（临床兽医学专业论文）不同能量摄入水平对奶牛产后脂肪动员的影响及其调控机制.pdf

本研究由“国家自然科学基金重点项目” ( 项目编号3 0 2 3 0 2 6 0 ) 资助 f u n d e db yk e y p r o g r a mp r o j e c to f n a t i o n a l n a t u r a ls c i e n c ef o u n d a t i o n ( n o 3 0 2 3 0 2 6 0 ) 英文缩略词表 英文缩写英文全称中文全称及注释 4 沈阳农业大学硕士学位论文 中文摘要 围产期奶牛能量代谢特点是：干物质摄入减少而需求增加所致的能量负 平衡，干物质摄入减少是起因，能量负平衡是表现，脂肪动员是效应，酮病 和脂肪肝病是结果。许多因素可引起围产期奶牛干物质摄入减少。近年来， 代谢信号( m e t a b o l i cs i g n a l s ) 对摄食调节及能量代谢调节成为一个研究的热 点。代谢信号包括营养素、代谢产物、生殖激素、应激激素、瘦蛋白、胰岛 素、胰岛素样生长因子i ( i n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o ri ，i g f i ) 胰高血糖素、 肠肽、细胞因子和神经肽y 等，其中瘦蛋白、n p y 对摄食的调节作用尤为 突出。但有关神经内分泌因子对奶牛产后干物质摄入减少及脂肪动员的调控 作用研究的不多。 本研究利用动物饲养实验和荧光r t - p c r 方法，观测了不同能量摄入水 平对奶牛产后干物质摄入量、血液生化指标、脂肪组织l e p t i n m r n a 、脂肪 动员关键酶( h s l ) m r n a 表达的影响及其相互关系，探讨了围产期健康奶牛 干物质摄入减少与脂肪动员的神经内分泌调控机理，为纠正和缓解能量负平 衡防治奶牛围产期能量代谢障碍性疾病提供实验和理论依据。 动物饲养实验，选用产奶量大于5 0 0 0 k g ，荷斯坦奶牛3 0 头，随机分为 3 个组，分别于产前2 8 天开始饲喂中国奶牛饲养标准日粮( 对照组) 、标准 饲养增加2 0 日粮( 高能组) 和标准饲养减少2 0 日粮( 低能组) ，产后各组奶 牛均饲喂同一标准日粮，至产后5 6 天结束。实验期间定期采血和脂肪活体 采样，分别测定奶牛的干物质摄入量，血液中葡萄糖( g l u ) 、酮体、n e f a 等生化指标及l e p t i n 、n p y 、i n s 和g h 等激素指标，同时测定奶牛的生产性 能。实验结果表明：围产期健康奶牛不同能量摄入水平显著影响产后干物质 摄入量和泌乳性能。产前奶牛低能饲喂明显提高产后干物质摄入量和泌乳性 能，提高了血液l e p t i n 和n p y 浓度，奶牛产后食欲的恢复快、干物质采食 量大且上升幅度也快，可提前达到干物质采食高峰，且于物质采食高峰持续 时间长，从而缓解分娩后机体能量负平衡，改善奶牛的体况：产前奶牛高能 饲喂，降低了血液l e p t i n 和n p y 浓度，奶牛产后食欲恢复慢，干物质采食 量少且上升幅度也慢，干物质采食高峰延迟，加重机体能量负平衡，奶牛的 体况下降。与对照组相比，产前低能饲喂奶牛产后干物质摄入量提高3 7 ，产奶量提高4 8 ；而产前高能饲喂奶牛产后干物质摄入减少1 2 1 7 ，产奶量降低l o 1 8 。此外，产前奶牛低能饲喂提高了奶牛产后血 液g l u 浓度，降低了产后血液t g 、酮体、n e f a 和i n s 的浓度：高能饲喂 中文摘要 降低了产后奶牛血液g l u 浓度，提高了产后血液t g 、酮体、n e f a 和i n s 的浓度。进一步证实产前高能饲喂加重奶牛产后能量负平衡，加剧脂动员， 有可能促进产后酮病、脂肪肝等围产期能量代谢障碍性疾病的发生。通过荧 光r t p c r 法测定脂肪组织l e p t i nm r n a 及h s lm r n a 表达水平，观测到血 液l e p t i n 浓度与脂肪组织中l e p t i nm r n a 表达量相关。血液l e p t i n 浓度高， 脂肪组织h s lm r n a 表达水平却低，可见l e p t i n 能通过某种作用途径抑制脂 肪组织h s l m r n a 表达水平，从而降低了h s l m r n a 表达量，减少机体脂肪动员。 综上所述，围产期健康奶牛不同能量摄入水平显著影响产后奶牛干物质 摄入量。产前高能饲喂奶牛产后干物质摄入量明显减少，加重了奶牛产后能 量负平衡，有可能促进酮病、脂肪肝等围产期能量代谢障碍性疾病的发生。 产前奶牛高能饲喂产后干物质摄入量明显减少，可能与神经肽y ( n p y ) 的合 成与释放减少有关。血液l p 浓度与干物质摄入量没有相关性。 关键词：奶牛；干物质：脂肪动员：神经内分泌调控 沈阳农业大学硕士学位论文 刖茜 脂肪细胞激素在能量代谢调节中的调节作用 脂肪细胞内分泌功能的发现是近年内分泌学领域的重大进展之一。它彻 底改变了过去把脂肪组织看作只是被动的燃料贮存库或组织器官间的充填 料的传统观念。现在承认，脂肪组织是一个具有复杂的内分泌及代谢作用， 功能十分活跃的器官( 李秀钧，2 0 0 2 ) 。 