（法医学专业论文）乙醇在犬体内的死后再分布及保存人血液中稳定性的研究.pdf

【l 西医科 学碰士学位论文 乙醇在犬体内的死后再分布及保存人血液中稳定性的研究 摘要 目的： 1 建立生物样品中乙醇和自生醇类的直接进样和顶空进样气相色谱检测方法： 2 建立乙醇的死后再分布、保存检材中稳定性和自生醇类的研究模型和方法； 3 研究犬体内乙醇的死后再分布规律、保存检材中乙醇的稳定性和自生醇产生规律， 为涉及酒精案件检材的采集、保存、检测和结果分析提供科学依据。 方法： l 乙醇及自生醇的气相色谱检测方法 1 1 直接进样气相色谱法：体液、组织( 匀浆) 离心后取上清，加入内标液，柱头直 接进样，t r a c e 2 0 0 0 气相色谱仪( f i d 检测器，p e g 融硅石英毛细管柱) 检测乙醇及自 生醇，保留时间定性，内标法定量。 1 2 顶空气相色谱法：取血样于顶空瓶中，加入内标液及蒸馏水，平衡后自动顶空进 样器进样，a g i l e n t 6 8 2 0 气相色谱仪( f i d 检测器，d b 5 毛细管柱) 检测乙醇及自生醇， 保留时间定性，内标法定量。 2 死后再分布研究 2 1 动物模型 犬6 只，分别于1 0 r a i n 内经胃管灌入3 5 m l k g 剂量的乙醇，1 5 h 后c 0 2 处死。 2 2 样品采集与处理 实验犬的心电、血压和呼吸全部消失后，置于室温下，分别于死后0 、2 、4 、8 、1 2 、 2 4 、4 8 、7 2 、9 6 、1 2 0 h 取左心室血、左心房血、右心室血、右心房血、下腔静脉血、玻璃 体液、胆汁、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑和肌肉，直接进样气相色谱法检测乙醇及f 丙醇含量，同时观察是否有自生醇产生。 3 保存检材中乙醇的稳定性 3 i 模型 死亡1 2 h 内人尸体血液，经检测无自生醇后，用乙醇溶液添加成初始浓度分别为2 0 1 2 、 5 1 7 3 、7 7 9 、1 4 2 2 9 、3 1 4 ，0 5 m g l o o m l 的样本。 3 2 样品保存与处理 样本置于不同器皿( 塑料袋，试管，注射器) 中，分别于室温、4 c 和一2 0 中保存， 在2 、4 、7 、1 5 、3 0 天经顶空气相色谱法检测其中乙醇浓度。 4 保存检材中自生醇的研究 4 1 保存人血液中自生醇的研究 离体模型：字白人尸体样本分别置于不同器皿( 塑料袋，试管，注射器) 中，室温、 4 c 和一2 0 条件中保存，在2 、4 、7 、1 5 、3 0 灭经顶空气相色谱法检测乙醇和诈丙醇含 量，并观察其它自生醇的产生情况。 y 山西医科丈学硕士学位论文 4 2 犬体内自生醇的研究 在体模型：犬3 只，经c 0 2 处死，心电、血压和呼吸全部消失后，置于室温下，分别 于死后0 、2 、4 、8 、1 2 、2 4 、4 8 、7 2 、9 6 、1 2 0 h 取左心室血、左心房血、右心室血、右 心房血、下腔静脉血、玻璃体液、胆，1 - 、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑和肌肉，每次取 材后将肌肉，皮肤逐层缝合，尽量保持机体的完整性。上述检材经直接进样气相色谱法检 测乙醇及正丙醇含量，并观察其它自生醇的产生情况。 5 统计学方法 采用s p s s l l 5 统计软件处理数据，结果以均数标准差( o 8 ) 表示 结果： 1 气相色谱法 本研究建立的直接进样和项空气相色谱检测生物样本中乙醇及自生醇( 甲醇、丙酮、 正丙醇、异丙醇、正丁醇和异丁醇) 方法，使乙醇和自生醇分离良好，线性范围为 2 4 0 0 m g l o o m l ，最低检出浓度是o 1 5 m g l o o m l ，回收率均在9 5 以上。 2 死后再分布研究 2 1 分布 犬经灌胃后1 5 h ，体内乙醇含量顺序为玻璃体液( 3 7 3 0 4 5 1 6 4 ) 左心室血 ( 2 6 6 5 2 3 9 4 7 ) 、左心房血( 2 7 5 6 7 5 2 2 9 ) 、右心室血( 2 5 5 0 6 3 5 2 8 ) 、右心房血 ( 2 7 7 6 5 _ _ 2 8 9 1 ) 、下腔静脉血( 2 6 4 0 1 + _ 2 5 0 6 ) 、尿( 2 3 4 8 2 1 6 2 1 8 ) 肝脏( 1 6 2 0 1 + _ 5 4 5 ) 、 脾脏( 1 7 7 0 7 _ _ 4 3 3 5 ) 、肺脏( 1 9 9 7 0 - _ 2 9 2 8 ) 、肾脏( 2 0 3 2 7 + _ 3 4 2 0 ) 、大脑( 2 1 4 4 7 + - 2 2 4 7 ) 胆汁( 1 6 9 2 7 5 2 7 4 ) p a i 肉( 1 5 2 ，5 4 2 7 9 3 ) 。玻璃体液中乙醇含量为心血和下腔静脉 中乙醇含量的1 4 1 倍；胆t l - 与心血和下腔静脉中乙醇含量之比为o 6 7 。 