（微生物学专业论文）分枝犁头霉热稳定α半乳糖苷酶的基因克隆和生化鉴定.pdf

中山大学博士学位论文 中山大学博士学位论文 分枝犁头霉热稳定旺一半乳糖苷酶的基因克隆和生化鉴定 专业：微生物学 博士研究生：李荷 指导教师：钟英长教授 中文摘要 a 一半乳糖苷酶( n g a l a e t o s i d a s e ，e c 3 2 1 2 2 ) ，也称蜜二糖酶，是一类能够催化 水解末端含1 ，6 一半乳糖苷键的酶类，包括线形和分支寡糖，多糖以及人工合成 的底物，如蜜二糖、棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖；多聚半乳甘露糖和对硝基d 半 乳糖苷。 为了促进蔗糖的结晶和提高其产率，旺一半乳糖苷酶已经被用于甜菜制糖工业中棉 子糖清除。它在来源于豆粕的食品加工过程中的潜在应用也已经被得到证明。而且， 使用半纤维素酶包括叶半乳糖苷酶在纸浆工业的应用也引起了人们浓厚的兴趣，因 此，旷半乳糖苷酶具有广泛的应用前景，特别是在食品和饲料工业。 本论文针对q 一半乳糖苷酶在食品、饲料、医药工业等领域应用的过程中存在的酶 单位产量较低、胞内提取困难、生产成本居高不下、酶学性质欠佳等关键问题。为了 克服这些不足，利用基因工程手段是开发具有优良特性n 一半乳糖苷酶进行高效生产 的有效途径。这些问题解决有助于该酶的大规模推广和使用。这对于提高蔗糖的得率 和品质、改善豆粕蛋白能量的利用率、治疗法布里氏疾病以及血液转换等方面都具有 十分重要的意义。 本论文是从发霉的豆粕、豆油工厂周围环境中发酵排放处采集土样，利用选择性 培养基，一株能够产热稳定q 一半乳糖苷酶的耐热真菌得到了分离纯化，经形态学和分 子生物学鉴定确认这株真菌为分枝犁头霉( a b s i d i ar a m o s a ) 暂定名为w l 5 1 1 。该菌 株生长的最适温度和p h 是4 7 0 c 和7 0 ，所产酶为胞内酶，酶活研究表明粗酶液的最 适温度和p h 是6 8 0 c 和7 0 。 中山大学博士学位论文 来源于分枝犁头霉w l 5 1 l 半乳糖苷酶的基因组d n a 和c d n a 序列被克隆。序 列分析表明，该a 一半乳糖苷酶基因组d n a 序列全长2 6 2 3b p ，含有6 个内含子( i n w o n ) 和5 个外显子( e x t r o n ) 组成：c d n a 编码区长2 2 2 8b o ，其中一个完整的o r f 长度是2 1 4 2 b d ，编码7 1 3 氨基酸残基的多肽，推测分子量是8 i k d a ，氨基酸序列中共含有4 个潜在 的糖基化点，将不同来源的a 半乳糖苷酶基因与此基因进行比较发现，该基因与其他 半乳糖苷酶的同源性较低，最高的是与链霉菌s t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i sm a 4 6 8 0 的一 半乳糖苷酶为3 8 ，该基因已经在g e n e b a n k 中登录，登录号为d q 2 3 4 2 8 0 。 将克隆的旺一半乳糖苷酶基因连接在p q e 3 0 载体，重组质粒转化大肠杆菌e c o i l m 1 5 ，阳性转化子用i p t g 在不同温度诱导3 小时，i p t g 诱导的最终浓度达0 5m m ， s d s p a g e 和a 一半乳糖苷酶活分析表明克隆的基因能够在温度1 8 0 c 时以包涵体形式 表达，但表达蛋白没有活性。为了实现高效分泌表达，将克隆的0 【半乳糖苷酶基因 连接在p p i c z a a 构建重组质粒p p i c z a a a g a ，用电转化的方法将重组质粒 p p i c z a a a g a 整合在毕赤酵母p i c h i a p a s t o r i sg s l l 5 的染色体上，其中8 “重组酵母实 现了a 半乳糖苷酶的高效分泌表达，表达产物具有生物活性。发酵上清液的酶活达 3 2u m l ，采用镍亲合层析方法将重组蛋白纯化，纯化酶的比活力为1 3 7u m g ， s d s p a g e 电泳显示为单一条带，凝胶过滤和s d s p a g e 所估算的分子量分别为3 4 8 k d a 和8 7k d a ，推测来源于分枝犁头霉w l 5 1l e t 一半乳糖苷酶是四聚体，在毕赤酵母 pp a s t o r i s 表达的分子量比原酶大6k d a 是由于糖基化9 1 起。其等电点为5 2 。该酶 的最适反应温度为7 3 ，最适p h6 8 ，在6 0 。c 以下及p h5 5 9 0 范围内活性稳定。 在7 5 时保温2 小时保留5 4 的酶活，8 5 时酶活完全消失。h g ”、f e ”、对氯高 汞苯甲酸、碘乙酸和n 乙基马来酰亚胺对该酶有强烈的抑制作用，而巯基乙醇、二 硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇和谷光甘肽对该酶有不同程度的激活作用，其它金属离子和 e d t a 和邻二氮杂菲对酶活没有明显的影响。以对硝基苯酚廿d 一半乳糖苷为底物， 浚酶动力学参数分别是： ，m 值为0 4 2 m m ；z m 。分别为4 1 3 u m g ：a l 为6 4 5 3 l m i n 。 