脂肪细胞具有多种内分泌、邻分泌及自分泌功能现已发现人脂肪细胞分 泌几十种脂肪细胞因子( a d i p o c y t o k i n e s ) 及蛋白质因子，对全身各器官系统， 其中包括脂肪组织本身有重要调节功能，许多因子的生理功能尚不清楚，而 且新的调节因子还在不断的被发现之中。其中，已广为人知的如肿瘤坏死因 子( t n f ) 一a 、纤溶酶原激活物抑制物( p a j ) 一1 、白介素( i l ) 一6 、i l 一8 ； 血管紧张素原、肥胖基因表达产物l p ，视黄醇结合蛋白质( r b p ) 、雌激素、 胰岛素样生长因子( i g f ) i 、i g f 结合蛋自3 ( i g f b p 3 ) ，脂联素( a d i p o n e c t i n ) 以及新近发现的抵抗素( r e s i s t i n ) 等。此外，还有些因子在脂肪细胞表达。 例如p p a r - s 及解偶联蛋白家系( u c p l 5 ) ，也有重要的生理功能。本文主 要对近年来新发现的与能量平衡有关的脂肪细胞激素加以综述。 一、瘦素( l e p t i n ，l p ) 在众多脂肪细胞激素中以瘦素研究最为深入，脂肪细胞内存在一种o b 基因，能表达分泌一种激素蛋白称为瘦素( l e p t i n ，l p ) ( z h a n gy 等，1 9 9 4 ) ， 它对下丘脑摄食中枢具有有效的调节作用，通过减少摄食，加强能量消耗， 使能量储存减少，小鼠的o b 基因有3 个外显子和2 个内含子，编码 4 5 k b m r n a ，o b 基因在白色脂肪组织( n a t ) 内呈强表达：在棕色脂肪组织( b a t ) 内呈弱表达，人的l pm r n a 氨基酸序列中有8 4 与小鼠的同源，脂肪细胞分 泌的l p 为一1 6k d 的分泌蛋白，l p 的分泌有昼夜节律性，呈脉冲式分泌， 分泌水平在夜间最高。血清中存在l p 运转蛋白，可与脂肪细胞分泌的l p 结 合，在生理状态下l p 作为脂肪组织储能的一种信息，血内l p 水平与脂肪储 量成正比，通过它反馈给下丘脑摄食中枢，调节下丘脑神经元神经肽 y ( n e u r o p e p t i d e y ，n p y ) 的合成分泌。n p y 是由3 6 个氨基酸组成，结构与多 肽y y ( p o l y p e p t i d ew ) 相似( n i e u w e n h u i z e na g 等，1 9 9 4 ) 属同类肽家族， 它首先转录表达为9 7 个氨基酸的n p y 前体，储存于神经纤维囊泡内，释放 时经酶解分解为第2 6 6 4 位氨基酸的n p y 活性肽。许多肥胖动物有贪食伴 n p y 活性增高。下丘脑弓状核合成、分泌n p y 增加。动物实验中将n p y 输注 前言 到下丘脑腹正中核( v m h ) ，可引起动物大量进食和肥胖( s t e p h e n st w 等， 1 9 9 5 ) 。n p y 除影响摄食行为外，还抑制交感神经活性，使棕色脂肪组织产 热减少，增加能量储存( e g a w am 等，1 9 9 1 ) 。随着能量储存增加，脂肪量 增加，血清中游离l p 水平亦升高。通过对下丘脑负反馈调节，抑制n p y 表 达，实现能量平衡调节作用，称脂肪细胞一下丘脑轴。 l p 除柳制能量摄入外，同时亦加强能耗，l p 通过兴奋交感神经，使棕 色脂肪细胞内1 3 ，肾上腺能受体活性增加，使产热增加，能耗增加，体重减 轻( h i m i n s h a g e nj ，1 9 9 5 ) 。已知胰岛素是能量储存激素，l p 可抑制胰岛 b 细胞对葡萄糖刺激的胰岛素分泌，并使脂肪合成减少。一些产生胰岛素 的细胞0 n s 1 、h i t 、b t c s 细胞株) 与胰高血糖素的细胞0 n r 、g 9 细胞株) 均被证明有l p 受体表达，体外实验表明l p 可抑制分离的大鼠胰岛的胰岛 素分泌，而不抑制簇高盘糖素分泌( h a y e sa 等，1 9 9 7 ) 。脂肪细胞与胰岛的 双向调节中，胰岛素对脂肪细胞的影响是刺激脂肪细胞l p 基因的表达，使 l p 生成增加，呈正性反馈调节。总之，脂肪细胞胰岛轴之间通过l p 和胰 岛素相互反馈性调节，使能量代谢中的脂代谢和糖代谢达到动态平衡。 二、肿瘤坏死因子( t n f - 0 ) 近年来研究证明t n f a 是一种多功能细胞激素，它对不同组织有不同 的生物学作用，除了它有肿瘤溶解活性，参与炎症和免疫过程外，它在肥 胖关联的胰岛素抵抗中起重要作用，在实验动物研究中发现肥胖的小鼠和 大鼠的脂肪细胞中有t n f q 的过度表达( h o t a m is 1 i g i lg s 等，1 9 9 3 ) 。t n f n 通过自分泌旁分泌在组织局部调节脂肪细胞能量代谢。t n f n 通过 t n - f r 介导，在胰岛素信号偶联传递的磷脂酰肌醇r p i ) 一3 激酶水平上抑制胰 岛素受体底物( i r s ) - l 的酪氨酸磷酸化，与此平行，同时抑制胰岛素引起的 葡萄糖运转摄取，干扰葡萄糖代谢，由此引起脂肪细胞的胰岛素抵抗和葡 萄糖利用减少。