2 2 死后再分布 与o h 相比，2 、4 、8 、1 2 、2 4 、4 8 、7 2 、9 6 h 左心室、左心房、右心室、右心房血中 乙醇浓度变化无统计学意义，1 2 0 h 时左心室、左心房血乙醇浓度显著升高，且均高于右心 室和右心房血中乙醇浓度( p 左心室血、左心房血、右 心室血、右心房血、下腔静脉血、尿 肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑 胆汁 肌肉。玻 璃体液中乙醇含量与心血和下腔静脉乙醇含量之比为1 4 l ：胆汁与心血和下腔静脉中乙醇 含量之比为o 6 3 。 3 乙醇在灌胃犬体内可发生死后再分布现象，左心血受到很大影响，比较而言，玻璃 体液、肌肉和脑组织受到死后再分布影响较少。且死亡犬体内会产生乙醇、正丙醇、丙酮 和异丙醇。在酒精中毒案件的法医学鉴定中，应综合考虑死后再分布对体内酒精含量的影 响。 4 保存温度，器皿类型和初始浓度均对血样中乙醇浓度有不同程度的影响，其中保存 温度和器皿类型的影响较为显著。而且除了保存温度与保存时问不存在交互作用以外，其 它因素两两之间都存在交互作用。鉴定人在保存和检测样本过程中只有加强各个环节的质 量控制，才能提供客观准确的检测数据及保证复查结果的有效性。 5 在体模型和离体模型均会产生自生醇，温度对其影响较大。大部分组织如心血、下 腔静脉血、尿、胆汁、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏在死后1 2 h 就有不同程度的乙醇和正丙醇 产生，其中，1 2 0 h 尿中乙醇浓度可以达1 0 4 9 2 r a g 1 0 0 m l 。肌肉，玻璃体液，大脑分别在死 后4 8 ，7 2 ，9 6 h 检出乙醇，犬体内乙醇和正丙醇的生成存在正相关；人空白血样在一2 0 放 置3 0 天未检出任何自生醇。在涉及乙醇的法医学检案中，特别是腐败样品，应注意自生 醇的检测，尿中检出乙醇不能判定生前饮酒，应采集不易腐败的组织如玻璃体液、肌肉和 大脑，检测其乙醇含量，并观察与正丙醇比例关系来进行综合判定。 关键词：乙醇，项空气相色谱，稳定性，死后再分布，自生醇类 i i i 山西医科太学硕士学位论文 t h es t u d y so ft h ea l c o h o lp o s t m o r t e mr e d i s t r i b u t i o ni nd o g s a n dt h es t a b i l i t yi np r e s e r v a t i v es a m p l e s a b s t r a c t 0 b j e c t i v e ： 1 t oe s t a b l i s ht h em e t h o d so f d i r e c t i n j e c t i o ng a sc h r o m a t o g r a ma n dh e a d s p a c eg a s c h r o m a t o g r a mi nd e t e c t i n ga l c o h o la n ds e l f - g e n e r a t i o na l c o h 0 1 2 , t oe s t a b l i s ht h em o d e l so fp o s t m o r t e mr e d i s t r i b u t i o ni nd o g sa n ds t a b i l i t yi np r e s e r v a t i v e s a m p l e s 3 t os t u d yt h ep o s t m o r t e mr e d i s t r i b u t i o no fa l c o h o li nd o g sa n ds t a b i l i t yo fa l c o h o li n p r e s e r v a t i v es a m p l e s m e t h o d s ： 1 , t h em e t h o d so fa l c o h o la n ds e l f - g e n e r a t e da l c o h o ld e t e c t i o n 1 ，1d i r e c t i n j e c t i o ng a sc h r o m a t o g r a m , t h es a m p l e sw e r ed i l u t e dw i t hi n t e r n a ls t a n d a r d s o l u t i o na n dd e t e c t e db yat r a c eg c 2 0 0 0e q u i p p e dw i t hf i da n dp e gc o l u m nt h r o u g ht h e d i r e c t i n j e c t i o n q u a l i t a t i v ea n a l y s i sw