（儿科学专业论文）糖皮质激素抑制骨骼纵向生长机制的研究.pdf

复口- 火学博士研究生学位论文 a b p a s a l ( p 心 b n p c n p g c g h g h i g f ia x i s g h i s g h r g l u t 4 g r i g f i i g f - i i i g f b p 3 i g f i r i h h 1 0 d l i i g f r - m m p s m d n s i l a o c p i c p t g f - b 1 v e g f v g 缩略词表 1 a l c i a nb l u e p e o d i ca c i d - s c h i f ! f 阿尔辛蓝一过碘酸雪夫 a l k a l i n ep h o s p h a t a s e 碱性磷酸酶 a c i dl a b i l es u b u n i t 酸敏感亚单位 b t y p en a t r i u r e t i c b 型钠尿肽 c - t y p en a t r i u r e t i cc 型钠尿肽 百u c o c o r t i c o i d糖皮质激素 伊o w t hh o 咖o n e生长激素 伊o w t hh o 珊o n e - i n s u l i n - l i k e 伊o w t hf a c t o r - ia x i s g h 1 g f i 轴 g hi n s e n s i t i v i t ys y n d r o m e 生长激素不敏感综合征 g m w t hh o r i t l o n er e c e p t o r生长激素受体 i n s u l i n s e n s i t i v e 舀u c o s et r a n s p o r t e r 胰岛素敏感性葡萄糖载体 舀u c o c o n i c o i dr e c e p t o r 糖皮质激素受体 i n s u l i n - l j k eg r o w t hf a c t o r i 胰岛素样生长因子i i n s u l i n 1 i k eg r o w t hf a c t o r u 胰岛素样生长因子i i i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o rb i n d i n g p r o t e i n 一3 胰岛素样生长因子结合蛋白3 g r o w t hh o m o n e - i n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o 卜ir e c e p t o r i g f i 受体 i n d i ah e d g e h o g 印第安刺猬蛋白 i n t e g r a t e do p t i c a ld e n s i t y 累计光密度 l i v e r - s p e c i f i ci n a c t i v a t i o no ft h ei g f - ig e n e 肝特异性i g f i 基因敲除 m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s 基质金属蛋白酶 m e a nd e n s i t y 平均光密度 n o n s u p p r e s s i b l e j n s u l i n l i k ea c t i v i t y 不可抑制性胰岛素样活性 o s t e o c a l c i n 骨钙蛋白 c a r b o x y t e n l l i n a lp r o p e p t i d eo ft y p eip r o c o l l a g e n i 型前胶原羧基端前肽 t m n s f o 加i n gg r o w t hf a c t o 卜b 1 转化生长因子b 1 v a s c u l a re n d o t h e l i a l 伊o w t hf a c t o r 血管内皮生长因子 v a ng i e s o n v g 染色法 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名： 论文使用授权声明 日期：塑2 9 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：导师签名：日期：垦! z ：! 主 复口| 人学博上研究生学位论文 中文摘要 目的通过对生长板的研究，探讨糖皮质激素抑制骨骼纵向生长的机制，为 临床防治糖皮质激素所致生长迟缓提供理论支持。 方法3 周龄清洁级雄性s d 大鼠2 0 只。随机分为地塞米松组1 2 只，对照 组8 只。地塞米松组大鼠每天腹腔注射地塞米松2 0 0 斗g 1 0 0 9 体重，对照组大鼠 注射等容积生理盐水，连用1 0 天。每同称量体重。宰杀同采集静脉血，测量鼻 尾长，胫骨长。制备胫骨生长板组织切片。