大肠杆菌基因工程.ppt

大肠杆菌基因工程,201220131271韩武生物技术一班,大肠杆菌的基因工程,一大肠杆菌表达的优缺点二大肠杆菌工程菌的构建策略三大肠杆菌工程菌构建，分析，筛选四大肠杆菌生产实用重组蛋白,基因工程步骤,01,02,03,06,05,04,菌种贮存与保护,目的基因的表达与筛选,受体细胞的增值,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因获取,目的基因的获取,方法1从基因组文库获取2pcr技术扩增目的基因3通过dna合成仪用化学方法合成,表达载体的构建,外源基因在大肠杆菌中高效表达原理启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数,将目的基因导入受体细胞,对于大肠杆菌微生物来讲可以用ca+2处理大肠杆菌，再将目的基因的载体转移到大肠杆菌中。,启动子最佳距离的探测,E,E,A,启动子,A酶切开,Bal31酶解,目的基因,启动子,启动子的筛选,Apr,ori,galK,pKO1,终止密码子,采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段克隆到启动子探针pko上。,受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上报告基因galk的表达产物联,作用。可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质,转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株,含有外源启动子活性的重组克隆,启动子构建,-35区序列,-10区序列,PlL,PrecA,Ptrp,Plac,PtraA,Ptac,启动子,TTGACA,GATACT,TTGATA,TATAAT,TTGACA,TTAACT,TAGACA,TAATGT,TTTACA,TATAAT,TTGACA,TATAAT,Ptac=3Ptrp=11Plac,启动子构建,终止子,终止子选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选,核糖体结合位点,外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）,核糖体结合位点,大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5UAAGGAGG3，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3端区域3AUUCCUCC5并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子；SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成；基因编码区5端若干密码子的碱基序列,密码子,不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是生物基因组中的碱基含量在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体fX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC丰富的生如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势密码子与反密码子相互作用的自由能细胞内tRNA的含量按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法,质粒拷贝数,将质粒导入大肠杆菌中，在大肠杆菌生长达到对数期时，质粒会大量拷贝增殖，进而对大肠杆菌生长以及目的基因表达产生阻碍。故应将重组质粒控制在可控范围内。,大肠杆菌基因工程菌构建,包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建,大肠杆菌工程菌构建,这些构建大肠杆菌工程菌的方法，都是利用大肠杆菌本身特性，来达到目的基因高效、稳定、快速表达。,目的基因导入受体细胞,对于微生物大肠杆菌，可以用ca+2处理，使其达到感受态，感受态细胞可以吸收周围DNA,进而可将含有目的基因的载体吸附。,目的基因的检测与测定,这样得到的大肠杆菌会有四种一没有转入质粒的大肠杆菌二转入质粒，但质粒上没有外来基因（转化子）三转入进质粒，质粒上有基因但没有目的基因（重组子）四转入质粒，质粒上有目的基因(目的重组子）,表达与筛选,对于标定的目的基因的大肠杆菌进行培养扩增，诱导表达，进而采用多种方法鉴定筛选一营养缺陷型筛选二抗药性筛选三显色筛选对于微生物常用蓝白斑法鉴定,大肠杆菌,挑选出转入目的基因的大肠杆菌进行培养，送到相应部门进行DNA扩增，获取更多基因。也可以对大肠杆菌进行低温保存处理。,大肠杆菌基因工程实例,胰岛素的合成早期人类从动物体内直接提取，生产效率低。化学合成用化学方法合成，成本高基因工程以大肠杆菌为受体生产胰岛素,重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,A链和B链同时表达法,tac,b-Gal,ori,Apr,Met,Met,M,M,N,C,Bpeptide,Apeptide,化学合成AB链编码序列,重组人胰岛素,转化,分离纯化,CNBr处理,特异性裂解,体外折叠,重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,生产技术的评价：,由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正,确配对率较低，通常只有10%-20%，因此采用这条工艺路线生,产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。,为了进一步降低生产成本，美国ElyLiLi公司随后又建立了第,二条生产重组人胰岛素的工艺路线。,A链B链同时表达法,重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建（人胰岛素原表达法）,基因工程菌的构建战略：,tac,b-Gal,Cpeptide,ori,Apr,Met,Met,M,M,N,C,Bpeptide,Apeptide,人胰岛素原的cDNA,重组人胰岛素原,转化,分离纯化,重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,人胰岛素原表达法,生产技术的评价：,在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原能形成,良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高,达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，,而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理