（植物学专业论文）环状芽孢杆菌果胶酶和木聚糖酶分离纯化及性质研究.pdf

摘要 果胶酶( p e c t i n a s ee c 3 2f t s ) 是分解果胶质的复合酶。按其作川机理分为果胶解聚酶 ? ( d e p o l y m e r i z i n ge n z y m e ) 币j 果股酯酶( p e c t i n e s t e r a s e ) 两大类；它普遍存在丁i 植物果实和微生物中， 广泛应朋于食品- 业的果汁澄清加c ，纺织：i ：业麻类脱胶，眚牧业的饲料添加剂等。小聚糖酶( x y l a n a s e ) 是一类重要的术糖苷键水解酶：木聚糖的酶法降解在食品工业、饲料_ i 二业、制约i ：业等众多行业中有 着十分诱人的应用前景。本文旨在对环状芽孢料曲a 6 产生的果股酶和术聚糖酶进行分离纯化。并对其 结构和性质进行研究，为果股酶和术聚糖酶的进一步开发提供试验依据。试验结果如f ： ( 1 ) 为探明环状芽孢杆曲果胶酶及术聚糖酶的催化特性，更好发挥它们的催化性能，本文从p h 值， 温度、底物浓度、反应时间、离子强度儿个方面研究了环状芽孢杆菌九产生的果胶酶与术聚糖酶活性 测定的最适方法。结果表明，果胶酶活性测定的最适条件是：0 5 的果胶溶液t l l jp h1 0 5 的0 2m o l t 。 甘氨酸一氢氧化钠缓冲液配制，测定温度4 5 ，酶反应时间5 m i n ；小聚糖酶活性测定的最适条1 ，i ：是： 0 8 的木聚糖溶液用p h7 0 的0 2m o l l 磷酸缓冲液配制。测定温度5 5 ，酶反应时间1 0m i n ； ( 2 ) 发酵液采用( n h ) z s 吼盐析沉淀、透析、浓缩，c m s e p h a d e x c - 5 0 凝胶离子交换牲层析，s e p h a d e x g - 1 0 0 凝胶柱层析等三步方法对果胶酶和术聚糖酶进行分离纯化，并_ i j 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定果胶酶 和木聚糖酶纯度，用s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳测定果胶酶和小聚糖酶分子量。结果表明：果胶酶1 的 比活是发酵液中该酶比活的4 1 2 倍，术聚糖酶的比活是发酵液中该酶比活的1 8 ，3 倍。果胶酶l 和小 聚糖酶接近电泳纯，果胶酶1 两个哑基的相对分子质量分别为：3 22 5 3 ，2 74 0 0 ，小聚糖酶两个弧基的 相对分子质避分别为：8 64 8 9 。5 74 2 2 。 ( 3 ) 研究了果胶裂解侮和小聚糖酶的酶学性质 果胶酶l 经分析为果胶裂解酶；果胶裂解酶和术聚糖酶在3 0 5 0 时都比较稳定；果胶裂解酶和 术聚糖酶的最适反应温度都是4 5 ；果胶裂解酶在p h9 一l i 的范同内比较稳定，最适反戍p 1 1 为1 0 5 ； 小聚糖酶在p h6 8 的范围内比较稳定，最适反应p h 为7 。 ( 4 ) n m 9 2 对果胶裂解酶有轻度的抑制作用，f e ”，c u “对有果胶裂解酶严重的抑制作用，只有c 有一定 的檄活作用；k t m g ”对术聚糖酶基本上没有抑制作用。c u 2 对水聚糖酶有严重的抑制作 5 ，c 0 和f e 2 对术聚糖酶有一定的激活作用。 ( 5 ) 实验证明：本果胶裂解酶可以_ 【i j | 于贬麻茎杆脱胶和果汁澄消，小聚糖酶可刚于催化稻草和弧麻水解 生产低聚术糖及阚丁二纸浆漂白。 关键词：环状芽孢杆菌a 。：果胶酶；木聚糖酶；分离纯化：酶学性质 a b s t r a c t p e c t i n u s e ( e c 3 2 ，1 5 ) i sm u l t i p l e xe n z y m e sc a t a l y s i n gp e c t i n eh y d r o l y s i s ，t h e r e a r et w ok i n d s a c c o r d i n gt or e a c t i o nm e c h a n i s m ，t h e ya r ed e p o l y m e r i z i n ge n z y m ea n d p e c t i n e s t e r a s e p e c t i n a s ea r eg e n e r a l l y d i s c o v e r e di nf r u i t a g ea n dm i c r o o r g a n i s m nw a sw i d e l yu s e dt od e f e c a t i o np r o c e s s i o no f j u i c ei nf o o d i n d u s t r y p r o c e s s i o nb e i n gr e t t e do f f l a xi ns p i n n i n gi n d u s t r y a n df e e d i n g s t u f f a d d i t i v ei nf a r m i n g x y l a n a s ei s h