1 、以胫骨长反映骨骼纵向生长情况， 通过m a s s o n 三色法、m a l l o n ，三色法等组织学特殊染色方法，显示生长板软骨细 胞形态，直接测量生长板厚度、增殖带和肥大带厚度。2 、采用免疫组化技术观 察糖皮质激素受体、信号分子t g f b 1 和l h h 在生长板的表达情况。3 、通过e l i s a 法测定血清浓度，探讨地塞米松处理对g h i g f i 轴组分、骨形成标志物骨钙蛋 白、碱性磷酸酶、l 型胶原羧基端前肽和骨生长参数c 型钠尿肽的影响。s s p s s l 4 o 统计软件处理数据。结果用x s 表示。进行独立样本t 检验，p 0 0 5 为有显著 性差异。 结果第3 天起，地塞米松组大鼠每日体重净增长明显低于对照组大鼠；第 6 天起，地塞米松组大鼠体重显著落后于对照组大鼠；1 0 天后，地塞米松组大鼠 体重、鼻尾长、胫骨长、生长板总厚度、增殖带厚度、肥大带厚度都显著落后于 对照组大鼠。地塞米松组大鼠血清i g f i 水平显著低于对照组大鼠，而生长激素 水平显著高于对照组大鼠。两组之问在l g f b p 3 、骨钙蛋白、碱性磷酸酶、i 型 胶原羧基端前肽和c 型钠尿肽血清水平没有明显差异。 生长发育阶段大鼠胫骨生长板静止带软骨细胞和肥大带软骨细胞表达糖皮 质激素受体，而增殖带软骨细胞不表达糖皮质激素受体。地塞米松处理使生长板 静止带和肥大带软骨细胞糖皮质激素受体表达增强。大鼠生长板肥大带软骨细胞 表达t g f b 1 ，地塞米松处理可使其表达增加。大鼠生长板增殖带与肥大带交界 区域( 成熟带) 软骨细胞表达i h h ，地塞米松处理后1 1 1 h 表达减少。 结论1 、糖皮质激素可通过对生长板直接作用而影响骨骼纵向生长。2 、药 理剂量糖皮质激素可能通过上调其受体在生长板的表达，发挥抑制骨骼纵向生长 的作用。3 、药理剂量糖皮质激素使生长板肥大带软骨细胞t g f b 1 表达增强， 参与对骨骼纵向生长的抑制。4 、药理剂量糖皮质激素可能通过降低成熟带软骨 细胞信号分子i h h 的表达抑制骨骼纵向生长。5 、糖皮质激素所致生长迟缓的细 胞学病理基础为抑制静止带干样细胞活化为增殖软骨细胞，并且抑制肥大软骨细 胞分化。 关键词糖皮质激素所致生长迟缓；骨骼纵向生长；骨合成：生长板；软骨 复口大学博j ：研究生学位论文 细胞；糖皮质激素受体；t g f b 1 ；i h h ；胰岛素样生长因子i ；c 型钠尿肽 中文分类号r 7 2 5 8r 3 3 2 3 复口大学博j ：研究生学位论文4 。i 。_ 。- _ 。_ _ 。_ 。- 。- - - - 。_ _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ 。_ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ - _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ _ - _ - _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 一 一 a b s t r a c t o b j e c t i v e s r be x p l o r et h em e c h a n i s mt h a t羽u c o c o r t i c o i di n h i b i t st h e l o n 舀t u d i n a lg r o w t ho fb o n ei n r a t s 1 o p r o v i d et h e o 巧s u p p o nf o rt h ec l i n i c a l p r e v e n t i o nf r o mt h eg l u c o c o r t i c o i d - i n d u c e dg r o w t hr e t a r d a t i o n m e t h o d s 7 i w e n t y3 - w e e k - o l dm a l ew e a n l i n gs dr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e d i n t ot w og r o u p s ：t h ed e x a m e t h a s o n eg r o u p ( n = 1 2 ) a n dt h ec o n t r o lg r o u p ( n = 8 ) t 1 l e r a t si nt h ed e x a m e t h a s o n e 伊o u pr e c e i v e dd e x a m e t h a s o n e ( 2 0 0 g 1 0 0 9b o d yw e i g h t ) f o r1 0d a y s t h er a t si nt h ec o n t r o lg r o u pr e c e i v e dm a t c h i n gv o l u m es o d i u mc h l o r i d e s o l u t j o n a