（药理学专业论文）jnkcjun通路对bh3only蛋白hrk和bim的调控.pdf

! 当查兰堡主兰丝笙奎型鉴堡! ! ! 望堕翌! 坚：! ! 生兰宴坚壁塑! 塑塑塑丝 黜j u n 通路对b i - 1 3 - o n l y 蛋白l ：i r k 和b i m 的调控 专业名称：药理学 申请人姓名：王传付 指导老师：黎明涛教授 摘要 j n k c j u n 通路在神经元凋亡中起关键的作用。b h 3 o n l y 蛋白h r k 和b i m 在 促发线粒体释放c y t o c 的凋亡信号放大中起重要作用，而在神经元它们的转录 调节尤其重要，因为在存活神经元中它们的基础表达水平很低，而在神经元凋亡 时被诱导表达。虽然有人报道在小脑颗粒神经元凋亡模型中j n k 通路和h r k 、 b i m 之间的调节关系，但其在文章中只用了一个j n k 通路抑制剂，且没有用转 录因子c j u n 的负显性突变体迸一步研究y n k 通路对h r k 和b i m 的调控。为了 研究这个问题，我们使用了j n k 通路不同层次激酶的抑制剂来研究j n k 通路和 b h 3 o n l y 蛋白h r k 、b i m 之间的调节关系。资料显示j n k 通路抑制剂部分地阻 断了h r k 转录，提示j n k 通路部分介导了h r k 的表达。而b 硫却不受其转录调 节。为了研究弘j u n a p 1 活性是否介导了b h 3 o n l y 蛋白i - i r k 和b i m 的表达，使 用了负显性c j u n 腺病毒( a d f l a g a1 6 9 ) 研究c j u n 对它们转录调节。结果表明 表达负显性c j u n 没有抑制b h 3 - o n l y 蛋白h r k 和b i m 的表达。本研究证明 c j u r d a p 1 活性不介导h r k 和b i m 的诱导表达。 1 低钾诱导了h 和m m 的表达。 中山太学硕上学位论史j n k c - j u n 通路对b h 3 o n l y 蛋自i - i r k 和b i m 的调控 为了研究b h 3 o n l y 蛋白h r k 和b i m 在小脑颗粒神经元低钟凋亡模型中的表 达情况，我们通过半定量r p c r 和w e s t e r nb l o t 检测它们m r n a 和蛋白质水平 变化。体外培养七天的分化成熟的小脑颗粒神经元，去除残留血清后，分别用含 2 5 r a m 氯化钾( 2 5 k ) 和5 m m 氯化钾( 5 k ) 培养基孵育2 h 、4 h 、8 h ，收集总 r n a 和蛋白。结果发现，b h 3 一o n l y 蛋白h r k 和b i m 的m r n a 在低钾时诱导表 达增加。b i m 的蛋白质表达也相应增加，与b i m 的m r n a 诱导表达相适应，提 示b i m 蛋白质表达是由转录激活引起的。表明在小脑颗粒神经元低钾诱导了h r k 和b i m 的表达。 2 阻断j n k 通路部分抑制了h 一【的表达，而不能抑制f i l m 的表达。 为了研究j n k 信号通路对b h 3 o n l y 蛋白表达的影响，我们研究了在j n k 通路抑制时的低钾模型中b h 3 o n l y 蛋白h r k 和b i m 的表达变化。小脑颗粒神经 元体外培养七天，分别用2 5 k 或5 k 或5 k 中加入不同浓度的j n k 通路抑制荆： s p 6 0 0 1 2 5 ，1 0um ，c e p l l 0 0 4 2um ；s b 2 0 3 5 8 0 ，5 0um 处理4 h ，收集总r n a 和蛋白，做半定量r t - p c r 和w e s t e mb l o t 检测h r k 和b i m 的表达差异。结果显 示h r k 的m r n a 表达水平被j n k 通路抑制剂部分地抑制( 抑制后的m r n a 水 平和2 5 k 及5 k 的m r n a 相比较) ，而b i m 的m r n a 和蛋白表达水平丝毫不被 j n k 通路抑制荆所抑制，提示j n k 通路部分介导了l - i r k 的表达，而没有介导b i m 的表达。这说明，虽然h r k 和b i m 都被低钾所诱导，但调控它们表达的信号转 导通路不同。 3 、r k 和m m 的表达不受e - j u n a p - 1 调节。 c j u n 是凋亡时的一个重要的转录因子，那么b h 3 - o n l y 蛋白h r k 和b i m 的 表达是否受c _ j u n 的调控呢? 体外培养的小脑颗粒神经元在培养第五天时感染表 达c - j u n 负显性突变体的病毒( a d - f l a g 1 6 9 ) ，同时用a d - g f p 作阴性对照，3 6 小时后分别用2 5 k 、5 k 处理4 h 。结果发现，过表达e - j u n 负显性突变体不能抑 制低钾诱导的h r k 的m r n a 水平，同样c j u n 觅显性突变体对b i m 的m r n a 和 中山大学硕士学位论文 j n k c - 2 u n 通路对d h 3 o n l y 蛋白h f k 和b i m 的调挣 蛋白表达水平也没有抑制作用。作为转录因子c j u n 靶基因的阳性对照，c j u a n 的 m r n a 和蛋白水平可被c j 吼负显性突变体抑制。表明c j u r d a p 1 活性不介导 b h 3 一o n l y 蛋白h r k 和b i m 的表达。 结论 在小脑颗粒神经元低钾凋亡模型中： l 、h r k 的表达部分地被j n k 通路阻断剂所抑制，而b i m 的表达却不被j n k 通 路阻断剂所抑制。 2 、h r k 和b i m 的表达不被a p 1 活性调控。 关键词：小脑颗粒神经元凋亡h 矾mm i x 孙澉c - j u na p - i d o m i n u t - n e p t t v ee - j u n 硪 主虫盔兰堡主兰堡丝苎 型苎型塑垄墅翌! 曼：竺垒墨鱼! 