五种烟草病毒.ppt

五种烟草病毒TMV、CMV、TEV、PVY及TVBMV的多重RT-PCR同步检测,植物病理学报ACTAPHYTOPATHOLOGICASINICA41(2):146-153(2019),介绍,烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus；TMV），又译为烟草花叶病毒，是一种RNA病毒，专门感染植物，尤其是烟草及其他茄科植物，能使这些受感染的叶片看来斑驳污损我国烟草病毒主要有烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯Y病(PVY)和烟草脉带花叶病(TVBMV)，通常发生复合侵染。本研究对我国5种烟草病毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物，建立了能同时检测TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV的多重RT-PCR检测体系。对田间样品检测结果证明，多重RT-PCR体系能够同时检测5种病毒，并且灵敏度高,目前检测手段,目前检测烟草病毒的主要方法有电镜法、血清学鉴定以及PCR技术。其中PCR技术具有快速、便捷、灵敏度高和特异性强等显著优点。多重RT-PCR技术：多重PCR是在同一反应体系中加入两对以上特异性引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，具有高效性、系统性和经济简便性等特点，现在已应用于基因诊断和病原微生物的检测与鉴别。,检测步骤,11病毒总RNA的提取TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV核酸均为线状单链正义RNA。植物总RNA的浓度及纯度是影响RT-PCR检测的关键因素，其提取方法有十二烷基硫酸钠和硫氰酸胍抽提等，但是这些方法中提取缓冲液的配置操作繁琐，提取过程耗时长，容易造成总RNA降解。为高效、快速提取植物总RNA，并对植物病毒进行PCR检测，本研究用Biozol试剂盒提取烟草总RNA，并进行多重RT-PCR同时快速检测TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV等5种主要烟草病毒,检测步骤,12引物的设计与筛选应用PrimerPremier50引物设计软件分别设计这5种病毒的特异引物TMVcpF/TMVcpR、CMVcpF/CMVcpR、TEVcpF/TEVcpR、PVYcpF/PVYcpR和TVBMVcpF/TVBMVcpR。由于多重RT-PCR要求在同一退火温度下同时扩增多个目的片断，因此对设计的大量引物进行筛选，选择Tm值较一致的各对引物，以保证在同一退火温度下同时检测到TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV这5种病毒,检测步骤,1.3单重RT-PCR用M-MLV反转录酶反转录合成各病毒cDNA第一链25LPCR标准反应体系:143LddH2O，25L10PCRbuffer750mmol/LTris-HCl(pH88)，200mmol/L(NH4)2SO4，01%Tween20，2L25mmol/LMgCl2，2LdNTP(各25mmol/L)，1L上游和下游引物混合物(各10mol/L)，02LTaqDNA聚合酶(5U/L)和2LcDNA模板。PCR反应循环参数:94预变性3min;94变性30s，48退火30s，72延伸1min，循环30次;72延伸10min。取5LPCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析比较,单重RT-PCR电泳检测结果以TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV5种病毒的反转录产物作为PCR反应的模板，经PCR扩增分别得到大小为237、273、347、456和547bp的5条特异性条带,检测步骤,1.4多重RT-PCR多重RT-PCR反应体系:取TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV5种病毒的混合病株提取总RNA，反转录合成cDNA，将RT产物随机混合作为多重RT-PCR反应的模板，将各病毒特异性引物同时加入一个反应管进行PCR反应。退火温度分别选择42、45、48、51、54和57;延伸时间分别为40、50、60、70、80和90s;循环次数选择20、25、30、35、40和45个循环进行多重RT-PCR体系优化,优化后的5对引物比例为TMVCMVTEVPVY:TVBMV=1.41111.5，5种模板的比例为TMVCMVTEVPVYTVBMV=1411116。结果显示，退火温度在48和51所获得的目的条带相对较好。延伸时间在60和90s能获得理想的结果，而且40、50、70和80s之间没有明显的差别(,检测步骤,1.6PCR产物的克隆和测序多重RT-PCR扩增DNA靶片段采用H.Q.Q.凝胶回收试剂盒回收纯化后，纯化的PCR产物与pMD18-Tsimplevector4过夜连接，采用CaCl2法制备大肠杆菌JM109感受态细胞，连接产物转化大肠杆菌JM109，用Amp抗性和半乳糖苷酶的底物X-gal进行蓝白斑筛选。阳性克隆经菌落PCR和限制性酶酶切分析进一步筛选后，提取质粒委托金思特科技(南京)有限公司测序。,病毒混合侵染烟草的检测,20192019年对陕西泾阳、乾县等烟区进行采样调查，样品检测结果显示:烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯Y病毒(PVY)和烟草脉带花叶病毒(TVBMV)都有发生，且多为复合侵染.采集复合侵染的烟叶进行多重RT-PCR检测，结果显示烟草中2种、3种和4种病毒复合侵染都存在。,小结,一直以来多重RT-PCR灵敏度没有单重RT-PCR高。本研究针对影响多重RT-PCR的引物浓度、Mg2+浓度和退火温度等方面进行优化。研究发现，引物设计是多重RT-PCR中非常关键的一步。引物的选择对实验的成败起着关键作用，既要使引物具有特异性，又要避免引物之间的相互影响，同时要尽量使各对引物的退火温度相一致。通过Blast在线序列比对调整引物，使各条引物之间尽量不存在互补，有效减少了引物二聚体的存在。设计引物时使各对引物的Tm值较一致，保证在同一退火温度下同时扩TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV5种病毒DNA扩增片段的大小是影响多重RT-PCR的另一个重要因素，若片段大小差别过大会影响到片段延伸时间的设定，因此本研究扩增5个片段大小选择在200500bp之间。由于多重RT-PCR需要在同一体系中同时扩增出多条片段，扩增片段的大小存在差异，再加上不同引物的特异性程度不尽相同，因此引物浓度和模