a sb a s e do nr e t e n t i o nt i m ea n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sw a s b a s e do na ni n t e m a ls t a n d a r dm e t h o d i 2h e a d s p a c eg a sc h r o m a t o g r a m ：t h eb l o o ds a m p l e sw e r ed i l u t e dw i t hi n t e r n a ls t a n d a r d s o l u t i o na n dd i s t i l l e dw a t e ri nh s v i a l s t h e yw e r ed e t e c t e db yam o d e l a g i l e n t 6 8 2 0g c e q u i p p e dw i t hr i da n da d b 一5m o d e lc o l u m nt h r o u g ht h ea u t o m a t i ch e a d s p a c es a m p l e i n j e c t o r q u a l i t a t i v ea n a l y s i sw a sb a s e do nr e t e n t i o nt i m ea n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sw a sb a s e do n a ni n t e m a ls t a n d a r dm e t h o d 2 p o s t m o r t e mr e d i s t r i b u t i o no fa l c o h o l 2 1a n i m a lm o d e l ： s i xd o g sw e r eg i v e na l li n t r a g a s t r i ca d m i n i s t r a t i o nw i t had r u n k e n n e s sd o s ei nt e nm i n u t e s t h e yw e r es a c r i f i c e db yc 0 2a f t e r1 5h o u r s 2 2s a m p l e sc o l l e c t i o n ：t h ed o g sw e r ep l a c e da tr o o mt e m p e r a t u r e h e a r tb l o o d ，c a v ab l o o d ， h u m o r v i t r e o u s ，b i l e ，l i v e r , s p l e e n ，l u n g ，k i d n e y , b r a i n a n dm u s c l ew e r ec o l l e c t e d a t o ，i ，4 ，8 ，1 2 ，2 4 ，4 8 ，7 2 ，9 6 ，1 2 0h o u r sa f t e rd e a t ha n dw a sa n a l y z e d b yd i r e c t i n j e c t i o ng a s c h r o m a t o 群a mr e s p e c t i v e l y 3t h es t a b i l i t yo ft h ep r e s e r v a t i v es a m p l e s t h ea l c o h o ls o l u t i o nw a sa d d e di nt h eb l a n kb l o o dw h i c hw e r ec o l l e c t e di n1 2h o u r sa f t e r d e a t ha n d t h e i n i t i a lc o n c e n t r a t i o n s w e r e 2 0 1 2 、5 1 7 3 、7 7 9 0 、1 4 2 2 9 、3 1 4 0 5 m g 1 0 0 m 1 t h e y w e r es t o r e di nd i f f e r e n t v e s s e l s ( p l a s t i cb a g ，t u b e ，s y r i n g e ) a t d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e ( r o o m t e m p e r a t u r e ，4 。