坠塑! l 竺丝塑丝 t h ei n d u c t i o no f b h 3 一o n l yp r o t e i nh r kb u tn o tb i mi s r e g u l a t e db y , i n kp a t h w a y m a j o r ： s t u d e n t ： m e n t e l r ： p h a r m a c o l o g y c h u a n f uw a n g m i n g t l i ol i a b s t r a c t t h eb c l - 2f a m i l ym e m b e r sp l a yc r u c i a lr o l e si nn e u r o n a la p o p t o s i s a sm e m b e r s o fb h 3 一o n l ys u b f a m i l yp r o t e i n ，h r ka n db i m ，t h e i rt r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o ni s e s p e c i a l l yi m p o r t a n ts i n c et h e ya r ei n d u c e di nc e r e b e l l a rg r a n u l en e u r o n s ( c g n s ) u n d e r g o i n ga p o p t o s i so rf u n d a m e n tl e v e li sv e r yl o w i tw a sr e p o r t e dt h a tt h e yw e r e r e g u l a t e db yj n ks i g n a l i n ga sc e p l 3 4 7 ，am l ki n h i b i t o r , c o u l dp a r t i a l l yb l o c k e d b h 3 一o n l yp r o t e i n - i r ka n db i me x p r e s s i o n si nc e r e b e l l a rg r a n u l en e u r o n s t ov e r i f y t h ei s s u ei nc e r e b e l l a ro r a n u l en e u r o n su n d e r g o i n ga p o p t o s i s ，w ei n v e s t i g a t e dt h e r e g u l a t o r yr e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h e mb yi n h i b i t i o no fj n ks i g n a l i n gu s i n gs e v e r a l d i f f e r e n tl e v e ll d n a s ei n h i b i t o r so f j n ks i g n a l i n gi n c l u d i n gc e p l l 0 0 4 ，s p 6 0 0 1 2 5a n d s b 2 0 3 5 8 0 i tw a ss h o w nt h a tj n ks i g n a l i n gi n h i b i t o r s i n c o m p l e t e l yb l o c k e dt h e i n d u c t i o no f h r k ，i n d i c a t i n gt h a th r ki sp a r t i a l l yr e g u l a t e db yj n ks i g n a l i n g b i mw a s n o ti n d u c e db yj n ks i g n a l i n ga ta 1 1 t of t l r t h e r s t u d yw h e t h e rc - j t m a p 1 i s i n d i s p e n s a b l et ot h e i ri n d u c t i o n , w ed e m o n s t r a t e di t st r a n s c r i p t i o n a le f f c c to nt h e i r e x p r e s s i o n sb y m e a n so faa d e n o v i r u sv e c t o r e x p r e s s i n gd o m i n a n t - n e g a t i v e c - j u n ( a d - f l a g 1 6 9 ) o u rd a t as h o w e dt h a to v e r e x p r e s s i o no fc - j u nd o m i n a n t n e g a t i v em u t a n td i dn o tb l o c kt h ei n d u c t i o no fh r ko rb i m ，s u g g e s t i n gt h a t c j u r g a p ta c t i v i t yd o e sn o tc o n t r i b u t et ot h e i re x p r e s s i o n s 中山大学硕士学位论文 j n k c - j u n 嬗路对b h 3 o n l y 蛋白h r k 和b i m 的调控 i n t r o d u c t i o n c e l l sg a i nd i s t i n c tm o r p h o l o g i c a lc h a n g e sd u r i n ga p o p t o s i s ，i n c l u d i n gs h r i n k a g e o fc e l lb o d y ，n u c l e a rc o n d e n s a t i o n ，f r a g m e n t a t i o no ft h ed n ai n t oo l i g o n u c l e o s o m e ， a n db l e b b i n go ft h ep l a s m am e m b r a n e 【l 】a p o p t o s i si sac r i t i c a le v e n tn o to n l yd u r i n g d e v e l o p m e n ta n dt i s s u eh o m e o s t a s