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2019/12/6,1,离心与分光光度技术,河南科技大学农学院,研究生课程,离心技术,离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质凝粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的分离分析技术。,2,2019/12/6,3,离心技术原理,离心机的构造与类型,离心的基本方法,离心机的使用,1,2,3,4,1.离心技术原理,随着生物化学、分子生物学和生物工程的发展，离心分离技术已在科研和生产中广泛应用。每个生物化学和分子生物学实验室都要装备多种型式的离心机。离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小、密度和形状等。,2019/12/6,4,离心技术原理,当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义，即：Fc=mG=mr2=mr(2N/60)2G粒子离心的加速度m沉降粒子的有效质量N转头每分钟转速(rpm),2019/12/6,南京农业大学生命科学学院,5,粒子旋转的角速度r粒子的旋转半径Fc离心力,离心技术原理,1.相对离心力（RCF）由于转头有不同的制造商制造，半径不同，故用相对离心力来表示离心力的大小。RCF(g)=Fc/F重力=mG/mg=r2/g=1.11910-5N2r=11.2r(N/1000)2也有：根据这个公式，相对离心力（RCF）和每分钟转数（N）之间便可以互换，这种互换关系是很有实用价值的。,2019/12/6,6,第一节离心技术原理,1.相对离心力（RCF）一般情况低速离心转速单位以rpm表示，高速离心则以重力加速度g表示。在计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与中心轴之间的距离，即离心半径r（cm）的长度。离心管所处的位置不同，沉降颗粒所承受的离心力也不同。因此，超速离心常用重力加速度的倍数（g或g）代替转速（rpm），这样可以真正反映颗粒在离心管中所受到的离心力。离心力的数据通常是指相对离心力的平均值，也就是指离心管中点的离心力。离心机的转速、相对离心力和半径三者之间的换算关系见下页图。,2019/12/6,7,2019/12/6,8,将离心机转数换算为相对离心力时，首先，在r标尺上取已知的半径和在N标尺上取已知的离心机转数。然后，将这两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。注意，若已知的转数值处于N标尺的右边，则应读取RCF标尺右边的数值；同样，转数值处于N标尺左边，则读取RCF标尺左边的数值。,离心技术原理,2.沉降速度v离心时，一定条件下，颗粒在介质中受力平衡，匀速运动。经计算则有：影响沉降速率的主要因素：颗粒直径d的大小；颗粒形状；颗粒与悬浮介质的密度差(p-m)；一定温度下悬浮介质的黏度系数；离心加速度G。在确定的条件下，沉降速率主要取决于离心机的转速。,2019/12/6,9,G,离心技术原理,3.沉降系数S沉降系数，表示单位离心力场下的沉降速率，即通过单位离心力场所需的时间，因此单位为秒。r1-t1：离心前粒子离旋转轴的距离及时间r2-t2：离心后粒子离旋转轴的距离及时间S在实际应用时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。,2019/12/6,10,3.沉降系数S沉降系数的作用：描述颗粒的大小。预计沉降时间。对已知S值的物质，可预计在离心管中的沉降所需时间。测定物质的分子量。根据Svedberg公式可计算出分子量M=RTS20,w/D20,w(1-V)R-气体常数，等于1.987卡/度.摩尔S20,w标准状况下粒子的沉降系数D20,w理想状态时粒子的扩散系数V微分比容，等于溶质粒子密度的倒数,2019/12/6,11,溶剂密度T热力学温度,2.离心机的构造与类型,离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。,2019/12/6,12,离心机的构造与类型,根据转速的高低把离心机分为三种：低速离心机；高速离心机；超速离心机。,2019/12/6,13,低速离心机：组成：转头、电动机转头带有放置离心管的孔转头的中央位于离心机的驱动轴上离心机的转速和温度控制不够准确一般最高转速在6,000rpm以下实验室中常用于分离制备。,高速离心机：增加温度控制系统（制冷系统）制冷设备温度控制在0-4范围内实际速度和温度可通过仪表或指针显示制动器配有一定类型及规格的转头最高转速在25,000rpm以下,2019/12/6,14,常用于生物大分子的分离制备，如用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器（如核蛋白体）或单个分子。,高速离心机：,2019/12/6,15,超速离心机：组成：驱动和速度控制温度控制真空系统转头增加真空系统，这是它与高速离心机的主要区别。常用于分离亚细胞器、病毒粒子、DNA、RNA和蛋白质分子。在分离时无须加入可能引起被分离物质结构改变的物质。,2019/12/6,16,离心机的构造与类型,据离心机的性能可分为：分析型，制备型和分析制备型。制备用超速离心机主要用于生物大分子、细胞器和病毒等的分离纯化。分析用超速离心机可用于样品纯度的检测、沉降系数和相对分子质最的测定。为此，分析用超速离心机一般都装有光学检测系统、自动记录仪和数据处理系统等。,2019/12/6,17,离心机的构造与类型,分析型离心机分析型离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系统，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程，从而确定其物理性质。