有报道( h o t a m l s l i g l lg s 等，1 9 9 4 ) t n f 一可使脂肪细胞 内胰岛素激发的胰岛素受体自身磷酸化作用下降2 0 , - - 5 0 ，i r s l 的酪氨 酸磷酸化效应下降更明显。另有报道体外研究应用人脂肪细胞与5 n m o l l t n f q 预孵育l5r a i n ，结果胰岛素作用较对照组减少6 0 一7 0 ，在较长时 阀孵育后，达到稳定的抑制( 4 0 ) ，1 n f a 对胰岛素的这种急性掷制作用是 由p 8 0t n f 受体( t n f r 2 ) 介导的。目前已知t n f a 的细胞作用是由两种不 同受体介导的，即t n f r i ( 啮齿类中为p 5 5 ，人类为p 6 0 ) 和t n f e z ( 啮齿 类中为p 7 5 ，人类为p 8 0 ) ，这两种受体的细胞外区肽键的序列结构相同， 而细胞内区完全不同( v e n d e n a b e e l ep 等，1 9 9 5 ) ，表明不同的信号途径发 沈阳农业大学硕士学位论文 挥不同的功能。在肥胖胰岛素抵抗小鼠的脂肪组织中，监测到p 7 5 t n f r ( t n f r 2 ) 表达增加5 倍，表明t n f r 在介导肥胖相关联的胰岛素抵抗 中起重要作用。最近研究表明神经鞘磷脂酶( s p h i n g o m y e l i n a s e ) 途径的激活， 导致i r s 1 胰岛素刺激酪氨酸磷酸化的抑制( p e r a l d i p 等，1 9 9 6 ) ，t n f a 在抑制胰岛素作用同时，诱导脂肪细胞脂解增加，使游离脂肪酸( f f a ) 水平 增高，f f a 对胰岛素有抑制作用( k e r np a 等，1 9 9 5 ) 。特别是腹内脂肪分解 增加，f f a 大量进入肝内，抑制肝内胰岛素与靶细胞的结合降解，使胰岛 素摄取减少，f f a 在肝内氧化增加，减少了肝内葡萄糖的氧化利用导致肝 糖输出增加和外周高胰岛素血症。此外，动物实验还观察到t n f a 可引起 应激激素如糖皮质素、肾上腺素水平等升高，间接地导致胰岛素抵抗，因 此，t n f c l 在肥胖者胰岛素抵抗中起重要作用。有作者把它看作一种肥胖 遗传易感的候选基因产物。 三、脂联素( a d i p o n e c t i n ，a d p n ) 脂联素( a d i p o n e c t i n ，a d p n ) 亦称a c r p3 0 、a p m l 、a d i p o q 及6 b p2 8 ，最 早由s c h e r e r 等发现，是一种脂肪组织分泌的血浆蛋白质，分子质量为2 8k u ， 由2 4 7 个氨基酸组成，包含一个氨基端的信号肽，一个小的非螺旋区，一段2 2 个胶原重复序列的延伸和一个羧基端的球状结构域( s c h e r e rp e 等1 9 9 5 ： h o tt ak 等，2 0 0 1 ) 。它是可溶性防御性胶原家族的一个成员，与vi 型 胶原、x 型胶原、补体c l q 及肿瘤坏死因子( t n f ) 一n 具有高度的结构同源 性( y o k ot at 等，2 0 0 0 ) 。a d p n 是脂肪组织基因表达最丰富的蛋白质产物之 一，其血浆浓度为5 3 0m g l ，约占总血浆蛋白的1 0 。正常人中血浆a d p n 浓度女性高于男性，进食后升高的胰岛素水平对其无急性效应( h o t t ak ，等 2 0 0 0 ) 。 脂联素是脂肪细胞特异分泌的具有胰岛素增敏作用及抗炎、抗动脉硬化 作用的脂肪因子，在能量代谢的调节及联系脂肪组织与血管炎症中起重要作 用。 人体实验己证实，脂联素与机体胰岛素敏感性之间存在很强的相关性：胰 岛素抵抗程度越高，脂联素血浆水平越低：反过来，脂联素水平升高可明显改 善胰岛素抵抗。值得注意的是，高胰岛素血症不能等同于低脂联素血症。在 具有明显胰岛素抵抗的个体中，由于内脏脂肪细胞脂肪分解作用加强，使血 浆f f a 升高，尤其是流经肝门的f f a 增加，导致肝脏对胰岛素的清除延迟及 脂质的合成增加，从而使外周出现高胰岛素血症和高脂血症。肝内过多的f f a 通过抑制胰岛素对糖原分解的抑制作用，直接刺激糖原分解和糖异生，导致 前言 肝胰岛素抵抗。上述结果导致高胰岛素血症、低脂联素血症、血浆f f a 升高、 血糖升高、l d l 升高、h d l 降低和肌肉及肝细胞内脂质堆积，从而进一步加 剧胰岛素抵抗。人为地增加血浆脂联素能提高胰岛素敏感性、改善胰岛素抵 抗及伴随的血浆、组织中糖脂代谢紊乱。脂联素对糖脂代谢调节的功能可能 是通过多组织、多靶点的作用来实现的，其中对机体胰岛素的增敏是通过靶 器官肝和肌肉而起作用的。最近在人体实验中证实，脂联素通过加强胰岛素 介导的胰岛素受体酪氨酸磷酸化，从而激活i r s 2 1 介导的p 1 2 3 k 途径，使肌肉 组织中糖摄取增加：通过激活a m p k 途径，加强脂肪去路途径中各种转运体及 酶的基因表达，使肌肉组织对脂质的摄取及b e t a 氧化作用加强，从而降低外 周组织中脂质浓度，进而使通过肝门的f f a 及甘油三酯( t g ) 含量也相应降 低，使肝脏对胰岛素的敏感性提高：此外，脂联素还通过下调糖异生的关键酶 一烯醇式丙酮酸羧激酶( p e p c k ) 和葡萄糖六磷酸酶( g 6 p a s e ) 协同加强胰岛 素对肝糖异生的抑制，使肝糖输出减少以达到改善胰岛素抵抗的目的( y a m a u c h it 等2 0 0 2 。) 