y d r o l a s ea c t i n go nx y l a n ，t h e yh a v e t h ed e v e l o p m e n tf u t u r ei nf o o d ，f e e d i h g s t u f f a n dp h a r m a c yi n d u s t r y i n o r d e rt oe n l a r g et h e i ru t i l i z a t i o no fp e c t i n a a s ea n dx y l a n a s e ，i tw a ss t u d i e dt h a tt h ep u r i t y , s t r u c t u r ea n d p r o p e r t i e so f t h ep e c t i n a s ea n dx y l a n a s ef r o mb a c i l l u sc i r c u l a r s a 6i nt h ep a p e r t h em a i nr e s u l t sa l ea s f o l l o w s ： ( i ) l no r d e r t o f i n do u t t h ec a t a l y s i s c h a r a c t e r o f p e c t i n a s e a n dx y l a n s e i n b a c i l l u s c i r c u l a n s e a 6a n de x h i b i t t h e i rm a x i u mc a t a l y s i sr a t e ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o nf o rd e t e r m i n a t i o no fp e c t i a a s ea n dx y l a t l a s ea c t i v i t yi n 6 f 眦c i r c u l a n s ea 6w a ss t u d i e di na s p e c to f p h ，t e m p e r a t u r e ，s u b s t a n c ec o n c e n t r a t i o n ，r e a c t i o n ! i m e ，a n i o n c o n c e n t r a t i o n t h eo p t h o u mc o n d i t i o nf o rd e t e r m i n a t i o np e c t i n a s ea c t i v i t ys h o w e da s ：0 ，5 p e c t i n es o l u t i o n ， p h1 0 5 、0 2 m o l lg l y c i n e s o d i u mh y d r o x i d eb u f f e r , a t4 5 ，r e a c t i o nf o rf i v e - m i n u t e s ；t h eo p t i m u m c o n d i t i o no f x y l a n s ea c t i v i t yw a s ：0 8 x y l a ns o l u t i o n ，p h7 0 、0 2 m o l lp h o s p h a t eb u f f e r , a t5 5 ，r e a c t i o n f o rt a n - m i n u t e s ( 2 ) a f t e rb o t ho fp e c t i n u s ea n dx y l a n s ew e r es e p a r a t e da n dp u r i f i e db y ( n h 4 ) 2 s 0 4 s e d i m e n t a t i o n ，t h ep u r i t yo f t h ep e e t i n a s ew a sf u r t h e ri m p r o v e db yd i a l y s i s ，c m - s e p h a d e xc - 5 0g e la n i o ne x c h a n g ef i l t r a t i o na n d s e p h a d e xg 5 0g e lf i l t r a t i o n t h ep u r i t yo fp e c t i n a s ea n dx y l a n u s ew a s d e t e r m i n e db yp a g e t h em o l e c u l a r w e i g h to f p e c t i n a s ea n dx y l a n a s ew a sd e t e r m i n e db ys d s - p a g e t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep u r i t yo f t