l lr a t sw e r ew e i g h e de v e r y d a y ，a n dt h el e n 醇ho ft i b i a ea n dt h el e n 舀ho ft h e t i po ft h en o s et ot h ee n do ft h et a i lw e r em e a s u r e da tt h ea b a t a g i n gd a y t l l ep r o x i m a l t i b i a ew e r ee x c i s e d ，f i x e da n dd e c a l c i f i e d a f t e rp a r a f f i ne m b e d d e d ，s e c t i o n si n5 m t h i c kw e r el ：u t 7 n l es t a t u so fl o n g j t u d i n a lb o n e 铲o w t hw a se v a l u a t e db yt h el e n g t ho f t h et i b i a e t h eg r o w t hp l a t es e c t i o n sw e r es t a i n e db ys e v e r a lh i s t o c h e m i s t r ym e t h o d s ， i n c l u d i n gh e ，m a s s o n st r i c h r o m e ( 1 i g h t 伊e e nc o u n t e r s t a i n ) ，m a l l o r y st r i c h r o m e ， a b - p a ss t a i na n dv a ng i e s o ns t a i n b yu s e0 ft h ei m a g ea n a l y s i ss y s t e mo fi 上i c a q w i n ，t h eh i s t o m o 印h o m e t i n c l u d i n gt o t a lh e i 曲to fg r o w t hp l a t e ，h e j 曲to f p r o l i f e r a t i v ez o n ea n dh e i 曲to fh y p e n r o p h i cz o n ew e r em e a s u r e d t h ee x p r e s s i o n s a n dd i s t r i b u t i o n so f9 1 u c o c o n i c o i dr e c e p t o r ，t g f b1a n di h hi n g r o w t hp l a t ew e r e d e t e c t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 7 1 1 l es e r u ml e v e l so fe l e m e n t so fg h - i g f ia x i s ， o s t e o c a l c i n ，p i c p ，a k pa n dc n pw e r ea s s a y e db ye u s a r e s u l t sf r o mt h et h i r dd a yo fd e x a m e t h a s o n et r e a t m e n t ，t h ed a i l yn e ti n c r e a s e o fw e i g h ti nt h ed e x a m e t h a s o n e 伊o u pw a s s i g n i f i c a n t l ys l o w e rt h a nt h a ti nt h ec o n t r o l 伊o u p a f t e r6d a y s ，t h eb o d yw e i g h to fr a t si nt h ed e x a m e t h a s o n eg r o u ps i g n i f i c a n t l y l o w e rt h a nt h a ti nt h ec o n t r o lg r o u p t h el e n 舀ho fn o s et ot h ee n do ft h et a i l ，t h e l e n g t ho ft i b i a e ，t h et o t a lt h i c k n e s so f 粤o w t hp l a t e ，t h ee x t e n to ft h ep r o l i f e r a t i o nz o n e a n dt h eh y p e n r o p h yz o n ei nt h ed e x a m e t h a s o n eg r o u pw e r el e s st h a nt h a ti nt h e c o n