c ，一2 0 ) a n dw e r ea n a l y z e di n2 、4 、7 、1 5 、3 0d a y sb yt h eh e a d s p a c eg a s i v l l i 西跃科大学硕上学位论文 c h r o m a t o g r a m 4t h es t u d yo ft h es e l f - g e n e r a t e da l c o h o li ns t o r e ds a m p l e s 5s t a t i s t i c sm e t h o d ：t h ed a t e sw a sh a n d l e db ys o f t w a r es p s s11 5a n dt h er e s u l tw a s e x p r e s s e db yo ! s r e s u i t s ： 1t h es t u d yh a de s t a b l i s h e dt h em e t h o d so fd i r e c t i n j e c t i o n g a sc h r o m a t o g r a ma n d h e a d s p a c eg a sc h r o m a t o g r a mi nd e t e c t i n ga l c o h o la n ds e l f - g e n e r a t i o n t h el i n e a rr a n g ew a s 2 4 0 0 n l l g 1 0 0 m l ，t h em i n i m u md e t e c t a b l ec o n c e n t r a t i o nw a so 5 m i g 1 0 0 m l ，a n dt h ea v e r a g eo f r e c o v e r yr a t ee x c e e d e d9 5 2t h es t u d yo ft h ep o s tr e d i s t r i b u t i o n ： 2 1d i s t r i b u t i o na f t e rd e a t h ：t h es e q u e n c eo fa l c o h o lc o n c e n t r a t i o ni nd o g sw a sa sf o l l o w s ： h u m o rv i t r e o u s l e f tv e n t r i c l e ，l e f ta t r i u m ，r i g h tv e n t r i c l e ，r i g h ta t r i u m ，c a v a ，u r i n e l i v e r ， s p l e e n ，l u n g ，k i d n e y ，c e r e b r u m b i l e m u s c l ea f t e rd e a t h t h ec o n c e n t r a t i o no fa l c o h o lo fi n h u m o rv i t r e o u sw a st h eh i g h e s tw h i c hw a s 山e1 4t i m e so fh e a r tb l o o da n dc a v ab l o o d t h er a t i o o fa l e o h o lc o n c e n t r a t i o ni nb i l ew i t hh e a r t b l o o da n dc a v aw a s0 6 7 2 2p o s t m o r t e mr e d i s t r i b u t i o n ：t h e r ew a sap h e n o m e n o no fp o s tr e d i s t r i b u t i o ni nd o g s t h e l e f th e a r tb l o o dw a sm o r ei n f l u e n c e dt h a nt h eh u m o rv i t r e o u s ，m u s c l ea n dc e r e b r u mi ts h o u l db e p o s i t i v ec o r r e l a t i o ni na l c o h o la n dn p r o p y la l c o h 0 1 3s t a b i l i t yi np r e s e r v a t i v es a m p l e s ：t h ec o n c e n t r a t i o na l c o h o li ns a m p l e sw e r ei n f l u e n c e db y t h et e m p e r a t u r e ，t i m e ，v e s s e la n di n i t i a lc o n c e n t r a t i o n t h ei n t e r a c t i o nw a sn o tb eo b s e r v e d b e t w e e nt e m p e r a t u r ea n dt i m e 4s e l f - g e n e r a t e da l c o h o li ns t o r e ds a m p l e s 4 1s e l f - g e n e r a t e da l c o h o li ns t o r e dh u m a nb l o o ds a m p l e s ：t h e r ew a sal i t t l ea l c o h o li n s a m p l e so n3 0d a y sa t4 va n dn oa l c o h o lo n3 0d a y sa t 一2 0 。