h e p e c t i n a s e w a s i m p r o v e da b o u t4 1 2 t i m e s t h e p u r i t yo f t h ex y l a n s e w b s i m p r o v e d a b o u t l 8 3 t i m e s t h e e l e e t r o p h o r e t i cp u r i t yo f p e c t i n a s ea n dx y l a n a s ew e r eg e t t h em o l e c u l a rw e i g h t o f t w os u b u n i t si nt h e p e c t i n a s ei sr e s p e c t i v e l y3 22 5 3a n d2 74 0 0 ；t h em o l e c u l a rw e i g h to f t w os u b u n i b i nt h ex y l a n s ei s r e s p e c t i v e l y8 64 8 9a n d5 74 2 2 ( 3 ) t h ee n z y m o l o g yp r o p e a i e so f t h ep e c t i n a s ea n dx y l a n a s ew a s s t u d i e d p e c t i n a s eii sd e p o l y m e r i z i n ge n z y m e ，t h ed e p o l y m e r i z i n ge n z y m ea n dx y l a n a s ei ss t a b l eo n3 0 - 5 0 ； t h eo p t i m a lr e a c t i o nt e m p e r a t u r eo f d e p o l y m e r i z i n ge n z y m ea n dx y l a n a s ew a s4 5 ；t h ed e p o l y m e r i z i n g e n z y m e w a ss t a b l e o np h 9 - 1 l ，t h e o p t i m a lr e a c t i o n p ho f d e p o l y m e r i z i n g e n z y m e w a sp h1 0 5 ；a n d t h e x y l a u s ei ss t a b l eo np h6 - 8 ，t h eo p t i m a lr e a c t i o np ho f x y l a n s ew a s7 ( 4 ) t h ed e p o l y m e r i z i n ge n z y m ew a sl i g h t l yi n h i b i t e db yk + ，m g z + ，a n dw a ss e r i o u s l yi n h i b i t e db y f e t c u 2 + ，a n dal i t t l ea c t i v a t e db yc a 2 + ；t h ex y l a n a s ew a sn o ti n h i b i t e db yk + ，m 9 2 + , a n dw a ss e r i o u s l yi n h i b i t e d b yc u “；a n dl i g h t l ya c t i v a t e db yf e c a 2 + ( 5 ) t h ee x p e r i m e n tr e s u l ts h o w e d ：t h ed e p o l y m e r i z i n ge n z y m ew i t su s e dt 9r e t t i n gi nf l a xs t e ma n dj u i c e p r o c e s s i o n ；t h ex y l a n a s ew a su s e dt op r o d u c ex y l o o l i g o s a c c h a r i d ew i t hf l a xs t e ma n d r i c es t e ma n dw a su s e d t op a p e rb l a n c h i n g k e yw o r d s ：b a c i l l u sc i r c u l a r sa 6 ；p e c t i n a s e ；x y l a n a s e ；s e p a r a t e da n dp u r i f i e d ；e n z y m o l o g yp r o p e r t i e s 缩略词 聚甲基半乳糖醛酸酶 聚甲基半乳糖醛酸裂解酶 聚半乳糖醛酸酶 果胶裂解酶( 聚半乳糖醛酸裂解酶) 果胶酯酶 紫外线 亚硝基胍 3 , 5 一二硝基水杨酸 聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶 丙烯酰铵 甲叉双丙烯酰铵 三羟甲基氨基甲烷 十二烷基硫酸钠 四甲基乙二铵 外切 内聚 p m g p m g l p g p g l 或p a t e p e u v n t g d n s p a g e g e l a c r b i s t r i s s d s t e m e d e x o e n d o 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 研究生签名：雌时阃：硼年f 狷f 加 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，郎：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文 的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 时间： 训) 年i 阴l r 时m 姗7 嘶上月2 闩 予 恒占 雇掷 名 孔 戳 潞 的 签 矜 导 日i j 旨 l 研究目的与意义 酶工程是随着酶的开发和利用而逐渐发展起来的。人类对酶的利用开始于制酒和制酱， 至今已有几千年的历史；但只是在近几十年，酶的丌发利用才成为- - f 新的学科酶工程。 1 8 4 9 年，日本的高峰让吉光从米曲霉中制得淀粉酶用作消化剂，丌创了有目的进行酶生产和 应用的先例。1 9 0 4 年，用液体深层培养法进行细菌一淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业 的序幕；自然界己发现的酶约2 5 0 0 0 种，酶作为一种生物催化剂，由于反应条件温和，专一性 强，工业上用酶反应来代替需要高温，高压，强酸，强碱的化学反应；在简化工艺、降低设备投 资与生产成本、提高质量与收率、节约原料与能源以及改善劳动条件和消除劳动公害等方 面t ：q 益受到人们的重视。酶的生产和应用的技术过程称为酶工程，其主要任务是工业上有目 的的预先- 发计一定的反应器和反应条件，经人工操作而获得大量所需的酶，并利用各种方法 最大发挥酶的催化功能，生产人类所需要的产品或服务于社会的- - f 应用技术i i i 。同时酶制 剂工业作为- f 新兴工业，在六十年代迅速发展起来，目前主要用于食品发酵，饮料工业，纺 织制革，洗涤剂以及医药，造纸等轻工业几方面。在酶的应用过程中，人们注意到酶有一些不 足之处，未能完全满足使用要求；如酶的稳定性差，对热、强酸、强碱、有机溶剂等不稳定； 酶通常是在水溶液中与底物作用，因此只能使用一次，同时酶蛋白在反应液中与产物混合在 一起，也使产物的分离纯化较为复杂；因此，为了更好地发挥酶的催化功能，人们尝试了对酶 分子进行修饰即通过各种方法，使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的功能和特性， 以满足人们对酶使用的要求；其主要方法有酶的生物合成及其调节控制研究，固定化酶、固 定化细胞、固定化原生质体的研究，酶的基因克隆和异源表达、定点突变、融合酶的研究等。 果胶i 鹱j 2 , 3 1 ( p e c t i n a s ee c 3 ，2 ，j ) 是分解果胶质( 由d 一半乳糖醛酸以a l ，4 糖苷键连接 形成的直链状的聚合物) 的一类含多种酶的复合酶。按其作用机理t 4 1 分为果胶解聚酶 ( d e p o l y m e r i z i n g e n z y m e ) 和果胶酯酶( p e c l i n e s t e r a s e ) 两大类；果胶解聚酶按底物作用的 专一性和对糖苷键作用的机理又进步分为聚甲基半乳糖醛酸酶( p o l y m e t h y g a l a c t r o n a t a s e ， b 1 p m o ) 、聚甲基半乳糖醛酸裂解酶( p o l y m e t h y l g a l a c t u r o n a t el y a s e ，f l o p m g l ) ，聚半乳糖 醛酸酶( p o l y g a l a c t u r o n a t a s e ，目0 p g ) 、聚半乳糖醛酸裂解酶( p o l y g a l a c t u r o n a t el y a s e ，即p g l ， 又称聚半乳糖醛酸反式消去酶p a t e ) ：这些酶按对糖苷链的切割方式又分为外切和内切两 类。果胶酶t 2 1 普遍存在于植物果实和微生物中，随来源不同j 其种类和组分有所不同，酶学性 质和作用方式亦有差异。它广泛应用于食品工业的果汁加工，果汁澄清，纺织工业麻类脱胶， 畜牧业的饲料添加剂等。传统的苎麻脱胶方法是化学法，使用强酸、强碱，并要求高温，高压 的处理条件，生产环境差，又会造成环境污染，还因特异性不强而污染纤维。而使用果胶酶对 麻类脱胶，既能减少环境污染，改善劳动条件和减轻对纤维的损坏，又能节约能量消耗，降低 成本。而且果胶酶可以快速彻底地脱除果胶，降低水果等榨汁的粘度，有利于果汁的过滤，滤 液澄清而且稳定，可减少澄清剂的用量，改善果汁质量，简化果汁加工工艺，缩短加工时| b j ，提 高生产效率、果汁产量和产品质量的稳定性 5 , 6 1 ；近年来随着我国果汁和果酒行业的迅猛发 展，对果胶酶的需求日益高涨。