t r o l 伊o u p t h es e r u mg hl e v e i sw e r eh i 曲e ri nt h ed e x a m e t h a s o n e 鲈o u pt h a n t h a ti nt h ec o n t r o ig r o u p ，w h e r e a si g f - il e v e l sw a sl o w e ri nt h ed e x a m e t h a s o n eg r o u p t h a nt h a ti nt h ec o n t r o lg r o u p t h e r ew e r en os i g n i f i c a n t l yd i f ! f - e r e n tb e t w e e nt w o 伊o u p si nt h es e r u mc o n c e n t r a t i o n so fo s t e o c a l c i n ，a k ep i c pa n dc n p t h e舀u c o c o n i c o i d r e c e p t o rp o s i t i v ee x p r e s s i o n sw e r e f b u n di n r e s t i n g c h o n d r o c y t e sa n dh y p e n r o p h i cc h o n d i d c y t e so ft h eg r o w t hp l a t e s ，b u tn o tp r e s e n ti n t h ep r o l i f e r a t i n gc h o n d r o c y t e so ft h eg r o w t hp l a t e s a r e rd e x a m e t h a s o n et r e a t m e n t 复口大学博，h 卅究生学位论文5 - _ _ - - _ _ _ _ _ - _ - _ i - i - - - - _ _ - i - _ - - - - - - _ _ _ - _ - - _ _ _ _ - - _ l - _ - - _ - _ - _ _ _ 一 一 t h ee x p r e s s i o n so fg l u c o c o r t i c o i dr e c e p t o ri ng r o w t hp l a t ew e r e u p - r e g u l a t e d t g f b1 w a sm a i n l ye x p r e s s e di nt h eh y p e n r o p h i cc h o n d r o c y t e so ft h eg r o w t hp l a t e ，a n dt h e l e v e l sw e r em a r k e d l yi n c r e a s e db yd e x a m e t h a s o n et r e a t m e n t 1 h hp o s i t i v ec e l l sw e r e d i s l r i b u t e di nt h ec o m m o nb o u n d a r y r e 百o n o ft h e p r o l i f e r a t i o nz o n ea n dt h e h y p e n r o p h yz o n eo ft h eg r o w t hp l a t e s ，a n dt h ee x p r e s s i o no fi h hw a sd e c r e a s e db y d e x a m e t h a s o n et r e a t m e n t c o n c i u s i o n s1 t h ei n h i b i t i o no f 百u c o c o n i c o i do nt h el o n 百t u d i n a l 伊o w t ho f b o n ew a sl j k e l yb yt h ed i r e c t l ya c t i o n s0 nt h eg r o w t hp l a t e 2 7 1 1 1 eg l u c o c o n i c o i do f p h a m a c o l o g i c a ld o s a g e si n h i b i t st h e1 0 n g j t u d i n a lg r o w t ho fb o n eb yu p - r e g u j a t j n gt h e e x p r e s s j o no f 出u c o c o n i c o i dr e c e p t o ri nt h eg r o w t hp l a t e 3 g l u c o c o n i c o i di n c r e a s e d t h ee x p r e s s i o n0 ft g