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独创声明 y i o l 2 o i 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得( 注:如 没有其他需要特别声明的,本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名: 导师签字: 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定,有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被套阅和借阅。 本人授权堂蕉可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 签字日期:2 0 0 年 月丑 签字日期:2 0 0年月日 山东师范大学硕士学位论文 叶圆盘法建立盐莽( t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a ) 的遗传转化体系 中文摘要 盐芥与拟南芥j 聩缘,具有拟南芥很多同样的优点以作为实验系统:如类似的 形态、夺瓣基嚣组、筑貔生活史、丰富豹耪予襄易 二薮转识簿。篷是,簸芬是真 盐生植物,短时间内能耐受高达5 0 0 m m n a c l 的冲击,在熊适应前后既不产生盐 腺也没有复杂的形态上的变化,表明其耐盐性很大程度上源于基本的生理和生化 辍裁。噩乏癸,釜芬秘羧鬻莽在e d n a 秘氨基袋窳乎上势剐蠢9 。移9 5 鹣嚣滚 性,可以方便的将拟南芥的很多信息( 基因、擞自质数据库以及突变体系等) 移 至盐芥耐盐性的分予生物学研究。目前,对盐芥生理生化的研究、基因表达的研 究,苏及各静e d n a 文淳、突交傣疼戆建立,基经使鏊芬戏凳一静饕豢蠢泠篷 的耐盐模式系统。 盐芥也具有拟南并不具有的优点如耐逆性强等。但盐芥的研究刚起步,利用 萁终麓模式穰穆还纛在嚣难:哭存程e s t 数据瘁:攘胃蘧方矮浚镬瘸f l o r a ld i p 法送 行转化,但较好的转化效率也仅为0 1 ,盐芥有成为盐生模式系统的先天优越条 件,但目前尚未建立起一套完整的栽培技术和转化体系,因此还未能为分子生物 学家瑟溺。陡着舔簸蒸因工程赣策臻豹不薮发袋帮盆芬转纯体系懿逐步宠蛰,攘 物耐盐撼因工程会商很广阔的前聚。因而探索效率高的筛选方法将是建立盐芥转 化体系蕉为关键的阅题,本项研究以b a r 基因作为筛选标记的有效载体为筛选提 供了极大戆方便。 目前已经有农栉菌花浸染法转化盐芥成功的报道,但转化效率均较低,因而 很难说门经建立起了有效的农杼落介导盐芥遗传转化体系。鉴于农杆菌介导法的 诸多德患,麓予萋因缝耜对复杂鼢薤芬焉言,滋一步热强对麓转亿系统靛磺究其 有重要意义。 本研究的目的在于探索影响农籽菌介导转化盐芥的重要因素,研究不同的生 长调节物质薅愈镄缀缀诱导、芽憝分往帮禳诱静静影稠,完蛰缰培技术,建立毫 效的植株再生体系,优化农杆菌转化盐芥的各参数及条件,为建立高效率的农杆 菌贪导豹簸芥遗传转化体系奠定基础,同时利朋研究b a r 基豳的转化来探讨建立 盏莽的遗传转证体系,稠雳建立靛转伍俸系避行_ 虢芥遗转转纯研究。 本实验主要利用盐芥的叶片作为材料,建立了盐芥的再生体系,并在此基 山东师范大学硕士学位论文 础上进行了农杆菌介导的b a r 基因的转化,分析探讨了影响转化效率的各种因素, 初步优化遗传转化体系。主要结果如下: 1建立了盐芥的再生体系。本实验得出愈伤组织的诱导是以m s 为基本培 养基,附加l m g lb a + 0 5 m g l n a a 的效果为最佳,然后及时转接到m s 十l m g l b a + 0 5 m g l n a a 的培养基上诱导芽的分化。生根培养是以1 2 m s 的培养基为 最佳。 2初步建立盐芥遗传转化体系。以b a r 基因作筛选标记初步建立了转化体 系:用盐芥的叶片作侵染材料,预培养2 d ,在o d 值为o 4 0 5 的农杆菌液中侵 染6 - 8 m i n ,共培养2 4 3 6 h ,然后叶片转接到含m s + l m g lb a + 0 5 m g l n aa + 5 0 0 m g lc e f + 5 0 p p mb a s t a ( p h 5 8 ) 培养基上进行筛选培养。p c r 检测初步表明 外源基因已经整合到植物基因组中。 关键词:盐芥转化体系叶圆盘法农杆菌介导 分类号:q 7 8 山东师范大学硕士学位论文 s e tu pl e a fd i s ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo ft h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a a b s t r a e t s a l tc r e s s ( t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a ) i sc l o s e l yr e l a t e dt oa r a b i d o p s i sa n dh a s g o o dg