国内果胶酶的研究工作主要集中在菌种的选育，生产工艺和 应用工艺的改进等方面，果胶酶制剂的产量和质量还远远不能满足食品工业的需要。特别是 近年又开发了生化法造纸浆f 4 l ，使果胶酶更加短缺：在韧皮纤维原料中，纤维问质含有果胶及 多糖等，果胶酶能在碱性条件下降解果胶，分散纤维，极大限度地防止纤维降解，而且体系具 有一定天然抗杂菌污染的能力( 大多数细菌或酶的最适生长条件在酸性范围内) ；用该法造 纸浆得率高，污染小，耗能底，操作条件温和及纸浆性能好，这是化学法制浆所无法比拟的：另 外还有利用果胶酶生产果胶低聚糖和以果胶为底物生产低聚果胶、以凡丁质、几丁聚糖为 底物生产低分子寡糖等的产业；因此，该研究对于果胶酶在实际生产、生活中的应用有很大 意义。 木聚糖酶1 7 , 8 , 9 1 ( x y l a n a s e ) 是一类重要的木糖苷键水解酶，对于降解自然界大量存在的半 纤维素起着重要作用；木聚糖1 1 0 j ( p 一1 , 4 - x y l a n ) ：是植物半纤维素的主要成分，它是自然界中仅 次于纤维素的多糖，分别占被子植物和裸子植物千质量的1 5 3 0 和7 1 2 i 川。木聚 糖是毗喃木糖以p 一1 , 4 糖苷键连成主链的不均一多糖，侧链通常有0 乙酰基加l 呋哺阿拉 伯糖基，葡萄糖醛酸基【1 2 i 。广义的木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一组酶的通称l n i ， 主要包括三类：( 1 ) 内切一p i ，4 一木聚糖酶( 内切1 , 4 p d 术聚糖水解酶，ec 3 2 1 8 ) ，优先在不 同位点上作用于木聚糖和长链木寡糖，从p i ，4 木聚糖主链的内部切割木糖甘键，从而使术聚 糖降解为木寡糖，其水解产物主要为木二糖及术二糖以上的寡聚木糖，也有少量的术糖和阿 拉伯糖；( 2 ) 3 b 切p 1 ，4 木聚糖酶( 外切1 , 4 一p d - 木聚糖水解酶，ec 3 2 1 9 2 ) ，作用于木聚糖 和木寡糖的非还原端，产物为木糖；( 3 ) p 一木糖苷酶( 1 , 4 一d d 一木聚糖水解酶，ec 3 2 1 3 7 ) ， 办能通过切割木寡糖末端而释放木糖残基。狭义上的木聚糖酶仅限于第一类一内切一b 1 ，4 一 木聚糖酶。木聚糖的酶法降解1 1 4 l 在食品工业、饲料工业、制药工业等众多行业中有着十分 诱人的应用前景：在饲料i 业l i s ) 1 - ，该酶可以提高畜禽对饲料的利用率；在食品工业上，该 酶的水解产物一寡木糖足一类保健食品，还可以用于制备食品增稠剂和澄清果汁：在制浆造 纸1 1 7 , j s ) i 业上，纸浆经过木聚糖酶处理后，可降低卡伯值，减少含氯漂白剂的用量，从而降低环 境污染；在能源1 1 9 1 工业中，木聚糖酶在当前最被看好的应用i i i 景是生产酒精，利用植物资源 生产酒精成为了再生能源研究的主要方向，这有利于促进生物能的转化；相关研究表明术聚 糖酶在果实的成熟、种子的萌发、真菌的寄生以及植物的抗性等诸多生理过程中也起着重 要的作用。国外对木聚糖酶的研究起步较早，目前在日本、美国、加拿大等发达国家已经进 入商品化生产，它们水解所得低聚木糖已广泛被用于糕点、面包、奶粉、饮料、口服液等食 品中9 1 ；随着人们保健意识的增强，功能性低聚木糖必将进一步拓宽市场，进入食品加工的各 个领域： 2 国内外研究现状、水平和趋势 产果胶酶的微生物很多，主要以曲霉和卡下菌为主。如：液化气单孢菌( a e r o m o n a s l i q u f a c i e n t s ) ，节杆菌( a r t h r o b a c t e r ) 、芽孢杆菌( b a c i l l u s s j p ) ，多粘芽孢杆菌( b a c i l l u s p o l y m y x a ) 、短小芽孢杆菌( b p u m i l l u s ) 、球形芽孢杆菌( b s p h a e r i c u s ) 、萝h 软腐病欧氏 杆菌( e r w i n i ac a r o t o v o r a ) 、软腐病欧氏杆菌( e r w i n i aa r o i d e a e ) 及假单孢菌( p s e u d o m o n a s s j d ) 等【1 9 l 。新近报道的其它菌高大毛霉( 锄叩，m u c e d o ) p o ! 、嗜热侧他霉( 印o ，o 护缸 “m t h e r m o p h i l e ) 1 2 1 l 等桔草杆菌产生的果胶酶属于聚半乳糖醛酸裂解酶拉1 ( p o l y g a l a c t u r o n a t e 。 r i p g l ) ，这类酶通过反式消去作用切断果胶酸分子。一1 ，4 糖苷键产生具有不饱和链的半乳 1 糖醛酸酯，以分解纤维| 日j 的果胶；该菌摇瓶培养产酶活力可达1 5 1 0 4 u m l 。