f - b1 i n h y p e r t r o p h i cc h o n d r o c y t e so ft h eg r o w t hp l a t e ，a n d t h e r e b y a f f e c t e dt h e l o n g i t u d i n a l伊o w t h o fb o n e 4 t 1 l e百u c o c o n i c o i do f p h a n l l a c o l o g i c a ld o s a g e sd e c r e a s e dt h ee x p r e s s i o no fi h hs i g n a li nm a t u r a t i o nz o n et o s u p p r e s st h el o n 酉t u d j n a lg r o w t ho fb o n e 5 t 1 l ep a t h 0 1 0 9 yo fg j u c o c o f t i c o i d i n d u c e d g r o w t hr e t a r d a t i o ni nc y t o l o g yl i k e l yt ob et h ea c t i v a t i o no fs t e ml i k e c e l l i nt h e r e s t i n gz o n et ot h ep r o l i f e r a t i n gc h o n d r o c y t e si si n h i b i t e da n dt h ed i 仟e r e n t i a t i o n0 f h y p e r t r o p h i cc h o n d r o c y t e si ss u p p r e s s e d k e yw o r d s舀u c o c o n i c o i d i n d u c e dg r o w t hr e t a r d a t i o n ；l o n g i t u d i n a lg r o w t ho f s k e l e t o n ；b o n ef b n n a t i o n ；g r o w t hp l a t e ；c h o n d r o c y t e ；g l u c o c o n i c o i dr e c e p t o r ；t g f b 1 ； i h h ；i g f i ；c - t y p en a t r i u r e t i cp e p t i d e c i 。cr 3 3 2r 7 2 5 8 复口人学博。l ：研究生学位论文 6 一 前言 糖皮质激素广泛用于儿科肾病综合征、青少年类风湿性关节炎、哮喘、血小 板减少性紫癜等疾病治疗。据估计，大约5 一1 0 小儿接受过糖皮质激素疗法【1 1 。 b l o d g e t 最早观察到大剂量糖皮质激素( 强的松，1 5 m 眺d a y ) 损害儿章生长现 象l2 1 。a v j o l i 甚至认为即使剂量更小( 强的松，o 1 6 m 眺鲥a y ) 也会影响儿童骨 骼健康【3 j 。糖皮质激素对机体副作用呈现多系统、全身性特点，而生长迟缓则是 糖皮质激素对儿童独特的副作用，称之为“糖皮质激素所致生长迟缓 ( g l u c o c o n i c o i d i n d u c e dg r o w t hr e t a r d a t i o n ) ”。临床资料和动物试验都表明糖皮 质激素导致生长迟缓1 4 。1 1 1 。以糖皮质激素控制原发疾病固然重要，但若忽视糖皮 质激素造成的生长损害，亦同样会对儿童的身心发育带来不良后果。因此，深入 研究糖皮质激素导致生长迟缓的机制，探索防治措施，是摆在当代儿童保健工作 者面前的新课题。 迄今为止，关于糖皮质激素所致生长迟缓的机制主要从糖皮质激素对机体普 遍作用上予以阐述。糖皮质激素几乎对各生理系统都有作用，能以多途径影响骨 骼纵向生长1 1 2 j ，诸如抑制机体合成代谢、促进分解代谢【1 3 j ；抑制胃肠道、肾小 管钙吸收，引起钙磷代谢异制1 4 l ；干扰维生素d 代谢【1 5 】；继发性甲状旁腺功能 亢进1 1 6 】；促进骨吸收、抑制骨形成、减少骨基质1 1 7 l 等。这些都是从糖皮质激素 在整体水平发挥对骨骼纵向生长的抑制作用。毋庸置疑，糖皮质激素所致生长迟 缓与上述诸多因素关系密切。 生长迟缓的实质为骨骼纵向生长过程的抑制。目前已知骨骼纵向生长发生于 长骨的生长板。生长板是骨骼纵向生长的结构基础。骨骼纵向生长是生长板内不 断进行软骨内成骨的结果i l 剐。生长板介导的骨骼纵向生长过程接受一系列信号 分子调控，涉及内分泌系统、自分泌旁分泌系统的众多全身性激素、局部信号 分子，它们在生长板各带软骨细胞之间进行信号传递。各种生长因子作用于生长 板软骨细胞基因，。使基因呈现不同的时空表达特点，从而调控生长板的程序性细 胞生长、程序性细胞分化、程序性细胞死亡i l 引。软骨细胞活化、增殖、肥大、凋 亡、血管侵入等一系列事件决定着骨骼纵向生长潜能1 2 0 。