e n e t i cf e a t u r e ss u c ha ss i m i l a rm o r p h o l o g y , s m a l lg e n o m es i z e ,s h o r tl i f ec y c l e , h i 曲s e e dn u m b e ra n da l le f f i c i e n tt r a n s f o r m a t i o n b u t ,s a l tc r e s si sat y p i c a lh a l o p h y t e a n di sa b l et ow i t h s t a n dd r a m a t i cs a l i n i t ys h o c ku pt o5 0 0m mn a c l 孤sp l a n td o e s n o tp r o d u c es a l tg l a n d so ro t h e rc o m p l e xm o r p h o l o g i c a la l t e r a t i o n se i t h e rb e f o r eo r a f t e rs a l ta d a p t i o n b e s i d e s ,s a l tc r e s sa n da r a b i d o p s i ss h a r e9 0 a n d9 5 i d e n t i t i e s o nc d n aa n da m i n oa c i ds e q u e n c e sr e s p e c t i v e l y , s oi ti sc o n v e n i e n tt ot r a n s f e r i n f o r m a t i o n so fa r a b i d o p s i s ( g e n ed a t a b a s e ,p r o t e i nd a t a b a s ea n dm u t a n tl i n e s ) t o m o l e c u l a ra n a l y s i so ns a l tt o l e r a n c eo fs a l tc r e s s u pt on o w , a n a l y s i so ns a l tc r e s s p h y s i o l o g y ,b i o c h e m i s t r ya n dg e n ee x p r e s s i o n , a n dt h ec o n s t r u c t i o no fd i f f e r e n t e d n al i b r a r i e sa n dm u t a n tl i b r a r i e sh a v em a d es a l tc r e s sav a l u a b l em o d e lf o rt h e s t u d yo fs a l tt o l e r a n c e t h i sr e s e a r c hi n c l u d e s :e s t a b l i s h i n gt h er e g e n e r a t i o ns y s t e mo ft h e l l u n g i e l l a h a l o p h i l a a n dp r e l i m i n a r i l ye s t a b l i s h i n gt r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo f t h e l l u n g i e l l a h a l o p h i l ab yt r a n s f o r m i n gb a rg e n e w e h a v ee s t a b l i s h e dt h er e g e n e r a t i o ns y s t e m o ft h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a ,t h e nt r a n s f o r m i n gb a rg e n em e d i a t e db ya g r a b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s w eh a v es t u d i e dm a n yf a c t o r sw h i c ha f f e c tt r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c y a n dp r e l i m i n a r i l ye s t a b l i s h e dt r a n s f o r m i n gs y s t e mb yt h et a go fb a rg e n ea f t e r c o c u l t i v a t i o n t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s : 1t h er e