。岛作为酶的特异性分析指标，因此在所实验的底物中，对硝基苯酚一一d 一半乳糖 苷是最适底物。 总之，一株耐热分枝犁头霉w l 5 l l 的热稳定小半乳糖苷酶基因已经被克隆和测 序，重组蛋白已经被分离和纯化。所研究的纯酶与目前已经报道的至少在以下几个方 面( 分子量、等电点、最适p h 和温度) 之一不同，表明这是一个新的n 半乳糖苷酶。 这些同工酶的不同性质表明生物进化的多样性和a 半乳糖苷酶基因在不同微生物之 i i 中山大学博士学位论文 间的转移。同时，该热稳定半乳糖苷酶基因的成功克隆和分泌表达为工业应用提供 低成本和高质量的酶制剂打下基础，具有重要的理论意义和应用潜力。 关键词：分枝犁头霉，热稳定一半乳糖苷酶，基因克隆，表达，酶性质 一! 坐叁堂堡圭兰堡丝苎 m o l e c u l a rc l o n i n ga n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a f i o o f an o v e lt h e r m o s t a b l e n - g a l a c t o s i d a s ef r o mt h e r m o t o l e r a n t a b s i d i ar a m o s ew l 5 1 1 a b s t r a c t m a j o r ：m i c r o b i o l o g y n a i d _ e ：l ih e s u p e r v i s o r ：p r o f z h o n gy i n g c h a n g a g a l a c t o s i d a s e o r m e l i b i a s e ( c l d g a l a c t o s i d a s e ，e c3 3 1 2 2 1 c a t a l y z e st h e c l e a v a g eo ft e r m i n a l 一1 ，6 - l i n k e dg a l a c t o s y lr e s i d u e sf r o maw i d er a n g eo fs u b s t r a t e s i n c l u d i n gl i n e a ra n db r a n c h e do l i g o s a c c h a r i d e s ，p o l y s a c c h a r i d e sa n ds y n t h e t i cs u b s t r a t e s s u c ha s m e l i b i o s e ，r a f f i n o s e ，s t a c h y o s e ，v e r b a s c o s e ，p o l y m e r i cg a l a c t o m a r m a n a , a n d p - n i t r o p h e n y l 一吐一d g a l a c t o p y r a n o s i d e at h e r m o t o l e r a n tf u n g u sd e s i g n a t e da sw l 51 1 w a si s o l a t e df r o mt h es o i l s a m p l e c o l l e c t e dn e a rt h ef a c t o r yw h i c h p r o d u c e st h es o y b e a no i lb yu s i n gas e l e c t i v em e d i u m a s t r a i nc a p a b l eo fp r o d u c i n gt h e r m o s t a b l e 旺一g a l a c t o s i d a s ew a s i d e n t i f i e da sa aa b s d d r a m o s ea c c o r d i n gt ot h em o r p h o l o g i c a la n dt h em o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o n t h eo d t i m a l c o n d i t i o n sf o rt h eg r o w t ho ft h eo r g a n i z mw e r ee x a m i n e d t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ea n d p h v a l u ef o rg r o w t hw e r e 4 7 a n d7 0 ，r e s p e c t i v e l y r e s e a r c ho nt h e a c t i v i t yo ft h e a g a l a c t o s i d a s es h o w e dt h a tt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ea n dp hf o rt h ea c t i v i t yo ft h ec r u d e e n z y m ew a s6 8 。