2 5 1 。 因此，可以认为，凡是导致生长迟缓的因素，最终都要影响到生长板的功能 状况。糖皮质激素所致生长迟缓也理应如是。那么糖皮质激素所致生长迟缓与生 长板的关系值得重视。已经证实大鼠、兔、人等种属的生长板软骨细胞存在糖皮 质激素受体【2 睨8 1 。这说明生长板是糖皮质激素作用的靶器官之一。糖皮质激素抑 制骨骼纵向生长机制正如骨骼纵向生长调控一样复杂。目前以生长板为对象，探 讨糖皮质激素抑制骨骼纵向生长机制的研究主要集中在以下四个方面：1 、影响 g h i g f i 轴( g r o w t hh o 珊o n e 1 1 1 s u l j n l i k eg r o w t hf a c t o r - la x i s ) 1 2 9 】；2 、抑制 复臣人学博l ：研究生学位论文 7 一 软骨细胞增殖【3 0 】；3 、促进生长板软骨细胞凋亡【3 1 】：4 、阻碍软骨内成骨的血管 发生过程【3 2 1 。 糖皮质激素发挥对生长板的作用必然是依赖生长板糖皮质激素受体；骨骼纵 向生长受到糖皮质激素抑制必然是糖皮质激素通过其受体影响骨骼纵向生长调 控的各种信号分子的结果。为此，在本研究中，我们选择两种信号分子转化生 长因子b 1 ( t r a n s f o 肿i n gg r o w t hf a c t o r - b 1 ，t g f b 1 ) 和印第安刺猬蛋白( i n d i a h e d g e h o g ，i h h ) 作为糖皮质激素受体后效应的候选信号分子。t g f b 1 是骨组织 含量最丰富的生长因子之一，目前认为t g f b 1 作为信号分子调节骨骼纵向生长 1 3 引。我国学者贺林证实，人类常染色体显性遗传性疾病a - 1 型短指( 趾) 畸形 与印第安刺猬蛋白i h h 基因异常有关【3 4 j 。敲除l h h 基因小鼠临床表型为短肢侏儒 1 3 5 。i h h 被证明为调控骨骼发育、协调软骨增殖、软骨分化和成骨细胞分化的主 要信号分子p 6 。 骨骼纵向生长依赖g h 和i g f l 。垂体分泌的g h 刺激肝脏合成和释放i g f 1 ， i g f i 循环到靶器官长骨生长板，以内分泌形式发挥作用，促进骨骼纵向生长； 循环水平l g f 1 负反馈抑制垂体g h 合成与释放。这是经典生长介素假说1 3 7 1 。以 此为基础从器官水平提出了下丘脑一垂体肝脏轴和从分子水平提出了g h i g f i 轴概念。g h 、i g f 1 和l g f b p 3 是g h i g f i 轴主要构成组分。血清g h 、i g f 1 和i g f b p 一3 的水平是表示g h i g f i 轴的窗口。 生长板软骨细胞主导的软骨内成骨和成骨细胞、破骨细胞主导的骨代谢过程 在时间上保持协调一致。当生长板软骨基质钙化后，血管将从干骺端侵入钙化的 软骨基质，并把成骨细胞和破骨细胞带到软骨基质钙化部位。在该部位开始形成 新骨，替代软骨基质构成骨干，于是骨干加长，骨骼纵向增长。生长板软骨细胞 通过软骨基质钙化提供骨骼生长的空间，骨组织成骨细胞则依靠形成新骨实现骨 骼生长。骨钙蛋白、骨碱性磷酸酶、i 型胶原羧基端前肽是成骨细胞的分子标志 物。通过检测血清骨钙蛋白、碱性磷酸酶、i 型胶原羧基端前肽能反映骨形成的 成骨细胞功能状态。 近年来，研究发现c 型钠尿肽与骨骼纵向生长关系密切1 3 8 j 。c 型钠尿肽基 因失活突变或c 型钠尿肽受体失活的动物都表现为侏儒；c 型钠尿肽超生理剂量 表达或减慢失活则导致骨骼过度生长。因此认为c 型钠尿肽对软骨内成骨过程 起重要作用，是调控骨骼纵向生长的重要信号分子【3 9 】。有研究显示血清c 型钠 尿肽可以直接代表生长板的骨骼纵向生长能力。 此外，可以通过了解生长板的组织学结构变化认识其功能发育。生长板作为 一种特殊的结缔组织，可以借助不同的染色方法较为清晰地反映其组织形态结 构。h e 染色是组织学常规染色方法，m a s s o n 三色法和m a l l o r y 三色法是常用的 复口大学博j ：研究生学位论文 8 一 结缔组织复合染色方法，a p p a s 染色和v g 染色也各具特点。在生长板细胞组 织学观察中，我们将h e 染色作为基本染色方法，并分别尝试各种特殊染色，以 期清晰反映生长板组织学形态特征。 把生长板作为糖皮质激素的靶器官，从信号分子水平认识骨骼纵向生长过 程，为我们研究糖皮质激素抑制骨骼纵向生长的机制拓宽了研究领域、提供了崭 新方向。我们对生长发育阶段大鼠进行糖皮质激素干预实验，从三个层面探讨糖 皮质激素抑制骨骼纵向生长的机制。1 、生长板组织形态学层面。通过m a s s o n 三色法、m a l l o r v 三色法等组织学特殊染色方法，显示生长板组织形态，直接测 量生长板厚度、增殖带和肥大带厚度，以此反映糖皮质激素对生长板软骨细胞的 直接生物学效应。2 、信号分子层面。通过免疫组织化学技术在生长板原位观察 糖皮质激素受体、信号分子t g f b 1 和l h h 表达情况，从而揭示糖皮质激素抑制 骨骼纵向生长的机制。3 、血清学标志物层面。