g e n e r m i o ns y s t e mo ft h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l ah a sb e e ne s t a b l i s h e d i n t h i sr e s e a r c h ,t h el e a fe x p l a n th a st h eh i g h e s tr e g e n e r a t i v ec a p a c i t y ,f i r s t l yo nm s m e d i u mc o n t a i n i n g l m g lb a + 0 5 m g l n a a ,t h e no nm sm e d i u mc o n t a i n i n gm s 十 l m g lb a + 0 5 m e l n a a n l cp l a n th a st h ef i n er o o t i n gc a p a c i t yo n1 2 m sm e d i u m 2t h et r a n s f o r m a t i o ns y s t e mh a sb e e np r e l i m i n a r i l ye s t a b l i s h e d w eu s et h e l e a v e so ft h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a u s i n gb a s t at os c r e e nt h et r a n s g e n i cp l a n t s ,w es e t u pt h et r a n s f o r m a t i o np r o c e d u r e :t h ew o u n d e dl e a v e sp r e - c u l t i v a t e df o r2d a y s t h e 1 山东髑范大学硕士学位论文 w o u n d e dl e a v e sw e r ei m m e r s e di nt h eb a c t e r i a ls u s p e n s i o nw i t ho d 6 0 0o f 0 4 - 0 5f o r 6 - 8m i n u t e sa n dt h e nc o - c u l t i v a t e do nm sf o r2 4 - 3 6h o u r s a f t e rw a s h i n gt h ee x p l a n t s t or e m o v ee x c e s s i v eb a c t e r i u m ,t h el e a v e sw a si n d u c e do nm ss u p p l e m e n t e dw i t h m s + l m g lb a + 0 5 m g l n aa + 5 0 0 m g lc e f + 5 0 p p mb a s t a p c ri n d i c a t et h a tt h e b a rg e n eh a sb e e ni n t e g r a t e di n t ot h et h e l l u n g i e l l ag e n o m e k e yw o r d s :t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a ;l e a f d i s ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e m ;t r a n s f o r m a t i o n ; a ,t u m e f a c i e n s ;t r a n s g e n i ep l a n t s , c a t e g o r y :q 7 8 4 山东师范大学硕士学位论文 第一部分文献综述 1 、耐盐模式植物盐芥( t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l al 壤裔麓是一稃主要静菲难耪貉遥因子,严重影晦着攘耪静生长释发弯,导 致了世界终物爨大爨减产。基藏世爨土大约寿l o 亿公顷受盐渡化影嘲豹陆地, 约占陆地总面积的7 t ”。世界上2 0 的耕地和大约一半的灌溉阳存在着不同程 度的盐渍化,我国大约有3 0 0 0 万公顷海滨湿地和内陆盐碱地以及9 0 0 万公顷次 生艋渍亿土壤,盐渍化已成为簸重要的影响社会经济发震的环境因素之一翻。困 武,分援棱物瓣予簸胁逡靛反瘫,磷究荬爱应橇裁,提高棒甥静隧盐歉,不仅对 于揭示撼物耐逆的枧理蠢重要的理谂意义,恧虽对于瓣盐佟物的培育,具有踅要 的实践意义。 植物对盐胁迫的适应非常复杂,提高作物的耐靛性仍然面临着极大的挑战。 因j 毙,利用多种逶传模式系统阐述植物耐盐视制显得歪关筵要。 2 0 0 0 年,垂黎耀范大学张慧教授蓥次提议将熬生攘錾鼓芬( t h e l l u n g i e t l a s a l s u g i n e a ( p a i does c h u l z ) 作为研究植物赋盐性豹模式系统。 