ca n d7 0 t h ea g a l a c t o s i d a s ef r o ma b s i d i ar a m o s ew l 511w a sl o c a t e d i n t r a c e l l u l a r l y g e n o m i cd n aa n dc d n as e q u e n c e so ft h e 一g a l a c t o s i d a s e f r o ma b s i d i ar 珊竹o s p w l 511w e r ec l o n e d s e q u e n c e sa n a l y s i sr e v e a l e dt h eg e n o m i cd n a w i t ht h ef u l ll e n 吐ho f 2 2 2 8b p c o n t a i n i n gs i xi n t m n s ，c d n aw i t ht h el e n g t ho f214 2b pe n c o d i n ga p o l y p e p t i d e o f7 1 3a m i n oa c i dr e s i d u e sw i t hap r e d i c t e dm o l e c u l a rm a s so f8 1 k d a f o u rd o t e m i a l n - g l y c o s y l a t i o ns i t e sw e r ea s s u m e d c o m p a r i n gt h eg e n ec d n aa n dt h ed e d u c e da n t i n o a c i ds e q u e n c e sw i t ho t h e r - g a l a c t o s i d a s e ss e q u e n c e sf r o mv a r i o u s o r g a n i s m ss o u r c e s s h o w e dav e r yl o wh o m o l o g y , a n dt h eh i g h e s th o m o l o g yo fc d n aa n d t h ed e d u c e da m i n o 中山大学博十学位论文 a c i d s e q u e n c e sw a s3 8 b e t w e e nt h e 一g a l a c t o s i d a s e so fs t r e p t o m y c e s a v e r r n i t i l i s m a 一4 6 8 0a n da b s i d i ar a r n o s ew l 511 t h en u c l e o t i d es e q u e n c ed a t ar e p o r t e dh e r ew a s s u b m i t t e dt ot h en u c l e o t i d es e q u e n c ed a t a b a s e su n d e ra c c e s s i o nn u m b e r sd q 2 3 4 2 8 0 t h ec l o n e da g a l a c t o s i d a s eg e n ef a g a ) w a sl i g a t e dt op q e 3 0v e c t o rf o re x p r e s s i o n t h e nt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t oe c o i lm 1 5 t h ep o s i t i v e t r a n s f o r m a n t sw e r ei n d u c e da td i f f e r e n tt e m p e r a t u r ef o rt h r e eh o u r sb yi p t gw i t ht h ef i n a l c o n c e n t r a t i o no f1m m s d s - p a g ea n a l y s i sa n dd g a l a c t o s i d a s ea c t i v i t ya s s a ys h o w e d t h a ta g ag e n ew a se x p r e s s i o n e di nt h ef o r mo ft h ei n c l u s i o nb o d i e si ne c o i la t1 8 ( 2 ，b u t r e c o m b i n a n tp r o t e i ni sn o ta c t i v e i no r d e rt oo b t a i nt h ee x p r e s s i o np r o d u c ti nt h ef o r mo