c t h em o s ts a m p l e sa tr o o m t e m p e r a t u r ew e r ef o u n d al o wc o n c e n t r a t i o no fa l c o h o l 、i s o p r o p a n o l 、i s o b u t a n o l 、a c e t o n e 4 2s e l f - g e n e r a t e da l c o h o li nd o g s ：t h e r ew e r ead i f f e r e n td e g r e eo fa l c o h o la n dn p r o p y l a l c o h o lc o n c e n t r a t i o ni nh e a r tb l o o d ，c a v ab l o o d ，u r i n e ，b i l e ，s p l e e n ，l u n ga n dk i d n e y ，t h ea l c o h o l c o n c e n t r a t i o ni nu r i n ew a sh i t1 0 4 9 2 m g 1 0 0 m 1 t h ec e r e b r u m ，h u m o rv i t r e o u sa n dm u s c l ed i d n o te a s yt o c o r r u p t i o n t h e r ew e r eal o wc o n c e n t r a t i o ni n b r a i n sa t9 6h o u r sa n di nh u m o r v i t r e o u sa t7 2h o u r s c o n c l u s i o n ： 1 t h es t u d yh a de s t a b l i s h e dt h em e t h o d so fd i r e c t i n j e c t i o ng a sc h r o m a t o g r a ma n d h e a d s p a c eg a sc h r o m a t o g r a m i nd e t e c t i n ga l c o h o la n ds e l f - g e n e r a t i o nw h i c hw a sg o o df o r s e p a r a t i n ga l c o h o la n ds e l f - g e n e r a t e da l c o h 0 1 t h em e t h o d sw h i c hh a dah i g hs e n s i t i v i t ya n d c o u l db eu s e di nm e d i c o l e g a li d e n t i f i c a t i o na n ds t u d y v 山西医科大学顿士学位论文 2 t h ec o n c e n t r a t i o no fa l c o h o li nd o g sa sf o l l o w s ：h u m o rv i t r e o u s l e f tv e n t r i c l e ，l e f t a t r i u m ，r i g h tv e n t r i c l e ，r i g h ta t r i u m ，c a v a ，u r i n e l i v e r ，s p l e e n ，l u n g ，k i d n e y ，c e r e b r u m b i l e m u s c l ea tt h ed e a t ht i m e t h ec o n c e n t r a t i o no fa l c o h o li nh u m o rv i t r e o u sw a st h eh i g h e s tw h i c h w a st h e1 4t i m e so fc a r d i a cb l o o da n dc a v ab l o o d t h er a t i oo fa l c o h o lc o n c e n t r a t i o