。 a d p n 与t n f - d 均分泌自脂肪细胞并具有结构同源性，二者生理水平及功 能却存在明显不同。a d p n 抑带r j t n fa 在脂肪细胞中的合成，而t n fq 则阻碍 a d p n 在脂肪细胞中表达( k e r np a 等2 0 0 3 ) ：t n f d 刺激核因子( n f ) 一kb 在主动脉内皮细胞的信号传导，导致黏附分子表达增强，而a d p n 抑制此过程 ( o u c h in 等，2 0 0 0 ) ：t n fa 浓度升高且能促进i r 和糖尿病，而a d p n 可减弱 脂肪细胞中t n fn 的信号传导并防止i r 的进展。此两种结构相似的蛋白具有 相反的功能，这种微妙平衡的破坏可能导致肥胖相关疾病的易感性。在肥胖 个体中t n fa 水平的增高可进一步抑制脂肪细胞分泌a d p n ，同时血浆a d p n 水 平的降低会使t n fo 引起的i r 进一步恶化。在i r 时，a d p n 的分泌会进一步 减少，这种恶性循环存在于i r 状态。在正常血糖胰岛素钳夹实验中，c o m b s 等将纯化的重组a d p n 注入清醒小鼠后发现，在生理性高胰岛素血症存在下 此治疗将循环a d p n 水平升高约两倍并刺激了葡萄糖的代谢。葡萄糖合成降 低6 5 完全可以说明a d p n 对胰岛素功能的效应( c o m b st p 等，2 0 0 1 ) 。与载 体相比，注入a d p n 后糖异生酶( 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶p e p c k 和葡萄糖一6 一磷酸酶) m r n a 的肝脏表达降低了5 0 以上，而a d p n 未影响葡萄糖吸收、 糖酵解及糖原合成速度。这表明循环a d p n 水平的快速升高可降低糖异生而 不影响外周葡萄糖摄取，故抑制糖异生是a d p n 快速降低血糖浓度的主要机 制，糖异生酶可作为a d p n 潜在的分子靶。在胰岛素敏感性改变的小鼠模型中 a d p n 表达的降低与i r 相关( o u c h in 等，2 0 0 0 ) 。在肥胖小鼠中肌肉和肝脏 6 沈阳农业大学硕士学位论文 的a d p n 通过降低t g 的浓度来减轻i r 。这一效应是由于肌肉内有关脂肪酸 燃烧和能量逸散的分子表达的增加造成。 四、抵抗素( r e s i s t i n ) 抵抗素是一种新的脂肪细胞素。抵抗素属于富含半胱氨酸的分泌型蛋白 质抵抗素样分子( r e s i s t i n 2 1 i k e m o l e c u l e s ，r e l m s ) 家族中的一员，又称在 炎症区域发现的分子三( f o u n di ni n f l a m m a t o r yz o n ef a m i i y ，f i z z 3 ) 。另 外两个成员是f i z z l p r e l m 2n 和f i z z 2 p r e l m 2b 。现在己证明人类和鼠都存在 这些成员( s t e p p a nc m 等，2 0 0 1 ) 。已发现一个与抵抗素高度相关的序列标 签，其氨基酸序列包括n 末端的信号序列和严格保守的半胱氨酸残基。人类 抵抗素由1 0 8 个氨基酸残基组成，分子量为1 2 5 k d 。基因编码区位于1 9 号染 色体的一个克隆片段( k i mk h 等j ，2 0 0 1 ) 。抵抗素通过n 末端的半胱氨酸形 成的二硫键构成二聚体，它可以分解为单体。蛋白交联分析表明，抵抗素可能 还以二聚体作为亚单位，形成了多聚体( c h e r tj ，等2 0 0 2 ) 。 利用实时p c r 技术分析人类与鼠的抵抗素基因片段，发现具有高度同源 性( 李秀钧，2 0 0 2 ) 。它们的氨基酸序列有5 9 的一致性，m r n a 有6 4 4 的 序列一致性，但是，基因组序列仅仅有4 6 7 的一致性，而鼠比人的约大3 倍。人和鼠抵抗素内含子具有高度保守性，鼠的抵抗素37 末端有一个非常 大的内含子，可能具有不同基因表达的调节作用( g h o s hs 等，2 0 0 3 ) 。 s t e p p a n 等以c 5 7 b i 6 j 鼠为研究对象，让鼠饥饿一整夜。在禁食的初期 和末期，分别将1 6 51 - 1g s j 基因重组抵抗素注入鼠的腹膜内。于第二次注射2h 后测定糖耐量，发现血糖峰值增加7 2 8 ，胰岛素水平也升高( s t e p p a nc m ， 等2 0 0 1 ) 。虽然这种增加并无显著的统计学意义，但表明了糖不耐受不是由 于胰岛细胞分泌胰岛素功能的衰竭，而是因为发生了胰岛素抵抗的缘故。他 们还以饮食引起的肥胖鼠为对象，分别给予抗抵抗素抗体和非特异性的免疫 球蛋白，结果发现，抗抵抗素抗体组的血糖明显降低，而对照组则无明显变化 认为血糖的降低可能与胰岛素敏感性增强有关。当体外培养的3 t 3 2 l i 脂肪细 胞加入纯化重组的抵抗素以后发现，由胰岛素刺激引起的葡萄糖摄取减少了 3 7 ，而当加入抗抵抗素抗体却产生了相反的效果，这说明抵抗素在肥胖伴有 胰岛素抵抗和糖尿病的发病机制中发挥一种潜在的作用。