i sb u ta l s o i nt h ep a t h o g e n e s i so fav a r i e t yo f n e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e s h r k ，am e m b e ro fb h 3 一o n l yf a m i l yp r o t e i n s ，w a so r i g i n a l l y i d e n t i f i e di n s e a r c h i n gf o rb i n d i n gp a r t n e r so fp r o s u r v i v a lb c l - 2b yy e a s tt w o - h y b r i ds c r e e n i n ga h e l ae d n al i b r a r y i n o h a r ae ta lf o u n das t r e t c ho f e i g h ta m i n oa c i d s ，h r k 3 7 4 4 ，w i t h h i g hh o m o l o g yb h 3m o t i f h ef u r t h e rv e r i f i e dt h a tt h eb h 3d o m a i nw a sr e q u i r e df o r p r o a p o p t o t i ca c t i v i t yo fh r ku s i n gt h eb h 3d o m a i nd e l e t i o nm u t a n to fh r k ( h r k m u t a n tab h 3 ) p 1 a l m o s ta tt h es a m et i m eh r kw a sd i s c o v e r e dw h e ns c r e e n i n gf o r g e n e si n d u c e da f t e rn g f w i t h d r a w a li nr a ts y m p a t h e t i cn e u r o n s 3 1 h r ki sap r p a p o p t o t i cp r o t e i na n dp l a y sac r u c i a lr o l ei n a p o p t o s i s t h e p r o a p o p t o t i ca c t i o no fh r kw a sm e d i a t e db yam i t o c h o n d r i a lp o r e - f o r m i n gp r o t e i n p 3 2 ，w h i c hw a sa b r o g a t e db ye x p r e s s i o no fp 3 2m u t a n t sl a c k i n gt h en - t e r m i n a l m i t o c h o n d r i a l s i g n a l s e q u e n c eo rt h ec o n s e r v e dc t e r m i n a lr e g i o n o r b y s i r n a m e d i a t e dk n o c k d o w no fp 3 2 9 1 l o t so fi n v e s t i g a t i o ns h o w e dt h a th r ki sa n i n d u c i b l ep r o t e i n ，w h e no v e r - e x p r e s s e dh r ki n d u c e dc e l ld e a t hw h i c hc a l lb e p r e v e n t e db yc o - e x p r e s s i o nw i t hb c l 2a na n t i a p o p t o t i cm e m b e r i nav a r i e t yo fa p o p t o t i cs t i m u l ii - i r ki sf o u n dt ob eu p - r e g u l a t e d i th a sb e e n s h o w nt h a tt h ee x p r e s s i o no f h r kw a si n d u c e dw h e nn e u r o n se x p o s i n gt oab ，w h i c h c a r lb eb l o c k e db yn i f e d i p i n e ，a ni n h i b i t o ro fl t y p ev o l t a g e d e p e n d e n tc a l c i u m c h a n n e l ，a n dd a n t r o l e n e ，a ni n h i b i t o ro fc a l c i u mr e l e a s ef r o mt h ee n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ，s u g g e s t i n gc a l c i u ms i g n a lw a si n v o l v e di nh r k i n d u c t i o nt 4 1 p 1 3 kp a t h w a y , a ni m p o r t a n ta n t i - a p o p t o t i cs i g n a l ，h a sa l s ob e e nf o u n dt ob e i n v o l v e di nt h et r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o no fi - i r k t h ee x p r e s s i o np a ：t t e r no fh r ki n d e v e l o p i n gm u r i n en e r v o u ss y s t e mw a sa l s oi n v e s t i g a t e d i s s a n ze ta lf o u n dt h