既关注垂体分泌的g h 、肝脏所 产生的i g f i 、i g f b p 一3 的血清学变化，同时又把成骨细胞分子标志物骨钙蛋白、 碱性磷酸酶、l 型胶原羧基端前肽，以及生长板生长能力指标c 型钠尿肽纳入检 测体系，从而全方位认识糖皮质激素抑制骨骼纵向生长的机制。 复口人学博 ：研究生学位论文 9 一 材料和方法 一、动物实验 ( 一) 模型制备 4 窝清洁级纯系s d 大鼠，3 周龄，每窝5 只，共计2 0 只。动物批号：6 0 9 1 2 6 。 为了排除性别对结果的干扰，本研究均选用雄性大鼠。每窝5 只大鼠被随机分为 对照组2 只，地塞米松组3 只。地塞米松组大鼠1 2 只，对照组大鼠8 只。同窝、 标准啮齿类饲料饲养，环境温度2 4 。c 左右，湿度5 0 左右。自然昼夜照明，自 由进食水。 地塞米松组：地塞米松剂量为2 0 0ug 1 0 0 9 ，连用1 0 天。 对照组：等容积的生理盐水。 给药途径：腹腔注射。 给药时间：每同上午8 时。 对所有大鼠每日进行称重。末次给药后次日8 时宰杀大鼠。 ( 二) 测量与取材 1 、麻醉：采用1 0 水合氯醛溶液。新鲜配置，水合氯醛1 9 ，溶于1 0m l 蒸 馏水，即为1 0 水合氯醛溶液。最后一次给药后次同8 时，对大鼠进行称重，根 据体重计算水合氯醛用量。1 0 水合氯醛用量为宰杀同大鼠体重( g ) 0 3 5 0 0 1 ( m 1 ) 。用药后2 m i n ，大鼠即进入麻醉状态。 2 、测量鼻尾长：麻醉状态下，大鼠腹卧位，测量鼻尾长。同一人员测量， 重复3 次取其平均值。鼻尾长为：大鼠腹卧状态下，鼻尖到尾末端的距离。 3 、采血：眼球摘除采血法。大鼠麻醉状态下，采用眼球摘除采血，两侧眼 球依次采集。室温放置，待充分凝血后，离心速度3 0 0 0 转分，离心5 m i n ，分离 血清，保存于8 0 0 c 冰箱待测。 4 、胫骨分离与测量：从膝关节和踝关节之间，剔去附着的软组织，剥离出 完整的胫骨。胫骨长：胫骨近端关节面和远端关节面之间的距离。用游标卡尺测 量。同一人员重复测量3 次，取其平均值。 5 、制备包含生长板的胫骨组织块：从膝关节下1 c m 处，离断胫骨，得到含 有生长板的胫骨组织块。沿胫骨外侧嵴和胫骨内侧嵴连线，垂直于水平面，用解 剖刀快速做冠状切面切开胫骨组织块。每一胫骨组织块分为两部分，前部( 胫骨 粗隆部) 和后部。这些制备完成的组织块将用作切片材料，进行进一步的组化或 免疫组化染色测定。 二、试剂和仪器 ( 一) 试剂 1 、主要化学试剂和染料 复旦大学博i j 研究生学位论文 乙二胺四乙酸二钠 亚硫酸氢钠 硫酸铝钾 三氯化铁 重铬酸钾 阿利新蓝 2 4 6 三硝基苯酚 碱性品红 酸性品红 苏木色精 高碘酸 红色氧化汞 亮绿 磷钨酸 橙黄g 伊红y 丽春红2 r 地塞米松 2 、免疫组化一抗 糖皮质激素受体 天津市永大化学试剂开发中心 天津市永大化学试剂开发中心 天津市永大化学试剂开发中心 天津市永大化学试剂开发中心 天津市永大化学试剂开发中心 国药集团化学试剂有限公司 上海化学试剂有限公司 天津市光复精细化工研究所 天津市永大化学试剂开发中心 国药集团上海化学试剂有限公司 天津市光复精细化工研究所 河北邢台化学试剂有限责任公司 天津市光复精细化工研究所 天津市永大化学试剂丌发中心 天津市光复精细化工研究所 北京化学试剂公司 国药集团化学试剂有限公司 浙江仙琚制药股份有限公司 国药准字h 3 3 0 2 0 8 2 7 美国a b r 公司 c a t a l o g u e ：m a l 5 1 0 m o u s em o n o c l o n a l i g g 2a g a i n s tr a tg r i i l l l美国s a n r a c r u z 公司 c a t a l o g u e ：c - 1 5 ：s c 一1 1 9 6 g o a tp o l y c l o n a la n t i b o d ya g a i n s tc t e 肌i n u s o fi h ho f h u m a no r i 舀n t g f b 1美国s a 卜兀ac r u z 公司 c a t a l o g u e ：s c 一1 6 4 r a b i tp o l y c l o n a la n t i b o d ya g a i n s tc - t e 肿i n u s o ft g f b1o f h u m a no r i 沓n 3 、血清学检测试剂盒 ( 1 ) 生长激素试剂盒( g o a ta n t i - r a t 伊o w t hh o 册o n e “t ) 美国a d l 公司 复旦大学博i ：研究生学位论文 c a t a l o g u e ：q r c t - 3 0 3 3 2 1 e i a u t l ( 2 ) i g f l 试齐u 盒( g o a ta n t i - r a ti n s u l i nl j k eg r o w t hf a c t o r lk i t ) 美国a d l 公司 - c a t a l o g u e ：q r c t 3 0 3 3 2 2 