nw a s0 6 7 b e t w e e nb i l ea n dc a r d i a cb l o o d 、c a v a 3p o s t m o r t e mr e d i s t r i b u t i o ni nd o g s t h el e f th e a r tb l o o dw a si n f l u e n c e dm o r es e r i o u s l yb y t h er e d i s t r i b u t i o nt h a nt h eh u m o rv i t r e o u s 、m u s c l ea n dc e r e b r u m t h e r ew a sap o s i t i v e c o r r e l a t i o nb e t w e e na l c o h o la n dn - p r o p y la l c o h 0 1 a l c o h o l ，n p r o p y la l c o h o l ，a c e t o n ea n d i s o p m p a n o lw e r eg e n e r a t e df r o mt h ec o r p s ea n dt h e r ew a sa np o s i t i v e c o r r e l a t i o nb e t w e e n a l c o h o la n dn p r o p y la l c o h 0 1 w es h o u l dc o n s i d e rt h ei n f l u e n c eo ft h ep o s ti n t e r v a lt i m ef o rt h e a l c o h o lc o n c e n t r a t i o ni nt h ec a s e so fa l c o h o lp o i s o n e d 4t h eb l o o ds a m p l e sw e r ea f f e c t e db yt e m p e r a t u r e ，v e s s e la n di n k i a la l c o h o l c o n c e n t r a t i o n a l lf a c t o r sh a di n t e r a c t i o ne x c e p to ft e m p e r a t u r ea n dt i m e 5t h e r ew e r es e l f - g e n e r a t e da l c o h o li nc o r r u p t e dh u m a nb l o o da n dd o g s a n dt h e r ew a sa n p o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e na l c o h o la n dn p r o p y la l c o h 0 1 t h ec e r e b r u m h u m o rv i t r e o u sa n d m u s c l ed i dr i o te a s yt oc o r r u p t i o n t h ea l c o h o la n dn - p r o p y la l c o h o lw e r ef o u n di nu r i n ea t1 2 h o u r s ；a l c o h o ld i dn o td e t e c t e do n3 0d a y sa t 一2 0 。c w es h o u l dn o ti g n o r et h es e l f - g e n e r a t e d a l c o h o ii na l c o h o lc a s e s k e yw o r d s ：a l c o h o l h e a d s p a c eg a sc h r o m a t o g r a m ，s t a b i l i t y ，p o s t m o r t e mr e d i s t r i b u t i o n ， s e l f - g e n e r a t i o na l c o h o l v 刖舌 乙醇是各种酒类饮料的主要成分，大量饮用高浓度酒，会造成急性酒精中毒，严重者 会导致死亡。由于饮酒过量可诱发或导致多种疾病，如心脑血管疾病、消化系统疾病和精 神障碍等，同时也会导致行为异常，从而发生意外甚至犯罪，比如交通事故、酒后闹事、 醉酒死亡等，而利用酒精实施预谋犯罪的案件也时有发生o “。因此在发生交通事故或疑 似自杀、凶杀案件时，执法部门首先都要排除是否有酒精作用的因素。而涉及乙醇案件的 检材提取、保存、检测及结果分析主要是依靠法医毒物代谢动力学研究。 法医毒物代谢动力学研究包括毒物动态分布、死后分布、死后再分布、稳定性等方面 的研究。