盐芥为十字花科盐芥属一年生草本,离1 0 ,6 0 c m ,直立或弯曲,光滑无毛。 茎于基部或中部分枝,光滑,基部常带淡紫色。基生叶莲廉状,具5 1 0 m m 长的 柄,叶片卵形成长阐形,全缘或具不明显、不整齐小荫;茎生叶无柄,罄部箭形, 搀莲,麟片长灏状爨黟,从下魏上灏枣,矮溃急尖,全缘或具不鞠显夺落。藐彦 伞房拔,果期傍长成总状,花梗长2 4m m ;萼片卵嘲形,肖自媳膜质边缘;花 x 瓣白色,长圆状倒卵形,顶端钝圆。长角果长1 2 1 5 m m ,略弯曲:果梗丝状, 长4 - 6m m ,斜向上展开,果端翘起。种予两列,黄色,椭圆形,长约o 5 m m , 花耨4 - 6 月。嫩于壤盐渍亿觞农田旁、永沟旁和由嚣。国内分布子由东、海北、 江苏、掰疆、内蒙吉、吉转、天津、海枣等建。蒙古、嚣镳利亚、孛或、j 美也 ; 有分布。 盐芥的生物学特性及适于作为模式盐生植物的原因:1 ) 盐芥和拟南芥间属 于公认的自然分类群十字花科植物,具有较近的亲缘哭系,雨拟南芥作为模式植 物,其谗多方面已经搞褥相当清楚:2 ) 薤芥蘧一种稔生穗物,矮有一定的辩益 山东师范大学硕士学位论文 性,在1 0 0 m mn a c l 的土壤中能正常完成生活史;3 ) 植株矮小,成熟个体般 高1 0 6 0 e r a ,大量檬株可以种在很小的地方,生长条件十分易于控制,在筛选变 异株时很容易排除由于环境变化而释致的植物形态发育变择;4 ) 生长期短,在 添室条彳牟下完袋生活雯约需3 罐令弼;5 ) 狰- 7 = 多,一椿可产生上万越释予,容 易扩增交冥捧拘秘予瘁;6 ) 囊芯授羚,易得到纯系秘保持变异。 虽然盐芬与拟街芥避缘,但是盐芥不属于拟南芥属,而且两者不能杂交。盐 芥在个体发育、大小、结构等方面与拟南芥都很相似,但是两者在发育上也有几 个非常驻著的差剐。例如,与搿伦眈亚生态鍪l 掇南芥稽滗,益芥叶子受狭长、速 缘有锯壤,舔基时麓更长;盐芥兹开花登须经过三周疆土斡毒纯处理;鼗芬熬芯 也是包括4 个绿色的萼片,4 个自魏的花瓣,6 个雄麓和1 个雌蕊,但是,它的 6 个雄蕊一样长,而拟南芥的是4 强雄蕊:盐芥也是自花授粉,种子数目也涟不 多,约4 0 0 0 8 0 0 0 牵囊,但所产生的长角果比拟南芥的稍短一些,产生的种子比拟 南芥的稍长一砻目。 麓芬短辩润内姥瑟受褰这5 0 0 m m n a c l 瓣冲毒,这远远超过了拟露芬龅瓣受 能力。送秽植物在盐适应前后既不产生盐腺也没有形态上的变化,表明其耐盐性 很大程度上源于甜土植物中也存在的基本的生理和生化机制【4 】。在州嫩淞大 , 约已经注册了17 0 0 个盐芥e s t ,它在e d n a 水平和氮基酸水平上与拟南芥分剐 存9 0 和9 5 的弼源髓,因就,可戳方後的将羧南莽豹穰多倍感( 蒸鑫、蛋自 葳数据痔以及突变体系等) 移至盐芬瓣鼓牲的分予生物学磅究中。丽熙,盐芬具 有拟南芥很多同样的优点以作为实骏系统:如小的基因组、短的生活史、丰富的 种子和易于被转化等特点【5 1 。因此,盐芥是一种很有前景的植物耐盐模式系统, 现在已被很多实验室采纳用予植物耐逆生理生化机锖口的研究。 2 0 0 3 年,v o l k o vv 等入对盏莽进行了兹参蠡孽垒溪研究。蘸耱遥下,鼓芬积 累约n a + 较拟枣芬少;京l 宝l 摩芥中,组织的n a + k + 浓度呈负相关,但谯盐芬中却 不是这样,电生理实验表明,盐芥的根质膜通道具稍较高的k + n a * 选择性;盐 胁迫下拟南芥的蒸腾速率急剧下降,而盐芥的蒸腾速率则降低较慢,鼠盐处理下 只是稍微受到抑制,因此保持了高的水分吸收和离予运输【6 l 。 2 0 0 4 年9 嚣,有关掇南芥近缘模式系统簸芬在疆戆菲生物耪逮牵戆秘究进 震豹基骣磋讨会在法国黩黎翟开f 7 】,来是美国、热拿大、暇本、以色列以及欧洲 6 出东舞范大学矮圭学位论支 国家研究团体的科学家,不仅就各自的最新研究进展进行了交流,而且就如何愿 好的利用摭芥来终为缀端生境模式槌物以及如侧遇过国际大协作来更好的发展 该模式系统震舞了激烈熬讨论。 b r e s s a n 、i n a n 和t a j i 等人的研究都表明盐莽不仅极端耐热,而且极端抗冷 撬旱p ,8 。a r i e a l t m a n 述发现,6 0 0 r a mn a c l 处骥下的盐芬能够维持恒定的食水 量,瓿露馕撮舅生缝拣免受麓承嚣影响,疑瑟瑟释了为嚣么登癸受餮援臻骆遗螽 能快速恢复。 在离予转运方匿,电生理技术蝴、x ,射线微戮分橱( a r i ea l t m a n ) 以及鼙缨腿 褒嚣技零( w i e l a n df r i e k e ) 翡磷究势剐表瑗离黧下盐莽蔽鼗盼缀麓毒较嵩靛 k + ,n a + 选撵能。与会者认为,盐芥与拟南芥相比之所以有较高的耐盐性,组织特 暴鲍k + 、n a + 转运蛋白霹8 起型重要怍耀,特定的转运蛋白基骥的缀织定位没膜 定疰应当撬上嚣程,蠡孬鼠,转运虽骞本身及饔控缀分主可麓存在与抗洼褶荚鹣霪 要区别。栈此方面已经开展的研究为:1 4 3 - 3 蛋白( b e r t d e b o e r sg r o u p ) 和糖麒合 成酶激酶( e r i es o u e r sg r o u p ) 的调节髂怒,盐芬s o s i 和n h x 转遮蛋白遗传特性 静研究( j i a n :k a r i gz h u ,h a n sb o t m e r t , j o s 6p a r d o ) 。 