生长迅速，5 2h 就 大量产酶，此外还产木聚糖酶，而不产纤维素酶，这些特点适合麻类脱胶和造纸工业上的应 用；黑曲霉高产菌株a 够p r g f f f “sn i g e r3 5 0 2 i 竭在3 0 固体发酵培养5 5h ，产果胶酶活力可达 2 6 4 4 u 儋；黑曲霉产生菌爿& 删经激光诱变获得的黑曲霉突变株b l l 2 3 在以麸皮为主的培养基 中，在3 0 条件下，经3 8 4 0t l r 培养，产生果胶酶能力可达2 8 0 0 0u g ：其酶提取总收率能达9 0 以上；螺孢菌z g 9 9 0 1 1 2 4 1 摇瓶培养在培养基装料量3 0r o l l ( 2 5 0m e ) ，接种量为lm l 孢子悬 液，初始p h9 0 ，3 2 培养3 6h ，产碱性果胶酶活力可达7 8 4 2u m l ；米曲霉爿印o r y z a e 8 - 4 8 1 2 5 l 产果胶酶活力最高可达4 1 5 p g ( m i n - m l ) ；米曲霉爿j p e r g i l l u s o r y z a e 诱变菌株c 4 9 1 1 2 6 1 往3 5 固体发酵培养6 0h ，培养物果胶酶最高活力可达到1 6 9 4 8u g 鲜曲。 国内对木聚糖酶的研究起步较晚，但由于其良好的应用i i 景，已有多家单位进行了许多 不同的研究丌发工作1 2 7 1 。山东省食品发酵工业研究设计院依靠自己在发酵领域和功能性生 物制品领域的雄厚经验和人才优势，在所承担的国家“九血”科技攻关课题“酶法生产低聚 木糖”中对细菌产木聚糖酶进行了全面的研究工作，他们筛选到一株产木聚糖酶的芽孢卡丁菌， 进行了菌种选育、分类鉴定、培养条件优化、酶性质的研究、酶的中试生产以及酶在生产 低聚木糖上的应用等一系列工作，取得了详尽的实验数据和完整的低聚木糖生产工艺，完成 了从菌种到酶再到低聚木糖生产的全部课题任务，被众多专家学者认为其研究成果具有世 界先进水平。合肥联合大学获得产木聚糖酶的黑曲酶菌株a 3 ，所产酶最适反应温度5 5 。 最适反应p h4 6 ，液体发酵酶活达到3 5 0u m l ，固体发酵酶活力达到5 0 0 0u g 。山东大学微 生物系国家重点实验室研究获得产酸性木聚糖酶的菌株黑曲霉a n 一7 6 和产碱性木聚糖酶 的菌株嗜碱细菌c b 一2 ，摇床试验产木聚糖酶分别为3 5 0u m l 。和3 0 0u m l 。无锡江南大学 2 0 0 0 年报道，他们已经用u v 和n t g 方法诱变筛选出一株假单胞菌，命名为w l u n 0 2 4 ，发酵 初始最适p h6 ，5 8 5 之间，发酵最适温度3 7 。虽然国内众多研究单位的木聚糖酶的活力 数据有很大的差别，但不能仅仅凭酶活力一项来判断各家的酶的优劣，因为木聚糖酶是一种 复合酶，各家所用的菌种不同，所得到的木聚糖酶就不同，木聚糖酶的应用范围也就不同，如 饲料工业所需的木聚糖酶是偏酸性的，对酶解产物基本有要求；用来生产低聚木糖的木聚糖 酶的要求就要严格一些，它要求酶的最适p h 要尽量接近中性，以减少后处理的程序，降低成 4 本，对于酶解产物的要求是单糖含量越少越好，最好是不含木单糖，低聚木糖的含量占绝对优 势为最佳。木聚糖酶在当前最被看好的应用前景是在生产燃料方面。国际上利用植物资源 生产酒精成为了再生能源研究的主要方向。在1 9 9 1 年美国运用基因重组技术成功地培养 出可同时发酵五碳糖和六碳糖的微生物菌株后，使植物纤维水解生产酒精的技术得到了很 大的发展。水解植物纤维的方法包括酸解法和酶解法。用生物酶制剂水解植物纤维比酸解 法具有极大的优势和实际应用效果。用纤维素酶和木聚糖酶协同作用可以将植物纤维彻底 水解为单糖，再运用基因工程菌和发酵生产酒精，是现在燃料酒精研究开发的热点和最为推 崇的一种生产工艺，已有众多的科研机构、院校对这一方向正进行多方面深入的研究；我国 具有丰富的玉米芯、甘蔗渣及农作物秸杆、亚麻等富含半纤维素类自然资源的农林废弃物。 长期以来未受到充分重视和开发利用，如能将其制备成高附加值的低聚木糖，不仅促进我国 低聚糖工业的发展，还可以处理农林废料，变废为宝，保护环境，因此，对低聚木糖的研究丁f 发 具有十分重大的经济效益和社会效益。 3 前景与展望 环状芽孢杆菌a 6 【2 8 j 是一类既能产生果胶酶，又能产生木聚糖酶的菌株，它产生的果胶酶 活力可达7 8 0 0u m l ，木聚糖酶活力可达3 4 1 5u m i n ，适合于果胶酶制剂和木聚糖酶的丌发 研究。随着对果胶酶研究【2 9 j 的f t 益深入，其应用领域已逐渐拓宽。尽管如此，就果胶酶的高 效、多功能特点而言，其应用尚有较大的发展空问。随着分子生物学技术的不断发展，也可 利用基因克隆技术实现果胶酶在其它微生物宿主的表达。目前，某些新丌发的酶仍限制在结 构分析应用上。至于果胶酶酶谱问题仍值得进一步探讨，出现同类现象的还有淀粉酶、纤维 素酶、蛋白酶、脂肪酶等，它们都具有较广泛的水解活性。以廉价易得的果胶酶替代专一性 水解酶，可为生产具有生物活性的果胶低聚糖、几丁低聚糖等开辟一条新路。果胶酶的固定 化方法较多，但迄今为止极少应用于工业化生产。原因主要在于酶与载体结合的有效性、牢 固性不够高，载体的机械强度不够大等造成活力回收率偏低，操作稳定性差以及储藏稳定性 差等问题。因此，探索廉价、高效、应用性强的固定化果胶酶的方法，应用于更具发展前景 的新领域仍是一个值得深入研究的课题。 