a th r k v 中出大学硕士学位论文 j n k j c - j t m 通路对b h 3 一o n l y 蛋白h r k 和b i m 的调控 w a si n d u c e dw h e na p o p t o s i so c c u r si nh e m a t o p o i e t i cp r o g e n i t o rc e l l si nt h ea b s e n c eo f i l 3 【6 】f u r t h e rs t u d i e sc l a r i f i e dt h a tas i l e n c es e q u e n c ec a l l e dd r er d o w n s t r e a m r e g u l a t o r ye l e m e n t ) l o c a l i z e di nt h e3 u t ro fh r kg e n eb i n d e dt oat r a n s c r i p t i o n r e p r e s s o rd r e a m ( d r e - a n t a g o n i s tm o d u l a t o r ) i nt h ep r e s e n c eo fi l 一3 ，w h i c hw a s p h o s p h o r y l a t e da n dp e r f o r m e di t st r a n s c r i p t i o n a lr e p r e s s i o nf u n c t i o ni nap i - 3 k d e p e n d e n tb u tn o ta k td e p e n d e n tm a n n e r t 7 1 d r e a mw a si n a c t i v a t e di nk 5 6 2c e l l l i n e st r e a t e dw i t hs t l 5 7 1 ，ab c r - a b lk i n a s ei n h i b i t o rt h a th a sb e e ns h o w nt oe r a d i c a t e h u m a nc h r o n i cm y e l o i dl e u k e m i ac e l l se f f i c i e n t l y 引i nf a s m e d i a t e dh r ke x p r e s s i o n d r e a l v lw a sc l e a v a g e db ya c t i v ec a s p a s e 3i nj u r k a tt - c e l ll e u k e m i a t 耵 e 2 f 1 ，ac e l lc y c l er e g u l a t o r yt r a n s c r i p t i o n a lf a c t o ri sa l s of o u n dt or e g u l a t et h e i n d u c t i o no fh r k i nn i h 3 t 3c e l l s ，h r kw a si n d u c e dw h e ne 2 f 1w a so v e r e x p r e s s e d b yi n f e c t e dw i t hr e t r o v i r u se x p r e s s i n ge r - e 2 f 1t r e a t e dw i t ho h t 【l o j f u r t h e r m o r e e n d o g e n o u se 2 f 1a l s oi n d u c e dh r ka n do t h e rb h 3 一o n l yp r o t e i ne x p r e s s i o n sw h e n n i h 3 t 3i n f e c t e d 、v i t i lh u m a np a p i l l o m av i r u sh p v l 6e 7 ( e r - e 7 ) p r o t e i nt h a td i s r u p t s r b e 2 f 1c o m p l e x i n c r e a s i n ge v i d e n c e ss u g g e s t e dt h a tl o s so fh r ke x p r e s s i o n a s s o c i a t e d 、v i mt h em e t h y l a t i o na r o u n dh r kt r a n s c r i p t i o ns t a r ts i t ei nc o l o r e c t a la n d g a s t r i cc a n c e ra st h ee x p r e s s i o nr e s t o r e db yt r e a t m e n tw i t ham e t h y l t r a n s f e r a s e i r d a i b i t o r ，5 - a z a - d e o x y c y t i d i n e 【l l 】 b i m ，a n o t h e rb h 3 一o n l yp r o t e i no fb c l - 2f a m i l ym e m b e r s ，a l s op l a y sap i v o t a l r o t ei na p o p t o s i s b ya l t e r n a t es p l i c i n gb i mh a st h r e ei s o f o r m s ，b i m e l ，b i m la n d b i m s b i m lw a sf o r m e db ys p l i c i n go u tt h et i i r de x o ni nt h em r n ac o m p a r e dw i t h b i m e l i l2 1 b i m sh a dt h em o s tp o t e n ta p o p t o t i ca c t i v i t yi nt h et h r e ei s o f o r m sb