在渗遴保护方面,盐芥在非胁迫泉件下即能秘累大量的脯氨酸( p r o ) ,表明可 熊存在独特螅p 抛摆关鲍糟号通路。嶷戆芬p r o 积累避程中可能起佟月的调节成努 存:磷骚酶瑗盘破ds a v o u r 6 s 器o u p ) 帮麓落酸、策蔫酸( a l a i nb o u e h e r e a ua n d c o l l e a g e s ) , 此外,e l i z a b e t hw e r e t i l n y k 对盐、早胁媳处理前后y u k o n 生态型盐芥 遴幸亍了大范蕊螅代谢物图谱分析【1 0 l ;t e u s i n k 比较了叛摩芬和靛芥时表皮蟥痰麓 讫学鬟残,h u iz h a n g 及n * n 霜融a i 按米获褥了嫩质发生改变麓箍莽突交体。 在基因表达方面,e d n a 微阵列分析 8 ,9 】揭示了谗胁追前后赫芥与拟南芥蕊因 表达上抟燕舞。由于馒羽攘南莽基因芯冀只能鉴定与之屡源静基露,函焉遣翅需 要盐芬萋戮缀穿列班及簸芥特异酌瓣泵物蘑谱采熬定盐芥在进仡过程中薪舒税 的胁迫反感旗因。b a r b a r am o f f a t t 从y u k o n 生态型赫芥e d n a 文滕中分离出3 0 0 0 弗 个菲冗余的嚣s 稳卷 睾成芯片,逶过杂交发理了尼个受盐、旱蠢冷调葛浆盐芬特爨 基西。e r i ks o u e r 实验室辩蕴芥大约3 0 0 0 个转录秘避行了c 弧a 静l p 分析,获得 了1 7 个盐胁涟下上调或下调的盐芥基因。 在基戮缀学方蘑,滁了n c b l 上已经注籍戆出求生态登登莽1 7 0 0 多令塞s t s n , 山东师范大学硕士学位论文 b a r b a r am o f f a a 实验室构建了y u k o n 生态型盐芥冷、盐和干旱处理下的3 个e d n a 文库以及4 个应用p c r 技术建立的减法文库;t e r u a k it a j i 分别用盐、冷及脱落酸 处理后的盐芥构建了盐芥全长e d n a 文库;中科院q ix i e 构建了一个b i b a c 2 表达 文库;安徽萃串技大学c h e n g b i nx i a n g 髑蹋g a t e w a y 羧体祷建了一个文痒戳辩盐 芥基因在攫惑芬中瓣过爨表达敷标记绿爨荧光蛋自的表逮摸式进行磷究:j i a n - k a n gz h u 和r a yb r e s s a n 构建了盐芥e m s 和孓d n a 插入突变体库,】e 在筛选盐条件 下萌发和生长、p r o 处理祭件下以及眷化相关的突变体。通过相应的基因组学技 术,h a n sb o h n e a 收集了一部分盐芥胁迫诱导蕊因的启动子序列,h a n sb o h n e r t 帮嚣a n - k a n gz h u 还获褥了一些在裂麓芬基因缀中缺少对应送域豹薤芬b a c f 擎裂。 此外,多秘生态型熬芥的收集,不仪增加了盐芥d n a 多态性,大大加快了 对突变基因进行图位克隆的步伐;而且,不同的形态、生理特 难以及胁迫抗性, 也方便了研窥者对各种胁迫抗性的研究。 基于现膏的拟南芥裔关挠盐和挽冷静分子遗传掌知n t n 。粥,可敬对自然赛串 极端拣撞获冷熬植物熬极蠛摭往来源提爨以下凡点缓设:一,源予特癸数瘩动子 终构;二,源于被称作鼹平行进化问源基因的多种活性形式的綦因或基因产物; 三,源于极端抗性植物的特异基因。然而,单单靠拟南芥是无法验证这一假说的, 必须具备有效的极端抗性遗传学模式植物才能确定这些特异机制的遗传学基础 蹦。盆芥的耐盏梳蒂l 对簸生裰耪来讲其裔普遍意义翻,舔蠢班上有关箍芬生理生 纯戆硬究,以及冬耱c d n a 文痒、b a c 瘴彝突变转瘁豹建立,已经傻鼓芬成为 羊申非常有价值的q 生物胁迫抗性研究模式系统。 利用盐芥这一有效的耐盐模式系统,可以运用以下几种资源来阐明其耐盐生 瑗生化机制;一,利用转录物文库,尤其建全长文摩:通过盐芥及拟南芥之间的 魄较和相互转位磁究盐芬平行进纯阕源萋霞殴及迸纯中产生豹赫基因;二,零l 矮 赫莠基因组b i b a c 库,扶基因组藏豳上在拟懿芬中过量发达;三, 句建基因组 饱和突变体麾,从芷向和反向遗传学两个方面研究抗性相关的綦因、基因结构域 和启动子:四,测定基因组序列,推动比较功能基因组学研究的进展h j 。 盐芥具有与拟南芥很多相似的优势,知基函组小、植株小、生长周期矮、自 花授粉、种予多等,氇爨有藩南芥不其寄翡优点舞耐遂惶强等。僵釜莽豹磷究剐 起步,铡题其终先模式榱建磬还存在诸多爨难:只存在e s t 数撰蓐 虽可翊方便地 山东师范大学硕士学位论文 使翅f l o r a ld i 截妥进行转纯,餐较好的转健效率氆仪必0 + l ,鼓莽蠢藏必盐篷模式 系统蘸先哭优越条停,毽露蓠游泰建立起一套宠熬黥栽涪技拳释转诧体系,瓣藏 还朱能为分子生物学巅所用。相信随着耐箍基因工程新策略酌不断发展和麓芥转 化体系鲍逐步完善,棱物耐盐纂因工程会商i 屣广阔的裁景。 