e 队、u t l ( 3 ) i g f b p 3 试齐0 盒 ( g o a ta n t i - r a tt o t a li n s u l i nl i k eg m w t hf a c t o rb i n d i n gp r o t e i nt y p e 3k i t ) 美国a d l 公司 c a t a l o g u e ：q r c r 3 0 3 3 0 2 e i a u t l ( 4 ) 骨钙蛋白试剂盒 ( g o a ta n t i - r a tg a m m a c a r b o x y g l u t a m i ca c i dc o n t a j n i n gp r o t e i nk i t ) 美国a d l 公司 c a t a l o g u e ：q r c t 3 0 1 3 3 1 3e l 虬u t l ( 5 ) l 型胶原羧基端前肽试剂盒 ( g o a ta n t i - r a tc a r b o x y t e n n i n a lp m p e p t j d eo ft y p ep r o c o l l a g e n ) 美国a d l 公司 c a t a l o 舀l e ：q r c t - 3 012 0 3 e l 虬u t l ( 6 ) c 型钠尿肽试剂盒( g o a ta n t i r a tct y p en a t r i u r e t i cp e p t i d ek i t ) 美国a d l 公司 ( 7 ) 碱性磷酸酶试剂盒 ( 二) 主要仪器设备 切片机 c a t a l o g u e ：q r c t 3 0 3 3 3 1e n u t l 南京建成生物工程研究所 k i c a0 w i n 数字图像分析仪 全自动酶标仪 三、实验方法 ( 一) 染液配制 1 、h e 染色 h a 州s 明矾苏木素液 德国l e i c a 公司，r m 2 0 1 5 德国k i c a 公司 芬兰l a b s y s t e m s 公司，w e l l s c a nm k 甲液：苏木素1 克，纯酒精2 0 毫升，混溶。 乙液：钾明矾2 0 克，蒸馏水2 0 0 毫升，加温溶解。 在乙液呈小沸腾状时，将甲液缓缓倒入，继续加热煮沸1 m i n ；停火后缓慢加入 氧化汞0 5 克，文火加热煮沸1 m i n 后，迅速放入冷水内冷却，冷却过滤后即可 应用。 1 伊红酒精溶液：伊红yo 5 克，8 0 酒精1 0 0 毫升，混溶。 复且人学博卜研究生学位论文1 2 。一 2 、m a s s o n 三色法 ( 1 ) m a s s o n 三色法( 亮绿复染) m a s s o n 复合染色液：酸性品红1 9 ，丽春红2g ，橘黄g 2 9 ，0 2 5 醋酸3 0 0 m l 。 亮绿染色液：亮绿o 2 9 ，蒸馏水1 0 0m l ，冰醋酸0 2m l 。 ( 2 ) m a s s o n 三色法( 苯胺蓝复染) 。 m a s s o n 复合染色液：同上。 苯胺蓝染色液：甲苯胺蓝0 1 9 ，0 2 醋酸l o o m l 。 3 、m a l l o n r 三色法 重铬酸钾液：重铬酸钾2 5 9 ，醋酸5 m l ，蒸馏水9 5 m l 。 苯胺蓝橘黄g 溶液：苯胺蓝o 5 9 ，橘黄g 2 9 ，磷钨酸1 9 ，蒸馏水1 0 0 m l 。 酸性品红液：酸性品红o 5 9 ，蒸馏水1 0 0 m l 。 4 、a b p a s 染色 1 阿尔辛蓝( a l c i a nb l u e ) 染液：阿尔辛蓝8 g s1 9 ；冰醋酸3 m l ，蒸馏水9 7 m l 。 过碘酸氧化液：过碘酸o 5 9 ，蒸馏水1 0 0 m l 。 s c h i f f 液：碱性品红1 9 ，1 m o l l 盐酸2 0m l ，重亚硫酸钠2g ，蒸馏水2 0 0 m l 。 s c h i f f 液配制过程：称取1 克碱性品红研磨成细粉状，加到1 0 0 毫升煮沸蒸 馏水中；微热状态下( 5 m i n ) 不断搅拌，直至溶解。冷却至室温，加入2 0 毫升 1 m o l l 盐酸，充分搅匀；加入2 克重亚硫酸钠，摇动至充分混匀，蔽光静置2 4 小时。加入活性炭0 3 9 ，摇动2 m i n 后过滤，滤液无色。置棕色瓶保存。 5 、v a ng j e s o n 染色法 v a ng i e s o n 液：1 酸性品红水溶液1 0 m l ，苦味酸饱和水溶液( 约1 2 2 ) 9 0 m l ，将二者混合。 w e i g e n s 铁苏木精工作液 溶液a ：苏木精1 0g ，9 5 酒精1 0 0m l 。 溶液b ：2 9 三氯化铁水溶液4 m l ，蒸馏水9 5m 1 ，盐酸1 m l 。 临用时溶液a 和溶液b 等量混合即可使用。混合时应将b 液加入a 液内， 染液呈紫黑色。铁苏木素将细胞核染成黑色。 ( 二) 石蜡切片制备 固定：将含有生长板的胫骨组织块用3 8 甲醛溶液固定，过夜，4 0 c 。 脱钙：1 5 e d t a ( 乙二胺四乙酸钠) 磷