然而。上述观察是 有限的，尚不能阐明抵抗素与他们之间的作用机制。在很多实验性肥胖症的 动物模型中，脂肪组织的抵抗素m r n a 和蛋白质表达受到显著抑制。最近研究 发现，同对照的瘦鼠相比，实验性肥胖鼠的血清蛋白质水平明显降低，这与脂 肪组织的抵抗素m r n a 和蛋白质水平相一致。通过对瘦鼠、肥胖鼠和缺乏过 前言 氧化物酶a 蛋白受体( p p a r ) 2a 鼠脂肪组织分离的r n a 分析发现，肥胖动物 抵抗素的基础表达被抑制。但是，在不同的鼠株及不同类型的脂肪组织中，抑 制程度有显著的差异。抗糖尿病药物t z d s 诱导了瘦鼠的抵抗素表达，而对肥 胖鼠的影响作用较小( f u k u iy ，2 0 0 2 ) 。f u j i t a 等研究甲福明对鼠脂肪组织 抵抗素表达的影响，结果发现甲福明组鼠的抵抗素蛋白质表达增加了6 6 ( f u j i t a h 等，2 0 0 2 ) 。f a s s h a u e r 等发现肿瘤坏死因子( t n f ) 2 作用于3 t 3 2 l 1 脂 肪细胞，抵抗素m r n a 的表达和蛋白质分泌被抑制了7 0 9 0 ( f a s s h a u e rm 等，2 0 0 1 ) 。此外，t n f 2q 撤除2 4h 后，抵抗素m r n a 的水平才能完全恢复到 原来的水平，这说明t n f 2o 导致胰岛素抵抗，却负调节抵抗素的表达和分泌。 这些实验结果是复杂的，而且抵抗素的表达模式也是不一致的。抵抗素并非 是肥胖与胰岛素抵抗的关键，这并不是说抵抗素在胰岛素抵抗中不起作用。 首先，循环水平的生物活性肽和它的作用效果之间的联系并非总是呈线性相 关的。抵抗素的受体系统、它们的信号及敏感状态仍是未知的。其次，胰岛 素抵抗并非必须与肥胖相联系。在不同的生物背景下或在无严重肥胖的条件 下，抵抗素和相关蛋白的影响可能是重要的( h o t a m i s l i g i16 s ，2 0 0 3 ) 。这 些矛盾的结论说明，我们还需做进一步的研究来阐明抵抗素的生物学效应。 除上述脂肪细胞激素与细胞因子对能量代谢调节有主要的影响外，其他 激素如肾上腺皮质激素、甲状腺素、胰高血糖素、生长激素等对能量代谢均 有重要的调节作用。除脂肪组织外，肝脏对物质代谢和能量调节也有重要的 作用，总之它们对能量调节可能都有或多或少直接或间接的作用，通过对能 量调控机制的深入了解，查明脂肪积聚和脂肪动员的遗传背景和环境因素， 将有利于防治能量平衡性代谢病。 沈阳农业大学颈士学位论文 实验一不同能量摄入水平对围产期奶牛干物质 摄入、生产性能及脂肪动员的影响 国外学者将奶牛由妊娠后期( 产前2 3 周) 转变为泌乳初期( 产后2 3 周) 这一阶段称之为过渡期( g r u 嘞e r ，1 9 9 5 ，g o f f 等，1 9 9 7 ) ，以往称为围产 期。围产期对奶牛的健康和生产性能极为重要，围产期奶牛能量代谢特点 是：干物质摄入减少而需求增加所致的能量负平衡，干物质摄入减少所致能 量负平衡是围产期奶牛能量代谢障碍性疾病( 酮病和脂肪肝) 发生发展的 主要环节。许多因素可引起围产期奶牛干物质摄入减少。以往认为妊娠后 期干物质摄入减少是由于胎儿增大和腹腔脂肪蓄积机械性压迫瘤胃，使瘤 胃容积变小所致。但产后之初干物质摄入并未因胎儿的出生，瘤胃机械性 压迫的自发解除而增加，表明瘤胃机械性压迫不是引起围产期奶牛干物质 摄入减少的主要原因。据报道，干奶期奶牛高能饲养，导致产后奶牛干物 质采食量减少( t h e e r ar u k k w a m s u k 等1 9 9 8 ：k l i n g v a r t s e n 等，2 0 0 0 ) ； 而l d o e p e l 等的报道与其相反( l d o e p e l 等，2 0 0 2 ) ，奶牛产前饲喂高能日 粮比饲喂低能日粮在产后的干物质摄入量要多。 本实验以围产期荷斯坦奶牛为试验对象，观测不同能量摄入水平对产后 干物质摄入量、生产性能及脂肪动员的影响，探讨奶牛围产期d m i 减少的 原因，为有效纠正和缓解奶牛能量负平衡性疾病的发生机理提供理论依据。 一、材料与方法 ( 一) 供试奶牛的选择、分组、饲养管理 选用年龄、胎次相近( 3 5 胎，5 8 岁) ，3 0 5 d 的产奶量大于5 0 0 0 k g ， 经临床检查健康的围产期荷斯坦奶牛3 0 头，集中于一个双式牛舍中。将体 重、年龄相接近的奶牛分别随机分为i 、i i 、i i i 三组( 每组1 0 头) ，单槽饲 养，统一管理，预饲一周后进入试验。试验期从预产前第2 8 d 产后5 6 d 结 束，各组奶牛均饲喂按中国奶牛饲养标准2 0 0 0 ( 以下简称标准) 配制的日 粮。日粮配制及营养组成( 见表1 1 ) 。 分娩前奶牛的干物质摄入量为1 4 k g d ；i 、i i 、i i i 组每千克日粮中的奶牛 能量单位分别为1 7 9 、1 9 9 、1 6 5 。分娩后各组奶牛精料饲喂量依产奶情况 供给( 即按每产3 k g 奶，在维持日粮基础上增加l 虹精料) ，自由摄食干草。 