同样木聚糖酶也具有广泛的应用价值，木聚糖的酶法降解在食品工业，饲料工业、制药 5 工业等众多行业中有着十分诱人的应用前景：开发木聚糖酶可以缓解我国饲料资源的不足， 变废为宝，提高饲料的可消化性和动物的生产性能；可以水解木聚糖生产寡木糖等保健食品， 还可以用于制备食品增稠剂和澄清果汁；纸浆经过木聚糖酶处理后，可降低卡伯值，减少含 氯漂白剂的用量，从而降低环境污染。随着分子生物学的发展和众多新的实验方法的引入， 对木聚糖酶的研究已经达到了分子的水平，已有许多来自真菌和细菌的木聚德酶基因被克 隆并在大肠杆菌中获得表达。随着技术的不断发展，可以通过改进生产工艺，利用基因工程、 蛋白质工程等生物技术手段，来高效地生产高酶活、适应性强、抗逆性强的木聚糖酶，以实 现低成本、产业化的商品生产。而对木聚糖酶在各种动物饲喂不同同粮时作用模式的研究， 酶的最佳用量和最佳活力环境的确定、酶活性测定方法的统一以及我国饲料中木聚糖含量 数据库的建立都是我们以后还需努力的方向3 0 l 。总之，木聚糖酶必将在未来的食品工业、饲 料工业、制药工业发展中，发挥出其所具有的巨大潜力和作用。 本论文旨在对环状芽孢杆菌a 6 产生的果胶酶和木聚糖酶进行分离纯化，并对其结构和 性质进行研究，为果胶酶和木聚糖酶的进一步开发利用提供试验依据。同时。本环状芽孢杆 菌是从南方亚麻富集培养得到，而且是一株优势菌，其酶学性质对亚麻生长。亚麻质量构成究 竟有何关系，是一个值得今后深入探讨的问题。 6 第一章环状芽孢杆菌果胶酶及木聚糖酶活性 测定条件优化 黑曲霉产生的果胶酶属于酸性果胶酶，最适p h 值一般在酸性范围。枯草杆菌产生的果 胶酶1 2 j 产生的果胶酶属于弱碱性果胶酶，最适p h 值在p h 9 0 。里氏木霉木聚糖酶产生的木聚 糖酶属于酸性木聚糖酶，最适p h 值般在酸性范围。环状芽孢杆菌a 6 是一种能同时产生 果胶酶和木聚糖酶的菌株。产生的碱性果胶酶和中性木聚糖酶与黑曲霉 2 2 , 2 3 1 、枯草杆菌2 1 产生的果胶酶以及单氏木霉p l l 产生的木聚糖酶的酶学性质有差异。目l i i 虽已有枯草杆菌果 胶酶和里氏木霉1 1 3 l 木聚糖酶的测定方法，但它们不适用于环状芽孢杆菌果胶酶和木聚糖酶 活性的测定。为了正确检测环状芽孢杆菌果胶酶和木聚糖酶的活性，探明环状芽孢杆菌果胶 酶及木聚糖酶的催化特性，更好发挥它们的催化性能，在此研究了环状芽孢杆菌果胶酶和木 聚糖酶活性测定的最佳条件。 l 材料与方法 1 1 材料 坏状芽孢杆菌a 6 例由湖南农业大学生物科学技术学院生物工程系保存；果胶为s i g m a 公 司产品；木聚糖为f l u k a 公司产品；d n s ( 3 ，5 二硝基水杨酸) 1 3 2 i ；斜面培养基i ”i ：0 5 果胶 十o 3 牛肉膏+ 1 蛋白胨+ o 5 n a c i 十2 琼脂，p h7 5 ；种子培养基1 3 3 】：斜面培养基去掉琼 脂；摇瓶发酵培养基( 3 3 l ：7 亚麻茎粉+ 0 1 5 k 2 h p 0 4 + 1 o ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，2 5 0m l 三角瓶装 料量7 0m l ，p h7 5 ，5 接种量，温度3 5 ，转速2 0 0r r a i n ，培养时间：2 0h 。 1 2 方法 1 2 1 果胶酶常规活性测定方法1 3 4 j 半乳糖醛酸标准曲线的制作：准确配制o ：1 d 一半乳糖醛酸杯准样液，按表2 i 在各 管中加样。在沸水浴中加热5 m i n ，冷却后定容至2 5 m l 。在5 2 0b m 波长下测其吸光度值【片j o d 5 2 0 表示) ，用空白管溶液调零，以o d 5 2 0 值为横坐标，d 半乳糖醛酸量( p g ) 为纵坐标绘制 标准曲线。 表2 i 半乳糖醛酸标准曲线制作方法 t a b l e2 i t h em e t h o do f g a l a c t u r o n i ca c i ds t a n d a r dc u r v e 管号0 t234567s9 半乳糖醛酸标准样液00 ( m l ) 半乳猪醛酸( p g ) 0 蒸馏水( m l ) 2 0 d n s 试剂( r o b ) 2 0 1 0 0 3 9 2 0 0 ，2 0 30 4 0 5 0 ，6 07 080 9 l0 2 0 0 38 2 o 3 0 0 3 7 2 0 4 0 0 3 6 2 o 5 0 0 35 2o 6 0 0 3 4 2o 7 0 0 3 3 2 。0 在沸水浴中加热煮沸5 r a i n 。冷却后定容争2 5 m l 8 0 0 3 2 2 0 9 0 0 3 i 2 0 0 0 0 3 0 20 o d 5 00 0 00 0 5 20 1 1 401 9 70 2 9 003 8 80 ，4 5 00 5 5 70 6 3 90 7 1 8o 7 9 2 半乳糖醛酸标准曲线 y = 1 1 8 0 1 x 5 47 2 2 酽= 0 9 9 8 5 0d 值( x ) 幽2 i半乳糖薛酸标准曲线 f i g2 1t h es t a n d a r dc u r v bo f g a l a c t u r o n i ca c i d 8 瑚 删 啪 啪 伽 咖 。 