fs e c r e t i o n ，a g ag e n ew a si n s e r t e d i n t ot h ev e c t o rp p i c z a at oc o n s t r u c tr e c o m b i n a n tp l a s m i dp p i c z a a a g a t h e n p p i c z a a a g aw a st r a n s f o r m e db ye l e c t r i c i t yp u l s ei n t og s 115 ，p i c h i ap a s t o r i sa c e e p t o r t h er e c o m b i n a n ty e a s t8 释w i t hi n t e g r a t e d a g ag e n ei n t ot h eg e n o m ed n a o fg sl15w a s s c r e e n e d t h ea - g a l a c t o s i d a s ea c t i v i t ya s s a yr e s u l t sr e v e a l e dt h a ta g ag e n ew a se x p r e s s e d a n dt h es e c r e t e d b y i npp a s t o r i s t h e y i e l d r e a c h e da b o u t3 2 u m lo fm e d i u m r e c o m b i n a n ta g aw a sp u r i f i e db yu s i n gn i 2 + - c h e l a t i n ga f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y t h e s p e c i f i ca c t i v i t yo fp u r i f i e de n z y m ew a s1 3 7u m g t h ep u r i f i e de n z y m eg a v eas i n g l e b a n do ns d s p a g e t h i si n d i c a t e dt h a t p u r i f i e ds a m p l e w a s e l e c t r o p h o r e t i c a l l y h o m o g e n e o u su n d e rt h ed i s s o c i a t i n gc o n d i t i o n s i t sm o l e c u l a rm a s sw a se s t i m a t e dt ob e a b o u t3 4 8k d ao ng e lf i l t r a t i o na n d8 7k d ao ns d s p a g e h e n c e ，i tw a sa s s u m e dt h a t n a t i v e 位- g a l a c t o s i d a s e f r o ma b s i d i ar a m o s ew l 5 11w a sat e t r a m e r t h ea p p a r e n t m o l e c u l a rm a s so fr e c o m b i n a n te n z y m ei n 尸p a s t o r i sw a s6k d a l a r g e rt h a nt h a to fn a t i v e e n z y m ed u et og l y c o s y l a t i o n t h ei s o e l e c t r i cp o i n tw a sp h5 2 t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r e a n dp hf o rt h ee n z y m ea c t i v i t yw e r e7 3 。ca n dp h6 8 ，r e s p e c t i v e l y t h ee n z y m ew a s s t a b l ei nt h er a n g eo fp h5 5 9 0a n db e l o w6 0 。ca n dh a d5 4 o fi t sa c t i v i t ya t7 5 。c i t w a sc o m p l e t e l yi n a c t i v a t e da t8 5 。