 甲基氨基苯甲醛( m 履a b ) 天津市科密欧化学试剂开发中心 3 ，5 - 二硝基水杨酸0 3 n s ) 中国医药上海化学试剂公司 几丁质生化纯北京拜尔迪生物公司 三羟甲基氨基甲烷( i r i s ) 北京鼎国生物技术有限公司 小牛血清白蛋白a s ) 北京鼎国生物技术有限公司 n 乙酰氨基葡萄糖( d g i e n a c ) 纯度为9 9 9 s i g m a 公司 四硼酸钠分析纯重庆北碚精细化工厂 冰醋酸分析纯重庆迎龙化工有限公司 酒石酸钾钠分析纯天津化学试剂三厂 结晶酚分析纯重庆北碚精细化工厂 磷酸氢二钾分析纯上海化学试剂总厂 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 硫酸亚铁分析纯重庆吉元化学有限公司 无水亚硫酸钠分析纯重庆无机化学试剂厂 磷酸分析纯遵义师范学院化学试剂厂 蔗糖分析纯广东汕头西陇化工厂 石英砂分析纯天津市科密欧化学试剂开发中心 二甲亚砜分析纯成都科龙化学试剂厂 丙酮分析纯遵义高等师专化学试剂厂 乙醇分析纯成都金山化学试剂厂 二甲基甲酰胺分析纯成都科龙化学试剂厂 吐温2 0 分析纯天津市化学试剂三厂 3 2 试验方法 3 2 1 化合物溶液的配制 按所需剂量称取化合物，加入少量溶剂使其充分溶解，用含1 t w e e n 2 0 的 二次蒸馏水，配成相应浓度的化合物溶液。 对照药剂配成各浓度的水溶液或悬浊液( 按有效含量计算) 。 3 2 2 新化合物的初筛试验 采用离体生长速率法( 黄国洋，2 0 0 0 ) 。 将1 0m l 药液( 1 0 倍终浓度的药液) 倒入溶融状态的9 0m l 马铃薯葡萄糖 琼脂培养基( p d a ) ( 马铃薯2 0 0 9 、琼脂2 0 9 、葡萄糖2 0 9 、蒸馏水1 0 0 0 m l ) 中， 培养基温度保持在5 0 6 0 。c 之问，充分摇匀，倒入直径9c m 的培养皿内，冷却凝 固。用打孔器沿已经培养4d 的病原菌菌落边缘打取直径0 4c m 的菌饼，将菌饼 倒置于含药剂的p d a 平板中央。培养至对照菌落生长接近平皿三分之二处开始 观测，十字交叉法测量菌落直径( c m ) ，取平均值。对照不加药剂，但含有同样 浓度的溶剂和t w e c n 2 0 。每处理重复三次。通过以下公式计算药剂对菌丝生长的 抑制率c ，为抑制率，c 为空白直径，r 为处理直径) ? i ( 呦= 【( c - d ，( c - o 4 ) 1 0 0 3 2 3 化合物抑菌谱及抑制中浓度的测定 按二倍稀释法稀释化合物溶液( 需要配制至少五个浓度梯度的药液) ，将不 同浓度的药液分别倒入溶融状态的p d a 中。待平板冷却后，在平皿中央接种病 贵州大学2 0 0 6 届硕士研究生学位论文 原菌，每处理重复三次。十字交叉法测量菌落直径，求出各菌、各浓度的抑制率。 将抑制率转换成机率值0 0 ，浓度转换成对数值0 0 ，通过s p s s 软件，进行回归 分析得到各化合物的毒力回归方程，求出抑制中浓度值( e c s 0 ) 。 3 2 4 化合物对菌体生长量影响试验 参照农药生物测