整个试验期间每日分别在早上6 ：0 0 、中午1 2 ：0 0 和晚上7 ：0 0 添料饲喂，先饲 喂干草和玉米青贮，后饲喂混合精料。 9 实验一不同能量摄入水平对围产期奶牛干物质摄入、生产性能及脂肪动员的影响 日粮营养物质含量： 奶牛能量单位( n n d k g ) 17 919 9 i6 51 3 5 租蛋白质( c p ) 93 9 1 0 6 0 86 51 26 0 粗纤维( c e ) 2 36 9 2 1 4 42 66 11 98 0 钙( c t ) 0 4 0 0 4 5o3 8o6 0 磷( e ) o3 8 0 4 10 3 60 4 4 1 0 沈阳农业大学硕士学位论文 ( 二) 主要仪器设备 高速台式离心机、高速冷冻离心机、一7 0 ( 2 超低温冰箱、s y n c h r o n c x 9s y s t e m sa l xm a d ei nu s a ( 美国b e c k m a nc o u l t e r 公司的全 自动生化分析仪) ， b e c k m a n t j 一6 ( 离心机) ，液氮罐，保温瓶，试管。 ( 三) 样品的采集、处理与检测 1 干物质采食量的采集称量每头牛每天饲料消耗量，分别计算各组产后 每周的平均日饲料消耗量，并计算出干物质摄入量。 2 称重奶牛干预产期前的第2 8 d ，第1 4 d ：产后的第l d ，第2 8 d 、第5 6 d 的早上空腹称重。 3 循环血液样品的采集分别于预产期前第2 8 d 、第1 4 d ，产后第1 d 、第 1 4 d ，第2 8 d 、第5 6 d 的上午( 8 ：0 0 8 ：3 0 ) ，颈静脉采取血样三份：肝素 抗凝( 2 0 u 肝素m l 血液) 血2 0 m l ，迅速分离血浆，7 0 c 下保存待测； 含4 0 u 1 1 0 e d t a 二钠和4 0 1 1 1 抑肽酶的抗凝血3 m l ，4 。c 3 0 0 0 r r a i n 离心5 分 钟，分离血浆，7 0 。c 下保存待测；取血2 0 m l ，即刻3 0 0 0r p m 离心l o m i n ， 制备血清，- 2 0 保存待测。 4 产奶量的测定称量并记录日产奶量，计算每周各组的平均日产奶量。 5 主要检测指标与方法见表卜2 生化指标由解放军2 0 8 医院检验科测定。 表卜2 循环血液样品检测指标与方法 t a b l e l - 2e x a m i n a t i o ni n d e xa n dm e t h o df o rb l o o ds a m p l e 检测指标检测方法 襄百丽面万丽雨丽面面酉一 毳 酮体改良水杨醛法 柰 游离脂肪酸( n e f a )比色法 ( 四) 数据处理使用s p s s 软件对数据进行统计分析。奶牛组有1 头奶 牛在产前一周因患脂肪肝死亡；还有l 头奶牛患乳热症，后来转变为母牛卧 地不起综合症而淘汰：i 组、i i i 组各有2 头奶牛产期提前了2 周，因此最终 统计数据不包括这些奶牛，各组均保留8 头奶牛。 实验一不同能量摄入水平对围产期奶牛干物质摄入、生产性能及脂肪动员的影响 二、结果 ( 一) 不同能量摄入水平对奶牛产后干物质摄入量的影响结果见表卜3 。 从表1 3 可见，i i 组奶牛的每周日平均d m i 极显著低于i 、i i i 组( p 0 0 1 ) ： i 组在产后第6 周极显著高于i 组( p 0 叭) ，产后3 5 周显著高于i 组 ( p 0 0 5 ) 。与i 组相比，i i 组奶牛产后1 8 周的每周日平均d m l 分别减少 1 7 、1 6 、1 2 、1 5 、1 7 、1 3 、1 4 、1 4 ；i i i 组分别增加3 、6 、 4 、4 、4 、7 、7 、6 。 表1 3 试验各组奶牛产后干物质摄入量单位：k 2 t a b l ei - 3d r ym a t t e ri n t a k eo f p o s t p a r t u md a i r yg o w s ( n = 8 ，x s d ) 注：同行角码大写字母不同者表示差异极显著( p o0 1 ) 小写字母币同者表示差异显著( p 0 0 5 ) 以下表同。 ( 二) 不同能量水平对奶牛产后生产性能的影响 1 不同能量摄入水平对奶牛产奶量的影响见表卜4 从表1 4 可见，各组奶牛产后前5 周的产奶量呈逐渐上升趋势，之后相 对稳定并略有下降趋势。i i 组奶牛产后的产奶量一直极显著低于i 、i i i 组； 而i i i 组奶牛产后第2 、3 、4 、6 周( 或1 、5 、6 、7 、8 周) 的产奶量极显著 ( p 0 0 1 ) 或显著( p 0 0 5 ) 高于i 组。与i 组相比，组奶牛的产奶量分别 提高6 、6 、8 、6 、4 、7 、6 、6 ；i i 组分别减少1 8 、2 1 、 1 7 、1 2 、1 2 、1 3 、1 0 、1 1 。 2 不同能量摄入水平对奶牛体重的影响结果见表卜5 表1 5 结果可见，奶牛干奶期的体重增加间组差异极显著( p 0 0 1 ) ，以 沈阳农业大学硕士学位论文 i i 组体重增加最明显，i i i 组增加最小。在分娩后第2 8 d 时，奶牛的体重丢失 组间差异极显著( p o 0 1 ) ，以i i 组体重丢失最明显，i i i 组体重丢失最小。 