目前，国内外关于乙醇的动态分布b - 2 7 1 和死后分布 2 8 - 3 1 1 报道较多，死后再分布报 道较少，稳定性研究模型多用添加防腐剂和抗凝剂的样本，与检案实际差距较大，需进一 步研究。 本实验室负克明研究组已经探讨了酒精在饮酒习惯者体内代谢动力学规律，观察了太 原地区正常人和饮洒习惯者体内酒精的代谢动力学模型，u a c 、b r a c 与b a c 的比值关系， 以及血、尿酒精消除速率，为酒后肇事交通事故的鉴定提供了实验依据。 本研究拟在前期研究的基础上，建立乙醇在犬体内的死后再分布、保存样品中乙醇稳 定性和自生醇研究模型，分析犬在灌胃1 5 h 处死后乙醇死后再分布规律，保存样品中乙醇 浓度变化规律及在体模型和离体模型中自生醇的产生规律。为涉及乙醇案件检材的提取、 保存、检测及复查结果的有效性提供科学依据。 本研究目的为： l 建立生物样品中乙醇和自生醇类直接进样和顶空进样气相色谱检测方法； 2 建立乙醇死后再分布、保存检材中稳定性和自生醇类研究模型和方法； 3 研究犬体内乙醇死后再分布规律、保存检材中乙醇稳定性和自生醇产生规律。 本研究共分四部分： 第一部分乙醇及自生醇类气相色谱分析 第二部分乙醇在犬体内死后再分布研究 第三部分保存样本中乙醇稳定性研究 第四部分保存样本中自生醇类的研究 第一部分乙醇及自生醇类气相色谱分析 检测生物样本中乙醇浓度是判定当事人酒精中毒程度的重要方法，己为世界各国普遍 采用，我国对此也有初步研究 3 2 - 3 4 - 】。血液检测方法包括湿化学方法、酶法和气相色谱法， 呼气检测方法包括湿化学方法、电化学方法、气相色谱法和红外光谱法3 5 】。在法医学检案 中，经常会遇到腐败生物学样品，而大多数关于乙醇检测方法的文献报道中都未涉及自生 醇检测，本文建立了生物样品中乙醇及自生醇的气相色谱分析，包括顶空气相色谱法和直 接进样气相色谱法。其中，顶空法定量准确，自动化程度高，但耗时长，成本较高，而直 接进样毛细管柱气相色谱法检测血中乙醇含量具有快速，准确，操作简便，结果可靠的特 点。 1 1 材料 1 1 1 试剂 无水乙醇，甲醇，正丙醇，异丙醇，正丁醇，异丁醇，异戊醇，乙醛和丙酮均为国产 分析醇； 1 1 2 主要仪器 ( 1 ) t r a c e 2 0 0 0 气相色谱仪，美国f i n n i g a n 公司 ( 2 ) a g i l e n t 6 8 2 0 气相色谱仪，美国安捷轮公司 ( 3 ) 顶空自动进样器，美国p e 公司 ( 4 ) 2 0 0 4 一m p 6 型电子分析天平，英国s a r t o r i u s 公司 ( 5 ) d l 5 型低速大容量离心机，上海安亭科学仪器有限公司 ( 6 ) t g l - 1 6 b 台式离心机，上海安亭科学仪器有限公司 ( 7 ) 华普达h y - 3 多功能振荡器，常州市华普达教学仪器有限公司 ( 8 ) q l 一9 0 1 涡旋混合器，江苏海门市麟麒医用仪器厂 1 2 方法 1 2 1 直接进样气相色谱法检测乙醇及自生醇 ( 1 ) 内标物：浓度为5 0 m g 1 0 0 m l 的异戊醇溶液 ( 2 ) 色谱条件：f i d 检测器，色谱柱p e g 2 0 m ，融硅石英毛细管柱( 3 0 mxo 2 5 m mx o 2 5 r t m ) ，c o l5 0 - - - , i c m i n 一6 0 1 2 ，d e t1 8 0 。c ，空气6 0k p a ，氢气2 3k p a ，载 气n 21 5 m l m i n 。 ( 3 ) 样品前处理 体液前处理：待测体液3 5 0 0 r p m 离心5 分钟，取上清液2 0 0 9 l 于l m l 具塞离心管中， 加入内标物异戊醇( 5 0 m g 1 0 0 m 1 ) 8 0 0 ) 1 1 ，混匀后取l 山进样， 组织脏器前处理：取待测组织l g 加水3 m l 匀浆5 m i n ，3 5 0 0 r p m 离心5 分钟，取4 0 0 t t l 上清液于1 5 m l 具塞离心管中，加入内标物异戊醇( 5 0 m g 1 0 0 m 1 ) 8 0 0 p l ，混匀，耿l u l 迸 样。 ( 4 ) 标准工作曲线的测定 分别取空白检材( 血液，肝脏，脑) 各l m l ，配制成含乙醇浓度为2 、1 0 、2 0 、8 0 、 1 6 0 、2 4 0 、4 0 0m g 1 0 0 m l ，对应的币丙醇浓度为2 、4 、6 、8 、1 0 、1 5 、2 0m g 1 0 0 m l 的样 品，按上述方法进行前处理和测定。 ( 5 ) 精密度试验 分别取浓度为2 0 、8 0 、1 5 0 m g 1 0 0 m l 的乙醇标准溶液各l u l 进样，每个样品每只测定 5 次，连续测定2 只。 取5 、1 5 、2 0 m g 1 0 0 m lj 下丙醇溶液各l 山进样，每个样品每闩测定5 次，连续测定2 r 。 ( 6 ) 样品回收率的测定 分别取配制好的乙醇浓度为2 0 、8 0 、1 5 0 m g , 1 0 0 m l 的样品( 大脑，血液肝脏) 各3 份，按前述方法处理，检测后计算回收率。 