c t h ea c t i v i t i e sw e r es t r o n g l yi n h i b i t e db yh 9 2 + ，f e 3 + ， p c h l o r o m e r c u r i b e n z o a t e ，i o d o a c e t i ca c i da n dn e t h y l m a l e i m i d e ，b m e r c a p t o e t h a n o l ， d i t h i o t h r e i t o l ，d i t h i o e r y t h r i t o la n dg l u t a t h i o n es l i g h t l ya c t i v a t e dt h ee n z y m e ，l e s s p r o n o u n c e de f f e c tw a so b s e r v e di nt h ep r e s e n c eo ft h eo t h e rd i v a l e n tc a t i o n s ，t h ec h e l a t i n g a g e n te d t a a n dp h e n a n t h r o l i n e w h e np n p gw a sa ss u b s t r a t e ，t h ek m ，p ，m “，a n d a 【w e r e v 中山大学博士学位论文 0 4 2m m ，4 1 3u m g 。1a n d6 4 5 3 1m i n - 1 ，r e s p e c t i v e l y i ng e n e r a l ，t h ec a t a l y t i ce f f i c i e n c i e s ( k m ) a r ec o n s i d e r e da sam e a s u r e m e n to ft h ee n z y m es p e c i f i c i t y , a m o n gv a r i o u s b e i n gt e s t e dp n p ow a sc l e a r l yp r e f e r r e ds u b s t r a t e t h et h e m a o s t a b l en - g a l a c t o s i d a s eg e n ef r o mat h e r m o t o l e r a n ta b s i d i ar a m o s ew l 511 w a sc l o n e da n ds e q u e n c e d ，t h er e c o m b i n a n ta - g a l a c t o s i d a s eh a sb e e n p u r i f i e da n d c h a r a c t e r i z e d t h ep u r i f i e de n z y m ed e s c r i b e dh e r ed i f f e r sf r o mt h a tr e p o r t e dh i t h e r t oi na t l e a s to n eo ff o l l o w i n ga s p e c t s ：m o l e c u l a rm a s s ，p i ，p ha n dt e m p e r a t u r eo p t i m a t h e r e f o r e ， t h ee n z y m ew a sc o n s i d e r e da san o v e ln - g a l a c t o s i d a s e t h e s ed i f f e r e n c e so ft h e i s o f u n c t i o n a le n z y m es u g g e s t e dt h a td i v e r s i t yi ne v o l u t i o na n das p r e a do f 一g a l a c t o s i d a s e g e n ea m o n gd i f f e r e n tm i c r o o r g a n i s m s t h ec l o n i n ga n de x p r e s s i o no ft h et h e r m o s t a b l e a g a l a c t o s i d a s eg e n el a i daf o u n d a t i o nf o rp r o d u c t i o no fa p p l i c a t i o no ft h ee n z y m ei nt h e f u t u r e k e y o r d s ：a b s i d i ar a m o s e ；t h e r m o s t a b l e 旺一g a l a c t o s i d a s e ；m o l e c u l a r c l o n i n g ； e x p r e s s i o n ；e n z y m ep r o p e r t i e s 李荷中山大学博士学位论文分枝犁头霉热稳定a 一半乳糖苷酶的基因克降和生化搽定 第1 章 刖吾 f i 半乳糖苷酶( f i g a l a c t o s i d a s e ，e c 3 2 1 2 2 ) ，也称蜜二糖酶，是催化半乳 糖苷键水解的水解酶类，是广泛存在于自然界的一类外切酶，能催化一半乳糖苷 键的水解，即能水解非还原性末端以键结合的半乳糖苷化合物，因此它能水解 蜜二糖、棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖，还能水解半乳糖苷键的杂多糖 以及人工合成的对硝基苯旺d 半乳吡喃糖苷结构的低聚糖或多聚糖类，尤其多 见于种子、根、芽等组织内( h a l s t e a de l a l ，2 0 0 0 ；p u c h a te t 以，2 0 0 0 ；a d e m a r ke t a l ， 2 0 0 1 ；k i n ge t a l ，2 0 0 2 ；s h a b a l i n ，e t a l ，2 0 0 2 ) 。 