掣)j荨钲澍器醇醉 酶活力测定方法：发酵液过滤为测定的酶液，在2 5m l 试管中加入3 , 9m l 底物，5 0 恒 温水浴中预热5r a i n 再加入0 1m l 酶液，摇匀，精确反应3 0m i n ，然后加入d n s 试剂2 0m l ， 以下操作同标准曲线绘制，分别取经加热煮沸1 0 r a i n 的失活酶做空白，测得o d 5 2 0 值，在标准 曲线上查得相应的d 一半乳糖醛酸的量，代入下面公式计算得果胶酶的活力： 果胶酶活，j p g ( m l m i n ) j = ( x n ) ( 1 v ) x 一酶作用生成的半乳糖醛酸量( p g ) ；n 一标品稀释倍数； t 一反应作用时1 b j ；v 一取样量( m l ) ； 1 2 2 木聚糖酶活性测定方法【l0 1 ： 木糖标准曲线的制作：准确配制o 1 5 木糖溶液为标准样，参照半乳糖醛酸标准曲线制 作1 3 3 】，将标准液用木糖溶液代替。 表2 2 术糖标准曲线的绘制 t a b l e2 2t h em e t h o do f x y t o s os l a n d a r dc u r v e 9 ， 嘲 器 * 木错标准曲线 y = 1 1 4 63 x + 1 3 6 6 9 0 20 40 ，60 8 1 1 2 1 4 0 d 值( x ) 豳2 2 小糖标准曲线 f i g2 2t h es t a n d a r dc n l n eo f x y l o s e 酶活力的测定方法：发酵液过滤为测定酶液，在2 5m l 试管中加入3 8m l 底物，5 0 恒 温水浴中预热5 r a i n 再加入0 , 2 m l 酶液，摇匀，精确反应5 m i n 后取出，加入2 0 m l d n s 试剂， 以下操作同标准曲线绘制，分别取经加热煮沸1 0m i n 的失活酶做空白，测得o d 5 4 0 值，在标准 曲线上查得相应的木糖量，代入下面公式计算得木聚糖酶的活力 木聚糖酶活力( p g m l m i n ) = ( x n ) ( t v ) x 一酶作用生成的木糖量( p g ) ；n 一标品稀释倍数； t - 一反应作用时| 日j ( m i n ) ；v 一取样量( m l ) ； 1 2 3 酶活测定最佳条件：在酶活原测定方法基础上，改变不同的影响因素( p h 值、温度、底 物浓度、反应时间、离子强度) 做果胶酶和木聚糖酶活性的测定。从而选择酶活测定最佳条 件。 1 ) 果胶酶和木聚糖酶最适p h 的确定：以不同p h 值的o 1m o l l 缓冲溶液( p h3 0 、4 0 、 5 0 为柠檬酸缓冲液，p h6 0 、7 0 、8 0 为磷酸缓冲液，p h9 0 、1 0 ，0 、1 1 0 、1 2 0 为甘氨酸一 氢氧化钠缓冲液) 配制0 5 的果胶溶液和木聚糖溶液，然后测定果胶酶和木聚糖酶的活性； 在最适p h 初确定以后，再以p h5 5 、6 0 、6 5 、7 0 、7 5 、8 , 0 磷酸缓冲液配制o 5 的 木聚糖溶液，以p h9 5 、1 0 0 、1 0 5 、。1 1 0 、1 1 5 、1 2 0 甘氨酸氢氧化钠缓冲液配制o 5 果 胶溶液，然后测定果胶酶和木聚糖酶的活性； 2 ) 果胶酶和木聚糖酶最适温度的确定：用最适p h 值下的缓冲溶液配制0 5 的果胶溶液和 啪伽枷咖啪伽枷。 木聚糖溶液，然后在不同温度下测定果胶酶和木聚糖酶的活性； 3 ) 果胶酶和木聚塘酶最适底物浓度的确定：用最适p h 值下的缓冲溶液配制不同浓度的果 胶溶液和木聚糖溶液，然后按2 ) 中最适测定方法测定果胶酶和木聚糖酶的活性； 4 ) 果胶酶和木聚糖酶最适反应时问的确定：按3 ) 中最适测定方法以不同反应时间测定果 胶酶和木聚糖酶的活性； 5 ) 果胶酶和木聚糖酶底物最适离子浓度的确定：用不同浓度的最适p h 值下的缓冲溶液配 制最适底物浓度的果胶溶液和木聚糖酶溶液，然后按4 ) 中最适测定方法测定果胶酶和木聚 糖酶的活性； 2 结果与分析 2 1 p h 对果胶酶及木聚糖酶活性的影响： 在以0 1m o l l 的p h3 0 、4 0 、5 0 、p h6 0 、7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0 、1 1 0 、1 2 0 缓冲溶 液配制o 5 的果胶溶液和术聚糖溶液时，测得果胶酶活性最大时的最适p h 为l l 左右，木聚 糖酶活性最大时的最适p h 为7 左右；再以p h5 5 、6 0 、6 5 、7 0 ，7 5 、8 0 磷酸缓冲液配 制o 5 的木聚糖溶液，以p h9 5 、1 0 0 、1 0 5 、1 1 0 、1 1 5 、1 2 0 甘氨酸一氢氧化钠缓冲液配 制0 5 果胶溶液，测得果胶酶和木聚糖酶的活性如图2 3 。 看 i 瑚 娄z 0 0 蜒 鞋 o 5 56 o 粜胶酶 术聚糖酶 一 77 5 丌一伽圳 图2 3p h 对果胶酶及木聚糖活性的影响 f i g2 3t h ee f f e c to f p ho i lp e c t i