取配制好的正丙醇浓度为5 、1 0 、1 5 m g 1 0 0 m l ( 大脑，血液，肝脏) 样品各3 份，按 前述方法处理，检测后计算回收率。 1 2 2 顶空气相色谱法检测乙醇及自生醇 ( 1 ) 内标物：浓度为5 0 m g 1 0 0 m l 的叔戊醇 ( 2 ) 色谱条件：f i d 检测器，d b 一5 毛细管柱，c o l 5 0 - - q m i n - - - , 6 0 ：d e t 2 4 0 ， 空气6 0k p a ，氢气2 3k p a ，载气n 21 5 m l m i n ( 3 ) 顶空条件： a 顶空体积的选择：o 5 m g m l 和3 o m g m l 乙醇工作溶液两组，分别取1 2 m l 项空瓶各 5 个，o 5 m g m l 乙醇工作液组加入l m l 的o 5 m g m l 乙醇工作溶液和l m l 的1 0 0 峙“叔戊 醇工作液，3 0 m g m l 乙醇工作液加入l m l 的3 0 m g m l 乙醇工作溶液和l m l 的i o o r t g 1 1 1 l 叔戊醇工作液，每组各项空瓶中依次加入2 、3 、4 、5 、6 m l 蒸馏水后密封，7 0 下加热1 5 r a i n ， 气相色谱法进行检测，每样测定2 次。根据乙醇和叔戊醇的峰面积比值的大小确定最佳体 积。 b 顶空加热温度的选择：分别取3 0 m g m l 乙醇工作溶液l m l 分别放于4 个1 2 m l 顶空 瓶中，再加入4 m l 蒸馏水和l m l 的1 0 0 1 t g m l 的叔戊醇，密封后放置于顶空进样器油浴箱 中，分别在7 0 、7 5 、8 0 、8 5 下加热1 5 m i n ，用气相色谱法进行测试，每样测定2 次。根 据乙醇和叔戊醇峰面积比值大小确定最佳温度。 c 顶空加热平衡时间的选择：分别取3 0 m g m l 的乙醇工作溶液l m l 放于5 个1 2 m l 顶 空瓶中，加入4 m l 蒸馏水和l m l 的1 0 0 1 a g m l 叔戊醇，密封后放置于顶空进样器油浴箱中， 分别在7 0 下加热5 、1 0 、1 3 、1 5 、2 0 r a i n ，用气相色谱法进行测试，每样测完后降至室 温，同条件下再测一次。根据乙醇和叔戊醇的峰面积比值的大小确定最佳加热时问。 ( 4 ) 标准工作曲线的测定 ! 苎垦翌查兰壁兰兰堕! ! 兰一 取1 2 个顶空瓶分别按表中的量配制样品，盖上瓶盖，密封。将样品放置于顶空进样器 中，7 0 下加热1 5 r a i n ，每样测试2 次。根据乙醇和叔戊醇峰面积比值做出标准工作曲线， 如表l l 。 表1 1 标准工作曲线样品配制 t a b l e i it h es a m p l e sp r e p a r eo fs t a n d a r dw o r k i n gc u r v e ( 5 ) 精密度试验 用2 0 、8 0 、1 5 0 m g 1 0 0 m l 乙醇溶液，分别配制成每种浓度4 个样品( 共1 2 个) 的待 测物，7 0 。c 下加热1 5 m i n 后气相色谱法进行检测，每个样品测定两次，计算其标准差，考 察样品间的精密度。分别用2 0 、8 0 、1 5 0 m g 1 0 0 m l 乙醇溶液，进行气相色谱法进行检测， 每个样品测试5 次，连续测两天。 用5 、1 5 、2 0 r a g 1 0 0 m lj 下丙醇溶液同上述方法考察样品精密度。 ( 6 ) 样品回收率的测定 分别取配制好的乙醇浓度为2 0 ，8 0 、1 5 0 m g 1 0 0 m l 血液样品，j 下丙醇浓度为5 、l o 、 1 5 r a g 1 0 0 m l 血液样品各3 份，装入1 8 个顶空瓶中，按最佳顶空条件，用气相色谱法进行 检测，每瓶测3 次，计算血样中乙醇和j 下丙醇的回收率。 1 3 结果 1 3 1 直接进样气相色谱法检测 ( 1 ) 色谱图，见图1 4 - _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - - _ 一 山两取大学颈t 学位论文 e m m + o 注：甲酵t ，= 2 7 7 m i n ，丙酮憎4 2 m i n ，乙醇t l ：38 7 m i n t 正内醇【f = 59 2 r a i n 异丁酵【f = 75 4 m i n 异内醇忙7 9 2 m i n 正丁醇t , = 1 0 3 3 m i n t 异j 兑醇t , = 1 35 5 r a i n 图1 i 乙醇，内标及自生醇气相色谱图 f i 9 1 i t h eg a s c h r o m a t o g r a m o f a l c o h o l ，i n t e r n a ls t a n d a r d ，s e l f - g e n e r a t i o na l c o h o ( 2 ) 标准工作曲