在分娩后第5 6 d 时，i i i 组和i 组奶体重已恢复并开始出现正增长，i 组奶牛 体重增长极显著高于i 组( p 0 0 1 ) ，而i i 组还处于失重状态。 表1 4 试验各组奶牛产奶量的统计结果 单位：i 0 0 5 ) 。 各试验奶牛血糖产前下降，临产及产后逐渐上升( 见表4 ) 。其中i 组于分娩前 降至低谷，4 周后显著升高( p 0 0 5 ) ；i i 组产前第4 周开始显著下降( p o 0 5 ) ， 产前2 周降至低谷，产后2 周开始显著上升( p o 0 5 ) ；i i i 组产前第2 周稍 有下降后上升，4 周后的血糖显著升高( p 0 0 5 ) 。在试验期内i i 组奶牛血糖 实验一不同能量摄入水平对围产期奶牛干物质摄入、生产性能及脂肪动员的影响 的波动最大( 1 6 9 - 4 0 2 m m o l l ，n = 8 ) ；i 组次之( 1 9 8 3 8 4r e t o o l 1 ，n = 8 ) ： 组最小( 2 1 0 3 8 1 m m o l l ，n = 8 ) 。 酮体和n e f a ：各试验各组奶牛酮体产前至产后2 周内均逐渐上升，2 周 后又都均逐渐下降；n e f a 产前至产后1 周内均逐渐上升，之后至产后2 周 内均显著上升，2 周后又都均显著下降，4 周后又都均逐渐下降。试验期间 组问相比产前i i 组无论酮体还是n e f a 始终最低，而产后却最高；试验期间 i i i 组产前酮体和n e f a 最高，产后最低。经统计分析表明：产前至产后1 天饲喂不同能量水平日粮的围产期奶牛血浆酮体差异不显著，产后2 周至4 周酮体i i 组与i 、i i i 组间差异显著( p 0 0 5 ) ，而i 组和i i i 组之间差异不显 著，产后5 6 d 时各组之间差异不显著：产前至产后1 天试验各组奶牛血浆 n e f a 差异均不显著，产后l 天至产后4 周i i 组与i 、i i i 组间存在极显著差异 ( d o 0 5 ) ，但高能饲养奶牛的血糖低于对 照组和低能饲养组。这表明不论高能饲养，还是低能饲养奶牛均能够通过机 体的调节使血糖处在正常范围内，但高能饲养的奶牛有低血糖的倾向。 奶牛在分娩前后对能量的需要增加，使得机体血糖下降，这就需要动员 脂肪来补充机体对能量的需要。这必然导致血液中酮体及n e f a 含量的升高。 本实验结果表明，实验各组奶牛产后血液中酮体及n e f a 浓度逐渐升高 至产后2 w 到达高峰后又都均逐渐下降。这说明实验各组奶牛在产后2 w 之 后能量负平衡有所缓解。高能饲养组产后1 wn e f a 浓度显著高于对照组和 低能组；产后2 w 酮体及n e f a 浓度显著高于对照组和低能组。可见高能饲 养组奶牛能量负平衡严重且脂肪动员多，肝脏的负担加重。 ( 四) 不同能量摄入水平与奶牛酮病，脂肪肝的关系 脂肪动员是围产期奶牛能量负平衡的必然结果。脂肪分解一方面弥补糖 异生作用降低所引起的能量亏欠：另一方面释放大量n e f a 进入血液及肝脏， 被动员的体脂中，2 0 被乳腺利用，其余大部分被肝脏吸收( 何剑斌等，1 9 9 7 ) 。 沈阳农业大学硕士学位论文 脂肪动员产生的n e f a 进入肝脏后，n e f a 首先在脂酰辅酶a 合成酶作用下活 化为脂酰辅酶a ，进一步代谢包括3 条途径。一是彻底氧化成c o ：，所产生的 能量被肝脏利用；二是部分氧化生成酮体，被肝外组织利用：三是再酯化形 成甘油三酯、磷酯或胆固醇酯，用于合成脂蛋白，转移到肝外组织利用。当 奶牛出现严重的能量负平衡时，导致游离脂肪酸产生太多太快；同时肝脏利 用游离脂肪酸的能力有限，导致过多的游离脂肪酸转化为酮体，或者合成三 酰甘油贮存积聚在肝实质细胞，形成脂肪肝。脂肪在肝脏蓄积也损害肝脏功 能，进一步降低游离脂肪酸进入三羧循环和参与脂蛋白的合成和分解，进而 导致更严重的酮症和脂肪肝，这样就造成酮病和脂肪肝的恶性循环，而酮体 在血液、乳汁、尿液中积聚，导致食欲减退或废绝，更加剧了能量负平衡( 熊 云龙1 9 9 6 ；陈代文2 0 0 2 ) 。 本实验结果表明：妊娠后期高能饲养产前体脂储备多，产后d m i 恢复缓 慢，血糖浓度低；机体能量负平衡严重，脂肪动员强，血液中酮体及n e f a 浓度高，肝脏负担加重，一旦脂肪动员产生的n e f a 超过了肝脏利用n e f a 的能力或由于其它疾病的影响使肝脏代谢功能下降，就容易发生酮病、脂肪 肝。通过本实验可以推断高能饲养的奶牛体脂储备多，当奶牛发生能量负平 衡时以脂肪动员来补充能量的亏欠，过多的动员脂肪造成了酮体浓度的升高 和肝脏脂肪的蓄积。低能饲养的奶牛体脂储备少，当发生能量负平衡时可用 于动员的脂肪组织少，主要依靠增加干物质摄入来补充能量。 四、小结 1 低能饲养产后食欲恢复快，采食量大、采食量的增长幅度大，能提前达 到采食高峰；而高能饲养产后食欲恢复慢，采食量小、采食量的增长幅度 小，采食高峰延迟。 2 低能饲养可以提高奶牛的产奶性能，促进奶牛产后体重的恢复。 3 高能饲养加重奶牛产后能量负平衡，易产生低血糖，脂肪动员增加，血 液中酮体及n e f a 浓度高。 4 奶牛产前的体脂储备可能是产后脂肪动员的重要因素。 