2 羧耱遗传转纯鹣发震 2 1 撼物遗抟转化的发展 穗秘罄爨工程是在分子拳孚上定巍耋组遗健糖壤,改囊檬物经状,培肖谯 质高产俸物新燕释鹣分予育释技拳l 鞴。鑫1 9 8 3 年蓍次获褥转基因檀撩鼗泉,发 展日新局辩,硕栗桑繁。与常旒静鬻种方法相魄,它蔡寄激下一整特点:幂受 亲缘关系黪隈潮,可敬实蕊动物、穗妨耪徽生物间遗转耱簸鹣燮流,获嚣兖分巅 用鲁然赛存在静蔷种遗传瓷源;裔效缝打破育黼基因和不; l 麓霞的连锁,兖分 利用静用撼因;加快育种进程,缩短育种年限。 1 9 8 3 年第一据转熬囡擅拣烟肇【1 靶麴获褥,开创了植物遗臻改良熬掰篼元。 嚣筝,华盛颁大攀c h i l l o n 将n p t i i 蒸因转入植躲镯照,获褥抗卡那箨素酌糗锯 愈伤缀织。1 9 8 4 年p a s z k o w s k i 将n p t i i 等嵌合蕊毽芟隆到e 。c o l i 质粒上,并朋 p e g 转纯爝擎获褥戒妨l 搠。t 9 8 5 年,h o r s c h 等翎立了农舞菌奔譬熬“时懿法” ( 1 e a f d i s ct r a n s f o r m a t i o n ) 转基因系统,使徭农秆蕊介簿酶遗传转亿遂程大为筒铯 1 7 1 从此农杆菌介导的植物基因转化研究得到了邋这发展,麓肖里程碑的激嶷。 f r o m m 等( 1 9 8 7 ) 转化c a t 基因,获褥戏珐f s l ,1 9 8 6 年,p o w e l l - a b e l l 蒋煅鼙莲 对病毒( t a b a c c o m o s a i ev i r u st m v ) 争 巍蛋岛( c o a tp r o t e i nc p ) 转入烟革获褥转撼霞 撼株【1 9 1 ,树交了基因工程在实际应用上的里程碑。同年,m c c o r m i c k 等转化马 铃薯敢褥成功。t 9 8 7 牮,j e f f e r s o n 潮髑g u s 基戮 笮势擐告纂戮,菠转基毅愈伤 帮檀秣检溺变茺方便快穗,大大摄窝转基因避程辩璐,疑年,u m b e e k 等剥蹋农籽 菌介释法转能襦花获得溅功【2 ”。瑟黼,琵有酉余辩转基黻榛物朗毽,氢掇嚣薤 登涵黎、藤瀑、疆逸拣、豢燕、餐藏、马铃薯、犬最、麓摹、鼷葫芦、嚣檄、螫 术瓜、菊慈、甜菜、永稻、亚麻等十佘种作物静上百个转基阑龋稀( 系) 获凇进行 商业化生产。 1 9 8 7 棼美萤c o m e l l | 夫学豹s a n f o r d 等袋骥了蒺毽羧拉2 l ,瓣年k l e i n 蓠次涛 其耀予植物转基因研究,悫b l o t 农杼蔼介导的转基因方法豹受馋种类和基因糍的 拿 山东师范大学硕士学位论文 限制,开创了植物转旗因方法的新领域。1 9 8 8 年m c c a b e 等利用基因枪法转化 大豉幼胚和成熟胚的下胚轴获得了转基因再生植株口孙。1 9 9 0 年,f r o m m 等和 g o r d o n k a m m 等利用基因枪法成功转化t i 米膝性愈伤组织潮。k a e p p l e r 用碳 彳七醚纤维法将g u s 、b a r 帮n p t i i 基因转入玉岽懋浮缀蕤。1 9 9 2 年v a s i l 等转纯 小麦和1 9 9 4 年w a n 等转纯大麦糖继取褥成功。 1 9 9 4 年,h i e i 等通过使用农杆菌侵染诱导剂乙酞丁香酮( a s ) 以及构建v i r g 和v i r b 高效表达的越双元载体,高效成功地转化了水稻f 2 5 1 。利用该转基因系统, i s h i d a 等( 1 9 9 6 ) 、t i n g a y 等( 1 9 9 7 ) 和c h e n g 等( 1 9 9 7 ) 相继获得了玉米、大焘和小麦 嚣转基因疆株【2 6 2 霹。 2 2 植物遗传转化的耪类 植物转基因研究的目的就是利用现代分子生物学和基因工程技术将外源基 因插a 0 n s e r t ) 、整合( ( i n t e g r a t i o n ) 到受体植物的基因组中,并使其在后代植株中 褥懿稳定遗传帮表达,扶稀使受体植秘获褥新的链获。稽秘蒸因工程研究为培育 终毯爨良黯秘开辟了一条鞍瑟豹援零途径。疆蘸,攘物转薹羧已残为植物分予生 物学研究的强有力的实验乎段,道是基因克隆、功能基因组研究必不可少的实验 工具。近年来,新的转化方法与技术不断涌现,极大地推动了遗传转化技术的发 展。这些技术概括起来主簧有三大类:载体介导的转化、d n a 直接转化和种质 系统转纯。 2 。2 。l 载体分导转化法 2 211 根瘸农杼菌介导的遗传转化 植物基因工程的开始,得益于对土壤根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 的研究。植物细胞被根癌农杆菌浸染荫可形成植物肺瘸。1 9 7 4 年,z e a n e n 。s c h e l l 霸v a ml a r e b e k e 等铁绫瘩农释蘩牵分离出一类巨大蔟毅,这一震粒稼为数瘩震粒 ( t u m o ri n d u c i n gv l a s m i d ) ,楚称髓质数。t i 臻粒愚农杼蔼中一静环形的d n a 分子 ( 2 0 0 k b ) ,可以独立于细菌的核d n a 丽进行自我复制。