e c a u s e t h ee x o n4w a ss p l i c e do u tc o m p a r e dw i t hb i m l t h r o u g hw h i c hb i m e la n db i m lw e r e s e q u e s t e r e di nt h ec y t o s o lb yb i n d i n gt ol c 8o ft h em i c r o t u b u l a rd y n e i n m o t o r c o m p l e x 13 1 b i m 小k n o c k o u ts t u d i e sd e m o n s t r a t e da ne s s e n t i a lr o l e o fa p o p t o s i si n d i f f e r e n tc e l lt y p e so ra p o p t o t i cs t i m u l i o nt h eo t h e rh a n db i m - i 。k n o c k o u tc e l l s s h o w e dp a r t i a lb u tn o tc o m p l e t er e s i s t a n c et oa p o p t o s i ss u g g e s t i n go t h e rp r o t e i n s i n v o l v e di nt h ep r o c e s s b i mi su p r e g u l a t e di nm a n yc e l lt y p ea p o p t o t i cm o d e l si n c l u d i n gc g n sa n d s y m p a t h e t i cn e u r o n s p r e v i o u sr e p o r ts h o w e dp d k a k t f k h r l ip a t h w a yi n v o l v e d 肇l 中山大学硕士学位论文 j n k c - j u n 通路对b h 3 - o n l y 蛋白h r k 和b i m 的调控 i ns u p p r e s s i n gt h ei n d u c t i o no fb i mi nc g n sc u l t u r e di ns e r u ma n dd e p o l a r i z i n g p o t a s s i u ma n dn g fm a i n t a i n e ds y m p a t h e t i cn e b r o n s i n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o r - i ( i g f i1 b l o c k e d8 i mi n d u c t i o ni nc g n s l l 酣b i me x p r e s s i o nw a si n d u c e db y t r a n s c r i p t i o nf a c t o r f k h r l it h a tw a sd e p h o s p h o r y l a t e da n da c t i v a t e dv i at h e i n h i b i t i o no f p l 3 一ka c t i v i t yi nt h ea b s e n c eo f t r o p h i cf a c t o r f l s l b e s i d e s t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n ， s e v e r a l r e p o r t s s h o w e dt h a t p o s t - t r a n s c r i p t i o n a l m e c h a n i s m r e g u l a t e s t h e a p o p t o t i ca c t i v i t y o fb i m j n k p h o s p h o r y l a t e db i m e la t s e r 6 5 p o t e n t i a t i n g i t s a p o p t o t i ca c t i o n ，w h i c hw a s d e m o n s t r a t e db ys i t e d i r e c t e dm u t a t i o n f h l e r k ( e x t r a c e l l u l a rs i g n a lr e g u l a t e d k i n a s e m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ) p h o s p h o r y l a t e db i mo nt h r e es e r i n es i t e s ( $ 5 5 ，$ 6 5 ，a n ds l o o ) a t t e n u a t i n gi t si n t e r a c t i o nw i t hb a xa n dr e d u c i n gi t sa p o p t o t i c a c t i v i t yi nh e m a t o p o i e t i cc e l l s i nt h ep r e s e n c eo fi l 3 1 15 1 p r o t e o l y t i cc l e a v a g ei s a n o t h e rp o s t - 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j u nt r a n s c r i p t i o n a le f f e c to nt h ei n d u c t i o no fb h 3 - o n l yp r o t e i nh r ka n db i mw i t h d o m i n a n t - n e g a t i v ec - j t m i na d d i t i o n ，t h e yo n l ye x a