窭墼二塞堕茎娄壅墨! 竺丝型塑生! ! 堕塑堡! ! 堕! ! ! ! 堂墨! 坠! ! 坠互鲨塑堡兰 实验二实时荧光定量p c r 检测奶牛脂肪组织 l e p t j nm r n a 及h s lm r n a 方法的建立 近年来，代谢信号( m e t a b o l i cs i g n a l s ) 对摄食调节及能量代谢调节成为一 个研究的热点。代谢信号包括营养素、代谢产物、生殖激素、应激激素、 瘦蛋白、胰岛素、胰岛素样生长因子i ( i n s u l i n 1 i k e g r o w t h f a c t o r i ，i g f i ) 胰高血糖素、肠肽、细胞因子和神经肽y 等，其中瘦蛋白、n p y 对摄食的 调节作用尤为突出。而脂肪动员最终是由h s l 催化完成的。因此，探明l e p t i n 与h s l 在围产期内表达的变化规律可为揭示以围产期奶牛能量负平衡为特 征的疾病的发病机制奠定实验基础。 人们曾运用s o u t h e r n 、n o r t h e r n 、狭孔印迹定量分析特异核酸序( c h e n g b ，1 9 9 5 ) ，近年来出现的实时荧光定量p c r ( r e a lt i m eq u a n t i t a t i v ep c r ) 技术实现了p c r 从定性到定量的飞跃，它具有特异性强、灵敏度高、重复性 好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点。 本实验采用t a q m a n 技术，根据g e n e b a n k 发表的牛h s l 、l p 的m r n a 序列， 设计了特异性的引物和探针，建立了准确，便捷检酒j h s l 、l p 表达的方法。 一材料与方法 ( 一) 材料 1 脂肪样品 尾根部手术采取脂肪样品，放入液氮保存。 2 工具酶与生化试剂 反转录酶( a m v ) 、d n t p 、r n a s e 抑制剂、t r i z o l 试剂、焦磷酸二乙 酯( d e p c ) 、d n a 凝胶回收试剂盒、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母抽提物、琼 脂等均为i n v i t r o g e n 、t a k a r a 、s i g m a 、n e b 、杭州维特洁生物公司产品。 3 主要仪器 a b ip r i s m 7 0 0 0 型荧光定量p c r 扩增仪( 美国a b i 公司) ；g e n e q u a n t 核酸浓度测定仪( 英国p h a r m a c i ab i o t e c h ，i t d 公司) ；p t g 1 0 0 m 常规p c 扩增仪：高速冷冻离心机m r l 8 2 2 型( 日本日立) ；高速台式离心机 ( t g l 1 6 g 上海安亭离心机厂) ；电泳仪d y - i i i 型( 北京六一仪器厂) ；紫 外透射反射分析仪w p 型( 永嘉上塘仪器厂) ；恒温水浴箱( 丹东市医疗器 械厂生产) 。 ( 二方法 1 脂肪组织总r n a 的提取 采用总r n a 提取试剂t r i z o l 提取脂肪组织的总r n a 。用于r n a 提取 的塑料器皿、耗材均经过d e p c ( 0 1 ) 处理，玻璃器皿于1 8 0 干烤8 小 沈阳农业大学硕士学位论文 时以上。其具体步骤如下 ( 1 ) 组织研磨：将脂肪组织块剪碎，直接放入研钵内，加入少量液氮， 迅速研磨，组织变软时，再添加少量液氮，继续研磨，直至研磨成粉末状： ( 2 ) 2 0 0 3 0 0m g 组织m lt r i z o l 加入t r i z o l 试剂，并将液体转移入离 心管中：室温静置1 0m i n ，使组织充分裂解： ( 3 ) 按2 0 0 p a 氯仿m lt d z o l 加入氯仿，温和振荡5m i n ，混匀，室温 静置3 0 m i n ，4 1 20 0 0 9 离心1 5 r a i n ： ( 4 ) 吸取上清水相，移入另一离心管中，置于冰上( 不能吸入脂肪层) ， 按0 5m l 异丙醇m lt r i z o l 加入异丙醇，混匀，室温放置5 1 0m i n ，4 c1 2 0 0 0 9 离心1 0 m i n ： ( 5 ) 弃上清，此时管底的沉淀物为r n a 。按l m l7 5 乙醇i l l lt r i z o l 加入7 5 乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，4 c80 0 0 9 离心5m i n ； ( 6 ) 尽量弃上清，室温晾干或真空干燥5 1 0m i n ，用5 0 p l 经d e p c 处理的去离予水溶解r n a ，5 5 “o 保温5 1 0r a i n ，而后放入一7 0 c 保存。 取5t t lr n a 用1 甲醛变性琼脂糖凝胶进行电泳检测，判断r n a 的完 整性。而后用d n a r n a c a l c u l a t o r 测定总r n a 浓度。 2 脂肪组织总r n a 的反转录 采用a m v 反转录酶，以提取