通过对n 一半乳糖苷酶的研究表明，该酶无论是种子萌发，人类的血型转换， 以及在在饲料、制糖、食品和医药工业等领域具有广泛的应用前景。因此研究a 半乳糖苷酶具有十分重要的意义。 1 1 半乳糖苷酶的国内外研究概况 1 1 1f i t 半乳糖苷酶的分布及特性 一半乳糖苷键常见于一些寡糖，如与一个葡萄糖结合形成蜜二糖，与一个蔗 糖结合形成棉子糖，还有水苏糖、毛蕊花糖等中，这些寡糖在植物和动物体内广 泛存在，包括细菌、真菌、酵母和放线菌，已经报道的就有4 0 多种( 张树政， 1 9 8 4 ) 。通常所讲的一半乳糖苷主要指大豆寡糖( s o y b e a no l i g o s a c c h a r i d e s ) ，因其 进入大肠后，可被肠道微生物发酵产气，引起消化不良、腹胀、肠鸣等症状，故 又称之为胃肠胀气因子( f l a t u l e n c ef a c t o r so 吐一半乳糖以侧链的形式与甘露聚糖 主链结合，其结构如图1 一l 所示。不同来源酶的结构和性质不一样。目前已经从 动物如人和鼠：植物如蚕豆( m a l ye ta l ，1 9 8 5 ) 、瓜尔豆( v e a l ee ta 1 ，1 9 9 2 ) 、西瓜 ( i t o he la 1 ，1 9 8 6 ) 、芋( c l i i e n & l i n ，1 9 9 1 ) 、甘蔗( c h i n e ne ta l ，1 9 8 1 ) 、白花苜蓿 ( w i l l i a m se ta l ，1 9 7 8 ) 、咖i 啡( z h u & g o l d s t e i n ，1 9 9 4 ) 及微生物如双歧杆菌( l e d ee t a l ，2 0 0 0 ) 、海洋细菌( b a k u n i n ae ta l ，1 9 9 8 ) 、产紫青霉( s h i b u y ae ta l ，1 9 9 8 ；s h i b u y a 李荷 中山大学博士学位论文分枝犁头霉热稳定。半乳糖苷酶的基因克隆和生化鉴定 & k o b a y a s h i ，1 9 9 5 ) 、嗜热杆菌( t a l b o t & s y g u s c h ，1 9 9 0 ；k i n ge ta 1 ，1 9 9 8 ) 、色被 孢霉( s h i b u y a , e l a l ，1 9 9 7 ；s h i b u y ae l a l ，1 9 9 9 ) 等中发现，很多己被分离、纯化，表 1 一l 中列出一部分近年来在微生物中获得a 一半乳糖苷酶的来源及其分子量研究 报道。 h o h i 三三= ：! ：= i i! 二! ! ： f 水苏黼o s e ) 图1 - 1 ：棉子糖族寡糖的结构 f i g i - i ：t h es t r u c t u r eo f r a f f i n o s e - o l i g o s a c c h a r i d e s 李荷中山大学博士学位论文分枝犁头霉热稳定。半乳糖苷酶的基因克隆和生化鉴定 表l - l ：n 半乳糖苷酶的分布 t a b l el - 1 ：d i s t r i b u t i o no f c l - g a l a c t o s i d a s e 3 李荷中山大学博士学位论文分枝犁头霉热稳定c i 一半乳糖苷酶的基因克隆和生化鉴定 1 1 2n 半乳糖苷酶的结构特点及定位 a 一半乳糖苷酶与其它的糖菅酶一样都是糖蛋白，由单肽糖基化而成，将纯化 的慢半乳糖苷酶用凝胶电泳显示的是均一带用考马斯亮蓝和s c h i f f 碱染色r 吴劲 松，冯万祥，2 0 0 2 ；李孝辉，陈声明，2 0 0 2 ) 证明了a 半乳糖苷酶是一种糖蛋白， 将产0 【半乳糖苷酶的细胞放在c 1 4 的果糖溶液中培养，再将所产生的q 半乳糖苷 酶进行凝胶电泳c “标记的酶，显示出一个单一的放射性带，再将放射性的酶用 一种p r o n a s e 的酶进行充分水解，通过s e p h a d e x 一2 5 柱分离，进一步证明。g t 半 乳糖苷酶是由蛋白质和糖两部分组成，从a 半乳糖苷酶这种糖肽分离下来的糖进 一步分析，这种连接于多肽上的糖基是由6 - 8 个单糖组成的，它们是甘露糖和乙 酰葡萄糖胺，并且甘露糖和乙酰葡萄搪胺的比例大约是2 8 ：1 ( b r u m e re ta 1 ， 1 9 9 9 ) 。