主要特点就是：能在短时间内，用少量样品就可以得到一些重要信息，能够确定生物大分子是否存在，及其大致的含量，计算生物大分子的沉降系数，结合界面扩散估计分子大小，检测分子的不均一性及混合物中各组份的比例，测定生物大分子的分子量，还可以检测生物大分子的构象变化等。,2019/12/6,18,离心机的构造与类型,转头制备型超速离心机所采用的转头种类繁多，转头可分为：角式转头垂直转头水平转头区带转头连续流动转头,2019/12/6,19,离心机的构造与类型,角式转头离心管在离心机中放置的位置与旋转轴心形成一个固定的角度,角度变化在14-40之间。,2019/12/6,20,角式转头角式转头的特点：具有较大的容量，重心低，转速可较高，寿命较长。样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管的直径。,2019/12/6,21,“管壁效应”：有一定的角度,在离心过程中撞到离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀,此效应使最后在管底聚成的沉淀较紧密。在离心管的不同部位距旋转中心轴的距离也不同,那么在一定的转速下其RCF值也各不相同。,离心机的构造与类型,水平转头转头静止时,处在转头中的离心管中心线与旋转轴平行。转头旋转加速时,离心管中心线由行位置逐渐过渡到垂直位置,即与旋转轴成90角。粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本一致，有少量的“管壁效应”。,2019/12/6,22,水平转头转头水平转头的特点：转头的重心位置较高样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径对多成分样品分离特别有效常用于速率区带离心和等密度离心优点是有利于离心后由管内分层取出已分离的各样品带。缺点是颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。,2019/12/6,23,离心机的构造与类型,垂直转头：离心管垂直放置，样品颗粒沉降距离最短，离心所需时间短。适合用于密度梯度区带离心，离心结束后液面和样品区带要作90转向，因而降速要慢。离心管垂直插入转头孔内，在离心过程中始终与旋转轴平行，而离心时液层发生角的变化，从开始的水平方向改成垂直方向，当转头降速时，垂直分布的液层又逐渐趋向水平，待旋转停止后，液面又完全恢复成水平方向。,2019/12/6,24,离心机的构造与类型,区带转头：区带转头无离心管，主要由一个转头桶和可旋开顶盖组成。转头桶中装有十字型隔板装置，把桶内分隔成四个或多个扇形小室，隔板内有导管，梯度液或样品液从转头中央的进液管泵入，通过这些导管分布到转头四周，转头内的隔板可保持样品带和梯度介质的稳定。,2019/12/6,25,区带转头：区带转头特点：沉降的样品颗粒在区带转头中的沉降情况不同于角式和外摆式转头，在径向的散射离心力作用下，颗粒的沉降距离不变，因此区带转头的“壁效应”极小，可以避免区带和沉降颗粒的紊乱，分离效果好转速高，容量大，回收梯度容易和不影响分辨率的优点，使超离心用于制备和工业生产成为可能。缺点是样品和介质直接接触转头，耐腐蚀要求高，操作复杂。,2019/12/6,26,离心机的构造与类型,连续流转头：用于连续流离心，可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离，转头与区带转头类似，由转头桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离心时样品液由入口连续流入转头，在离心力作用下，悬浮颗粒沉降于转头桶壁，上清液由出口流出。适用于稀溶液、大体积样液离心，可减少开机时间，提高效率。也适用于在发酵工业化规模生产的细胞和培养液的分离，及不同生长周期细胞的分离。,2019/12/6,27,离心机的构造与类型,离心管主要用塑料，不锈钢和特种玻璃塑料离心管：优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏液。管盖有三种作用：防止样品外泄。防止样品挥发。支持离心管，防止离心管变形。,2019/12/6,28,离心的基本方法,离心分离是制备生物样品广泛应用的重要手段。如分离活体生物、细胞器、生物大分子、小分子聚合物等。对于生物样品的离心分离方法，主要是根据样品的不同来源和不同性质采取不同的离心方法。目前常用离心方法有：沉淀离心差速离心连续流离心等其它方法,2019/12/6,29,密度区带离心速率区带离心等密度区带离心,离心的基本方法,1.沉淀离心沉淀离心技术是目前应用最广的一种离心方法。一般是指选用一种离心速度，使悬浮溶液中的悬浮颗粒在离心力的作用下完全沉淀下来，这种离心方式称为沉降离心。,2019/12/6,30,根据颗粒大小来确定沉降所需要的离心力。主要适宜于细菌等微生物、细胞和细胞器等生物材料，及病毒和染色体DNA等的离心分离。沉降速度与离心力和颗粒大小有关，如右图：,离心的基本方法,2.差速离心差速离心法可以用来分离细胞，亚细胞结构或高分子。差速离心比较适用于差异比较明显的细胞或细胞器的分级分离，经过多次离心可以获得满意的效果。原理：利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。操作过程：一般是在离心后倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。,2019/12/6,31,2.差速离心差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。