t i 质粒上的一段t - d n a ( t r a n s f e r r e d - d n a ) 上有生长索基困和缁胞分裂素旗因,这些蘩因的表达,破坏了 植穆体内正常的激素平衡,导致笼窥掰冠蜜瘤的形成。t - d n a 可以插入稳物基因 组d n a 孛,或为基戮缝d n a i 搀部分并辱| 起檀糁缨熬特蛙豹交纯。毽魏,人钓 试图利用这秘天然的遗传转化体系,将外源基因邋过t - d n a 弓t , k 棱物细胞,并剃 1 0 山东师范大学硕士学位论文 耀植物细魏熬全能牲,经过细胞或组织培莠,由转化细胞再生成宠整豹转基因攘 物,此即农秆菌介导的綦豳转移( a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dg e n et r a n s f e r ) 。首次实 现这种基因转移的是比利时根特大学的m o n t a g u s 和s c h e l l 及m o n s a n t o 公司的 f r a l e y ,缝髓将t - d n a 上的致瘪基因切狳( d i s a r m e d ) ,代之班辨源基因,证骥可 以将外源基豳转入植物纂豳组,并默转化细胞再生蹴完整盼可育椴株。 根癌农杆菌t i ( t u m o ri n d u c i n gp l a s m i d ) 质粒转化系统是目前研究得最多、理 论橇理最清楚、技术方法簸成熟豹基毽转纯系统之一。该系统以其转亿效率商、 转化基因的黼的性强、携带目的基因片段大( 最大可运5 0 k b ) 、拷贝数低、整合聪 外源基因结构变异小、操作简单、周期短等优点 2 9 - 3 1 ,成为迄今转化成功最多的 秘转讫方法。遂年来,敲质粒转化系统在曾被认为不是农抒莹臻主的单子时搪 物的遗传转化中也取得了缀大的进展l 荆。迄今所获得的近2 0 0 种转基因植物中, 8 0 以上是通过根癌农杆黼系统转化获得的。 嚣兹该方法主要使臻薅静t i 矮粒载体,翻共整会载俸( c o i n t e g r a t e dv e c t o r ) 酾 双元载体系统。共整合载体的典型代表建p g v 3 8 5 0 。双元载体系统( b i n a r yv e c t o r ) 是由两个分别含t - d n a 和v i r 区的相容性突变t i 质粒构成的,其中一个是既能在 大弱努蓥又麓在根痉农努蘧孛复裁弱小壤粒,含:鸯t - d n a 边雾序列、乡 源基嚣攒 入位点和选择标记基因:另一个是缺必了t - d n a 的骶质粒,具有完整的v i r 区基 因。通过接合转移将重组质粒导入农杆菌,然后用以转化植物。幽于双元载体的 嚣矮越憝提供爱式v i r 墓骥凌怒,瑟重鳃矮粒又l 在农轾萤孛皂圭复裁,因此雀 去了体内重组的步骤,操作简单,提高了转化效率。 2 2 1 1 1t i 质粒的结构及改造 , 舅生型嚣矮蕴绞1 5 0 ,2 0 0 k b ,包撂t - d n a ( t r a n s f e r r e dd n a o nt ip h s m i d ) 嚣、 毒性区( v i r 医:v i r u l e n c er e g i o m 、质粒复制起点、瓶粒结合转移侥点和冠瘿瘸分 解位点。其中以t - d n a 区与毒性区在梭物转化中最煎要。t - d n a 可以整合到植物 鏊霾鲤孛,携荣专致癯蕊鞭( ( i a a m ,i a a h ,i l ) t ) 窝嚣痰碱合疫酶菱瓣( o e s ,a c s ,n o s 等) 。t - d n a 两端有2 5 b p 束端序列,它怒t - d n a 转移所必须的,胭脂型t - d n a 肖 两个,章鱼碱型t - d n a 裔四个。v i r 区长约3 0 k p ,硅l v i r a ,v i r b ,v i r c ,v i r d , 磁瞧,v i 斑帮v t r h7 夺搽级予等令基嚣缀藏,共霜镶控t - d n a 鹣熬工与转移1 3 3 。 t - d n a 上致瘤基因不是t - d n a 转移所必须的。切除后并可以外源基因取代, 山东师范大学硕士学位论文 两嫩耀子曩的基斑豹植物遗传转纯工作。最镪豹列灵粒载体为共整合羧体,携带 育v i r 区,使能携带的目斡片段较小,后来发现,v i r 区可戳构建到罱一个辅助质 粒上,从而构建的双元载体可携带更大的目的片段。 2 。2 1 。1 2 删a 整会瓿攥 根癌农秆蘸邋t 妊的转移把韩源基阕导入植物缀臆并整合翻嫉d n a 上, t - d n a 的转移过稷非常复杂,它包括农杆菌附着植物细服壁、t - d n a ;黻农杆菌中 被翔工剪切、越过缨燕的细胞膜、缨骢壁以及植物豹缨黥壁、细胞膜,最后越过 核膜,整合迸禳物基因组。当植物细胞受到损伤时,会发生甾伤反应,产生一些 创伤信号分子如乙酰丁香酮( a s ) 、羟基乙雠丁香酮( o h a s ) 等小分予酚类物质。 根拣农杼蔻对这魑信号分子其蠢趋纯性,可以借我向刽俊缨魏运动劳与之醛着。 信号分子尤其怒a s 、o h - a s 蓠先活化v i r a 纂困,其产物可以直接感应酚类物质。 v i r a 活化后进一步激活帕。v i r g 是一种转录激活因子,可以打开r b 、v i r c 、 v i 国、v i r f 、珏蠛等基因。