m i n e dt h ec h a n g e si nt h em r n a l e v e l sw i t h o u tp r o t e i nl e v e l s i nt h i ss t u d i e sw ed e t e r m i n e dw h e t h e rj n k e j u n s i g n a l i n gi si n v o l v e di nt h er e g u l a t i o n so fb h 3 - o n l yp r o t e i nh r ka n db i mb ym e a n s o fs e v e r a lj n kp a t h w a yi n h i b i t o r s i n c l u d i n gc e p l l 0 0 4 ，s p 6 0 0 1 2 5 ，s b 2 0 3 5 8 0a n d a d e n o v i r u sv e c t o re x p r e s s i n gd o m i n a n t - n e g a t i v ec - j u ni nc e r e b e l l e rg r a n u l en e u r o n ! 坐盔堂堡主兰焦鲨壅 型坠! 型望堕整! 坚兰竺堡墨宴堡! 塑璺塑竺塑丝 r e s u i t s 1b o t hh r ka n db i ma r eu p - r e g u l a t e di nc g n sa p o p t o s i si n d u c e db yp o t a s s i u m d e p r i v a t i o n n e wm r n aa n dp r o t e i ns y n t h e s e sa r er e q u i r e df o rc g n sa p o p t o s i sa sa p o p t o s i s i sp r e v e n t e di nt h ep r e s e n c eo fi n h i b i t o ro ft r a n s c r i p t i o no rp r o t e i ns y n t h e s e s t o i n v e s t i g a t ew h e t h e rt h em r n al e v e l so fb i ma n dh r kc h a n g e ，s e m i - q u a n t i t a t i v e r e v e r s et r a n s c r i p t a s e p c ra s s a yw a sp e r f o r m e d r a tc e r e b e l l a rg r a n u l en e u r o n sw e r e d i s s o c i a t e df r e s h l yf r o m7 - d a y o l ds p r a g u e d a w l e yr a tp u p sa n dd i g e s t e di nt h e p r e s e n c eo ft r y p s i na n dd n a s ea n dt h e np l a t e da tad e n s i t yo f1 6x1 0 6 m li nb a s a l m o d i f i e de a g l e ( b m e ) c o n t a i n i n g1 0 f e t a lb o v i n es c d m na n d2 5 m mk c i ( 2 5 k + s ) a f t e rc g n sw e r ec u l t u r e di ns e r u ma n d2 5 r a mk c ii nv i t r of o r7d a y s ，c e l l sw e r e s w i t c h e di n t om e d i u mc o n t a i n i n g2 5 m mk c lo r5 m mk c ia tv a r i o u st i m e sa s i i l d i c a t e d t o t a lc e l l u l a rr n aw a se x t r a c t e dw i t ht r i z o lr e a g e n ta n dw h o l ec e l l l y s a t e sw e r ec o l l e c t e d h r km r n a w a se x p r e s s e di nal o wl e v e li ng r a n u l en e u r o n s c u l t u r e di nd e p o l a r i z i n gp o l a s s i u m w h e nc e l l sw e r es w i t c h e di n t oh y p e r p o l a r i z i n g p o t a s s i u mi - i r km r n a w a si n d u c e de a r l ya n dg r a d u a l l yi n c r e a s e dr e a c h i n gap e a ka t 4 h r sa n dt h e nd e c r e a s e d ( f i g1 a ) t os t u d yw h e t h e rb i mw a sa l s oi n d u c e dw i t has i m i l a rt i m ec o u r s ea si - i r k ，w e u s e dt h es a f u ee d n ap o o l st od e t e r m i n eb i me x p r e s s i o n w ef o u n dt h a tb i mw a s i n d u c e d 砸mas i m i l a rt i m ec o u r s ea sj o h n s o na n dw ep r e v i o u s l yr e p o r t e d ( f i g1 b ) c o m p a r e dw i t hh r k ，t h ee x t e n to fb i