如葡酒色被包霉旺一半乳糖糖苷酶晶体中含有1 0 8 的中性糖和2 7 的葡糖胺，镁离子和n a d 是该酶的辅基( s h a b a l i n , e ta l ，2 0 0 2 ；d e ye ta 1 ，1 9 9 3 ) ， 根据a 半乳糖苷酶对底物的专一性将a 半乳糖苷酶分为两类，即p n p o 、蜜二糖、 棉籽糖族寡糖类有专一性的酶和对半乳糖甘露聚糖有专一性同时也能不同程度 地降解第一类糖的酶。第一类a 一半乳糖苷酶又可分为三种不同的酶蛋白，编码基 因为a g l a ，a g l b 和a g l c ( r o n a l de ta l ，1 9 9 9 ) ，这三种酶的活性也有差异，其中 a g l a 作用于寡糖的末端半乳糖，a g l b 作用于寡糖的支链半乳糖，而a g l c 对以 上两种寡糖均有作用效果( s h i b u y a & h i r o a k ，1 9 9 8 ) 。 在研究此低聚糖时与蛋白质的连接方式时，通过弱碱和强碱在n a b h 4 存在 的条件下进行水解等一系列处理后，发现伍半乳糖苷酶中蛋白质和糖苷的连接方 式是通过低聚糖中的乙酰葡萄糖胺和蛋白质中的天冬氨酸残基相连接的。不同种 的微生物产生的同一种酶具有几种不同的催化特性，这主要是和蛋白质的结构有 关，而蛋白质的结构是由肽链的氨基酸序列决定的，在几种微生物产生的的一 半乳糖苷酶的n 末端氨基酸序列也证实了这一点。研究表明ps i m p l i c i s s i m u m 的 a g l h i 的n 一末端氨基酸序列与m v i n a c e a 和sc a r l s b e r g i e n s i s 的0 【一半乳糖苷酶的 n 末端氨基酸序列具有高度相似性，而a g li i 的n 末端氨基酸序列与其他几种 旺一半乳糖苷酶的n 一末端氨基酸序列相似性很小。n 一末端氨基酸序列高度相似的 几种酶，它们的作用底物的特异性相同，而n 末端氨基酸序列高度相似很小的 4 李特中山大学博十学位论文 分枝犁头霉热稳定n 半乳糖昔酶的基因克隆和生化鉴定 几种酶其作用的底物的特异性相差很大。 微生物中，主要是从提取液中发现具有半乳糖苷酶活性，而后分离纯化( 吴 劲松& 冯万祥，2 0 0 2 ) 。在植物中，半乳糖苷酶则主要分布在植物的种子、根 及地下茎中( s u s e e l a ne t a l ，1 9 9 7 ) ，也能从植物的茎杆、花梗、叶柄等中分离到此 酶( u a v i se ta 1 ，1 9 9 7 ；d ev f i e se ta 1 ，1 9 9 6 ) 。植物的种子富含蛋白质，杂质相对 较少，易于半乳糖苷酶的提纯，因而成为提取a 一半乳糖苷酶的理想来源。而 从根中如毛蕊花( 矿t h a p s u s ) 分离一半乳糖苷酶时，由于根中含有酚类化合物， 分离纯化时无法去除产生的醌，而且根的次级产物也严重影响0 【一半乳糖苷酶的分 离，所以分离量低。 1 1 3 咖半乳糖苷酶的酶学特性 1 1 3 1 分子量不同 不同来源旺一半乳糖苷酶具有不同的分子量，而同一来源的半乳糖苷酶也 因a 半乳糖苷酶的多态性而具有不同的分子量，已纯化的一半乳糖苷酶的分子 量介于2 8k d a - - 3 7 k d a 之间，最小的分子量是咖啡约2 8k d a ( c a r c h o n & d e b r i y n e 1 9 7 5 ) ，最高为曲霉菌约3 7k d a 。微生物来源的q 半乳糖苷酶，有单体、二聚体、 三聚体和四聚体形式。 1 1 3 2 u 半乳糖苷酶的专一性 旺一半乳糖苷酶对o 糖苷键有高度专一性，可作用于含有这种糖苷键的多种 天然及人工底物，如蜜二糖、棉子糖、水苏糖、人的b 型血抗原和对硝基苯d 半乳吡喃糖苷( p n i t r o p h e n y l - d - g a l a c t o p y r a n o s i d e ，p n p g ) 等( 李孝辉& 陈声 明，2 0 0 2 ) 。不同来源的a 半乳糖苷酶对底物的专一性有明显差异，大多数真核 生物旺一半乳糖苷酶对对硝基苯a d 越t 喃半乳糖苷( p n p g ) 有相似的专一性，对于 高分子量的寡糖即复合糖的活性存在差异。一般的研究认为一半乳糖苷酶的作用 方式是断裂非还原性术端的- d 一半乳糖苷键，产生一分子的d 半乳糖，但9 0 年代以来的研究表明，有些微生物来源的小半乳糖苷酶还能水解侧链基团即旺一 半乳糖苷键连接的杂多糖( 李孝辉& 陈声明2 0 0 2 ) 。同时还发现同一种微生物的 几种值一半乳糖苷酶的作用方式不一样，研究a s p e r g i l l u sn i g e r5 - 1 6a 一半乳糖苷酶 李荷中山大学博士学位论文分枝犁头霉热稳定n 一半乳糖苷酶的基因克降和生化鉴定 的作用底物特异性时发现，粗酶液能分解对硝基苯基0 【半乳糖苷和蜜二糖，将 粗酶液先用硫酸按沉淀，然后经d e a f 纤维素柱、s p s e p h a d e x 一5 0 柱、亲和色 谱柱进行纯化得到一种n 半乳糖苷酶，它能水解对硝基苯基伍一半乳糖苷，但不 能水解蜜二糖。一方面说明此酶至少存在两种同工酶，另一方面说明不同的洳 半乳糖苷酶具有不同的底物特异性。 