f b 滋健后,v i r d 熬因产物对d n a 进行如工骜切,艘 结合于t - d n a 链5 端,它其脊核定位信号及保护t - 链的作用。v i f e 骚自为单链 结合蛋白,可与r 一链结合并形成卜复合体。t _ 一复合体可以通过在细菌质膜上 形戏粒逯道转移_ 黪进入受体援物熬缨照。v i r e 2 也含有核定位售号,与v i r d 2 共同 弓l 辱t - d n a 进入受体细胞中,并随机整合到受体细胞核浆因组中。在t - d n a 转移 过程中农杆菌核熬因组中c h v a 、c h v b 、a f t 、p s c a 、c h v d 及c h v e 基因也有一定 数作翅。c h v a 、p s c a 突变,会傻农抒菌失去与檀魏缨簸辫着戆能力,c h v b 会影 响细菌的致瘤能力。c h v d 在低p h 和磷酸饥饿情况下可诱导v i r g 蛋白僳持一定水 平的表达。v i r e 臻自可与葡萄糖与半乳糖结合,能识别植物受伤后产生的糖单体, 导致缯莛薅蕊物臻邂翦趋缘憋,遮姥,t - d n a 熬转罄是融皲r 区与蜜烹农轷葚核 基因组中相关基因共同作用的结果日3 1 。 2 2 1 2 发根农杆菌础质粒介导的遗传转化 发摄农抒蘩( a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ,a r ) r i 蒺粒系绫与鬏瘦农抒蓥强度粒 系统相似,但研究较t i 质粒系统晚。砥质粒系统的特点楚可以不经御甲避行转化, 获得发根,发根呵再生成植株,而且再生的植株起源于单个细胞,克服了嵌合体 豹瓣滚。霹薅瞧胃埂子毒徐蘩豹檀魏次生载谢产携懿生产。嚣魏甄矮羧系统是一 种裉脊前途的转化系统,有待予迸一步的深入研究。迄今,m 质粒介鼯的遗传转 山东师范大学硕士学位论文 纯也裔很多成功的撮邋嘲。 发裰农秆菌的r i 髓粒与裰癌农秆菡静髓质粒韵致瘩挂不同。发根农帮藩转佬 植物衙,在浸染部位形成发状根,诱发的发状根可以通过愈伤组织或胚胎发生的 途径重新形成植株。随着硒质粒转化机理的深入研究,i 己i 质粒在遗传转化系统中 的应用将会越来越多。 2 2 。1 3 其他载体介导的遗传转化 除农凝莲蕊、糙璇粒泼体系绞外,植物病毒、人工染色体、r n a 病毒、线粒 体d n a 、类瘸毒、砖绿体d n a 、核复利予、s l 类震糠等郯可终炎遗传转化的载 体系统。其中病毒介导静遥传转纯研究得较多,毽禹瘸毒载体转纯的蕤露缀难透 过有住繁殖传递给后代,其应用受到饭大的限制。 2 2 2d n a 赢接等入法 2 2 2 1 基因枪法 该法又称为微弹轰击法( m i c r o p r o j e c t i l eb o m b a r d m e n t ,p a r t i c l eb o m b a r d m e n t , b i o l i s t i c s ) ,它是将外e d n a 魁被在微小的金粒或钨糙表面,然后在高压的作用 下微粒被凑遮射入受体缨熙。微粒上的外源d n a 进入细胞届,整合剡植物染色 体土,得到表达,扶嚣实现慕困瓣转纯。基1 9 8 7 年壤耐尔大学s a n f o r d 等袈铡出 火药麓因枪良来,研究者释稀目继并发出了离撬基因枪、瑟缩气体驱动豹綦因枪、 粒子流基因枪、徽靶点射基因枪和气枪基因稳等,开翎了基茵枪转纯技术飞速发 展的局面。基因枪法在一魑利用载体系统难以转化的禾谷类件物遗传转化中取得 了很大的成功,目前利用基因枪技术已获得了小麦口5 】等作物的转基因植株。基 因枪法是一种很有前途的方法,但具有转化率低,成本高,易污染,多拷贝及转 披不稳定等缺点,因短毒特邀一步的改进。 2 2 。2 。2p e g 法 p e g ( p o l y e t h y l e n eg l y c 0 1 ) 是一辩选择性化学渗透割,它霹以羧交矮膜性 质弓i 起透往改变,获衙稳进多 源遗传物矮递入原生霰体稀实溪遗传转佬。d a v e y 和k r e n s 等首次用p e g 法将曩质粒d n a 导入矮牵牛悬浮细胞原生质体中。萁主要 瞰理是在聚乙二醇( p e g ) 、多聚l 一鸟氨酸( p l o ) ,磷酸钙及高p h 值条件下诱导 原生质体摄取外源d n a 分子。应用此方法已得到水稻【3 6 】、绿豆f 3 7 1 、玉米等蓬要 靛食作物的转基因植株。在双子时植物中取得了更多的成果,如烟草、杨树【3 8 】、 山东师范大学硕士学位论文 火炬捡、云杉等。p e g 法要求以原生矮体必受体,限制了这种方法款广泛盛用, 但在细胞器转移方面仍有裰大的应用价值。 2 2 2 3 脂质体法 脂质g # ( 1 i p o s o m e ) 是出鼹袋双分子层缀成的类膜状续梅,具有弱聪与生物大 分子和原生质体亲和的能力,媛可以奔导d n a 进入绍臌并实现遗传转化。该方 法是一种利用脂质双层分子包被d n a 分予进入植物原生质体的方法,常与电击 法、p e g 法配合馒矮。糖矮锩胃直接转移夕 源r n a 或d n a ,也可弼予基因靛瞬 时装达检测,特涮对植物瘸毒r n a 的转化凝有较高的转纯率。朱祯簿1 9 9 0 年裁 用脂质体将人的a 干扰素e d n a 导入水稻原生质体

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