优点：操作简易，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点：须多次离心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯颗粒。沉淀于管底的颗粒受挤压，容易变性失活。效率低，费时。,2019/12/6,32,2019/12/6,33,差速离心法分离已破碎的细胞各组份,离心的基本方法,3.密度梯度离心密度梯度离心也称区带离心法。是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。其特点是离心管中液相介质密度是不均一的，自上而下密度逐渐增大，形成一定的梯度。密度梯度离心技术有两种方法：速率区带离心等密度梯度离心,2019/12/6,34,3.密度梯度离心经常使用的液相介质成分为甘油、蔗糖及某些盐类，如氯化钠、氯化艳溶液等。优点：（详见备注）分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点：离心时间较长；需要制备惰性梯度介质溶液；操作严格，不易掌握。,2019/12/6,35,离心的基本方法,3.1速率区带离心速率区带离心法是根据大小不同、形状不同的颗粒在梯度液中沉降速度不同建立起来的分离方法。离心前预先在离心管内装入密度梯度介质（如蔗糖、CsCl2），被分离物质的样品溶液位于梯度液的上面，在离心力的作用下样品中的各组分以不同的沉降速度沉降，当颗粒的沉降速度与某密度区域的浮力相等时，颗粒就停留在该密度区域内，使各组分达到分离的目的。此法特别适宜于样品性质相近，而颗粒的直径和形状不同的组分分离，如后页图所示。,2019/12/6,36,3.1速率区带离心快速获得满意的密度梯度离心效果，在密度梯度离心时必须注意两点：在制备梯度液时，必须考虑颗粒的质量密度必须大于任何位置的介质密度；,2019/12/6,37,必须控制好离心时间，要在所需样品到达管底之前停止离心。可分离与介质密度相当的细胞、细胞器、DNA和蛋白质。沉降受物质本身大小的影响较大，一般应用在物质大小相异而密度相同的情况。,离心的基本方法,3.2等密度梯度离心等密度离心法也叫沉降平衡法。所谓等密度是指样品密度与介质的密度相等，实际上是在梯度密度介质中进行的。在离心时，颗粒依其密度的不同沉降或向上漂浮，直到移动到与,2019/12/6,38,自身的密度相同的溶剂梯度中为止，其结果是依样品物质密度的不同在梯度溶剂中形成一个个区带。特点：沉降分离与样品物质的大小和形状无关，而取决于样品物质的密度。转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。,3.2等密度梯度离心等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝CsCl，其密度可达1.7g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。注意点：离心时间要长粒子密度不宜太近可用角式转头或水平式转头不能用刹车密度梯度溶液中要包含所有粒子密度,2019/12/6,39,离心的基本方法,3.密度梯度离心梯度材料的选择原则：与被分离的生物材料不发生反应。可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度pH变化较小。不会对离心设备发生腐蚀作用。容易纯化，价格便宜或容易回收。浓度便于测定，如具有折光率。对于分析超速离心工作来说，它的物理性质，热力学性质应该是已知的。,2019/12/6,40,2019/12/6,41,3.密度梯度离心两种密度梯度离心的区别：依据的原理不同：速率区带离心依据粒子的沉降速率被分离；等密度梯度离心依据粒子本身的密度差异被分离。介质的梯度范围不同：速率区带离心介质的密度小于样品中,各种粒子的密度；等密度梯度离心介质密度大于样品各种粒子的密度。时间效应不同：速率区带离心不能长时间离心；等密度梯度离心长时间离心将各种粒子停留在等密度位置形成区带。,2019/12/6,42,3.密度梯度离心离心后样品的收集：无论是采用哪种操作方式，最终都要分别收集处在每一区带的样品组分，一般可采用下述两种方法实现：穿刺法：用一根金属空心针从离心管底刺人管内，不同区带内的组分自下而上地先后从针管内分别流出，然后用部分收集器分别收集。取代法：往离心管中注入高密度的离心介质（其密度高于离心管中所形成的最大密度,）。当取代液不断注入时离心管中的溶液逐渐上升，并不断从收集导管中流出，然后用部分收集器分别收集。,穿刺法,离心机的使用,高速与超速离心机因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程：使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各离心机说明书所规定的范围。装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护。,2019/12/6,43,2019/12/6,44,若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常声音应立即停机检查，及时排除故障。每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时。离心时不准开盖，不准用手停止转头。,分光光度技术,2019/12/6,45,分光光度技术,2019/12/6,46,分光光度技术的原理,分光光度计的基本结构,分光光度计的操作方法,分光光度技术的定性和定量方法,1,2,3,4,分光光度技术,2019/12/6,47,分光光度技术,2019/12/6,48,分光光度技术,2019/12/6,49,分光光度技术,201