1 , 1 3 3 * 半乳糖苷酶的最适p h 值和温度稳定性 小半乳糖苷酶的活性可用蜜二糖和绵子糖来测定，也可以利用对硝基苯酚一 一d 一半乳糖吡喃糖苷作为底物来测定( 陆文清& 李德发，2 0 0 2 ) ，不同来源的n 半乳糖苷酶，其最适温度和p h 值范围也不同，不同的微生物产生的a 一半乳糖苷 酶的最适p h 和温度范围也有很大差别。一般细菌分泌的最适p h 值范围在6 5 7 5 之间，最适温度范围在3 7 4 0 ；丝状真菌及酵母分泌的旺一半乳糖苷酶 的最适温度范围比细菌高( 潘宝海等，2 0 0 2 ) ，一般在5 0 8 0 之间，p h 值变 化范围也很大，在4 5 8 0 之间。一般来说，同一种微生物的粗酶和纯化后的酶 其作用最适温度相同，但其热稳定性和p h 值稳定性有差异( 许尧兴等，2 0 0 4 ) ，对 黑曲霉在不同培养基上生长产生的旺一半乳糖苷酶性质进行研究时，发现黑曲霉在 麸皮和米糠上生长产生的旺半乳糖苷酶的最佳酶作用条件是当p h 是5 0 时，温 度为5 0 ，在3 5 5 0 两种酶都稳定，在超过5 0 时，在米糠的培养基上的旺一 半乳糖苷酶的稳定性要高些。 1 1 4 微生物合成半乳糖苷酶的调控 1 1 4 1 微生物产半乳糖昔酶的诱导与抑制 微生物合成的旺半乳糖苷酶为诱导酶，不同种类的微生物合成半乳糖苷 酶需要不同的诱导物。一般的诱导物是酶作用的底物或底物类似物，有时还可能 是旺一半乳糖苷的分解产物。大肠杆菌( e c o l i s u b s p ，c o m m u n o l a m l 2 1 7 ) 在水苏糖 或棉子糖诱导下能产生大量的胞内n 半乳糖苷酶。红曲( m o n a s c u ss p ) 能被半 乳糖诱导。葡酒色被胞霉合成c 1 半乳糖苷酶除能被蜜二糖、棉子糖诱导外，还能 被它的底物类似物乳糖所诱导。r u b e nc r u z 等人在研究米曲霉合成一半乳糖苷 酶时，比较了不同糖类物质的诱导作用。他选择了淀粉、水苏糖、棉子糖、蔗糖、 李荷中山大学博士学位论文分枝犁头霉热稳定。一半乳糖苷酶的基因克隆和生化鉴定 葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、豆粕碳水化合物，作液体深层发酵诱导物。结 果发现只有水苏糖、棉子糖、豆粕碳水化合物具有诱导作用。在以麸皮为基础物 作固体发酵，添加不同量的豆粕( 碳水化合物) 浸出液来作研究。5 0 克麸皮分 别加1 0 、2 5 、5 0 m l 豆粕浸出液，再分另, j 3 n4 0 、2 5 、0 m l 水，进行固体发酵。 结果发现，以p n p g a l 为底物进行酶活测定时，提取液酶活分别为o 9 3 、 1 7 3 、 2 5 8u m i n m l 。由于豆粕中含有水苏糖、棉子糖，随发酵培养基中的水苏糖、棉 子糖含量的提高，酶活也随之提高。以葡萄糖为碳源，对微生物产一半乳糖苷酶 的诱导合成及诱导物的利用均有影响。葡萄糖容易被微生物所利用，因此在微生 物产舡半乳糖苷酶时也存在“葡萄糖效应”，即只有培养基中无容易利用的碳源 时，才能看到诱导作用。对红曲旺半乳糖苷酶合成的动力学研究亦发现：红曲细 胞生长环境中在葡萄糖和半乳糖( 诱导剂) 时，首先利用的是葡萄糖，细胞生长 曲线是双峰的。当葡萄糖的浓度超过2 2 5 1 0 。4g m l 时，葡萄糖就抑制了半乳糖 的利用和u 一半乳糖苷酶的合成。 1 1 4 2 微生物源u 半乳糖苷酶的分子调节机理 微生物合成一半乳糖苷酶时可能受到多个各自独立的基因控制，以致产生同 工酶的特性( 如底物特异性、对温度的稳定性等) 相差极大。e l i n a 报道的黑曲霉 ( a s p e r g i l l u s n i g e r ) 所产生的三种旺一半乳糖苷酶，其中a g l i ，a g l l i i 的活性能 被其水解产物n 半乳糖所抑制，而a g li i 的活性不受影响。d e n 在研究黑曲霉 产生的一种分子量为8 2k d a 的源半乳糖苷酶时发现，其蛋白质氨基酸顺序与 其它微生物产生的旺一半乳糖苷酶的n 一末端氨基酸序列具有极高的相似性，根据 n 一末端氨基酸序列，利用黑曲霉的x e m b l 3 基因库的低聚核苷酸作探针来克隆相 应的基因a g l a 。结果发现当a g l a 基因缺失时，黑曲霉不产生分子量为8 2k d a 的q 半乳糖苷酶，含多拷贝a g l a 基因的菌株会超量生产分子量为8 2k d a 的q 一 半乳糖苷酶。当在基本培养基上生长时，a g l a 基因缺失的黑曲霉产g t 一半乳糖苷 酶的总活性受到的影响不大，进一步研究表明含此多拷贝基因的黑曲霉产生的a 一半乳糖苷酶的总活性也没有多大的变化。后来的研究才发现a g l a 所编码的分 子量为8 2k d a 的半乳糖苷酶只占黑曲霉胞外一半乳糖苷酶酶活性的一小部 分。在黑曲霉中由其它基因编码的a 半乳糖苷酶占酶活的主要部分。黑曲霉的a 半乳糖苷酶的合成受多个基因的调控。在大肠杆菌中也存在两种与a 半乳糖苷 李荷中山大学博士学位论文分枝犁头霉热稳定n 一半乳糖苷酶的基因克隆和生化器定 酶合成有关的操纵子，即位于染色体上的蜜二糖操纵子( m e l ) 和位于质粒的棉予 糖操纵子( r a f ) 。r a f 操纵子由位于结构基因上游的调节基因r 及一个由三个基 因即a 、b 、d 组成的多顺反子所构成。r a f 为编码一半乳糖苷酶的