（分析化学专业论文）新型纳米复合材料用于直接电化学酶传感器的研究.pdf

硕j 二学位论文 摘要 近年来，发展无需电子媒介物的直接电化学酶传感器一第三代酶传感器引起了 人们的浓厚兴趣。在这些微型分析装置的制备中，其关键步骤之一就是采用合适 的固定化技术把大量的酶生物分子稳定地固定到基体电极表面，并使其能保持良 好的生物活性。然而，常用的酶生物分子固定化方法存在酶负载量小、酶易于泄 露、电子传递能力低等问题，导致研制的酶传感器的分析性能欠佳。本研究论文 利用纳米氧化锌颗粒、纳米金、纳米磁性f e 3 0 4 颗粒以及仿生多巴胺聚合物膜， 发展了几种新型酶生物分子固定化方法，以期增加酶的负载量与固定化稳定性， 提高h 2 0 2 传感器的直接电化学能力、使用寿命等目的，主要完成了以下工作： 1 合成了具有大比表面积的花簇状纳米氧化锌颗粒，并将其用于纳米金标记 的辣根过氧化物酶( h r p ) 的固定，构建新型的酶传感器实现了对h 2 0 2 的直接 电化学检测。壳聚糖氧化锌纳米颗粒复合功毙膜修饰到基底电极表面后，可为纳 米金标记的h r p 的固定提供较大的表面积。具有生物相容性的纳米金可以很好 地保持固定的h r p 生物分子的生物活性，并且促进了其与电极表面的电子传递。 基于纳米氧化锌颗粒和纳米会的协同作用，传感器实现了对h 2 0 2 的快速、灵敏、 直接的电化学检测。 2 首次以仿生聚多巴胺膜为功能基底膜并结合使用纳米金，构建了一种高导 电性、稳健的h r p 固定化平台，用于发展一种新的h 2 0 2 传感器。结果表明，酶 传感器借助聚多巴胺膜对基底电极的惊人结合力及其高生物亲和性与电活性，并 协同纳米金的“电子通道”作用，不仅可以实现酶分子在电极表面的大量而高活性 的固定化，而且能促进电子在酶活性中心和电极表面间的快速传递。与采用其他 常见聚合物材料( 例如壳聚糖) 的酶传感器比较，以聚多巴胺纳米金固定化平台 发展的酶传感器具有更优良的检测h 2 0 2 的性能。 3 为提高酶生物分子的负载量和固定化稳定性，创新性地提出了一种基于多 巴胺、纳米金以及纳米f e 3 0 4 颗粒的新型酶生物分子固定化方法。利用高粘性的 多巴胺材料将纳米金与酶标磁性颗粒形成结合物，进而藉外置磁铁将之固定于压 电晶振表面，发展了一种新的酶生物分子固定化平台。结果表明，通过聚合物内 部缔结和磁性颗粒外部磁场的协同作用以及纳米金的电子通道功能，不仅可进一 步增加酶的负载量、固定化稳定性及与电极问的电子传递能力，而且所制备的 h 2 0 2 传感器可实现直接电化学。 关键词：直接电化学传感平台：h 2 0 2 传感器；氧化锌纳米颗粒；纳米金；磁性 f e 3 0 4 纳米颗粒；多巴胺聚合膜 i i 新型纳米复合材料用于直接i 乜化学酶传感器的研究 a b s t r a c t r e c e n ty e a r sw i t n e s st h ei n c r e a s i n gi n t e r e s t so fd e v e l o p i n gd i r e c to rr e a g e n t l e s s e l e c t r o c h e m i c a le n z y m es e n s o r s ，m o s tk n o w na st h et h i r dg e n e r a t i o ne n z y m es e n s o r s i nt h i sr e g a r d ，t h ee f f e c t i v ei m m o b i l i z a t i o no fe n z y m eo n t ot h ee l e c t r o d e si sc o n s i d e r e d t ob eo n eo ft h ek e ys t e p st of a c i l i t a t ed e s i r a b l es e n s i n gp r o p e r t i e si n c l u d i n gh i g h l o a d i n ga m o u n ta n dw e l lr e t e n t i v eb i o a c t i v i t yo fi m m o b i l i z e de n z y m e s ，a n dg o o d e l e c t r o nt r a n s f e r r i n g a b i l i t ya n dt h el i f e t i m eo fb i o s e n s o r s h o w e v e r ，m o s to ft h e c u r r e n te n z y m ei m m o b i l i z a t i o nm e t h o d sn e e dt ob ef u r t h e ri m p r o v e di na c h i e v i n g t h e s ep u r p o s e s w i t ht h e r a p i dd e v e l o p m e n t o fn a n o s t r u c t u r e dm a t e r i a l sa n d n a n o t e c h n i q u e s ，m a n yn a n o m a t e r i a l sw i t hu n i q u ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s h a v eb e e nw i d e l ye x p l o r e df o re l e c t r o l m t a l y t i c s e n s i n ga p p l i c a t i o n s i nt h i st h e s i s ， s e v e r a ln o v e le n z y m ei m m o b i l i z a t i o np l a t e f o r m sh a v eb e e ns u c c e s s f u l l yd e v e l o p e df o r d i r e c te l e c t r o c h e m i c a le n z y m es e n s o r sb ys y n e r g i s t i c a l l yu s i n gz n on a n o p a r t i c l e s ， n a n o s i z e dg o l dp a r t i c l e s ( n a n o g o l d ) ，m a g n e t i cf e 3 0 4n a n o p a r t i c l e sa n db i o m i m e t i c p o l y d o p a m i n e ，a i m i n g a ti n c r e a s e d l o a d i n g a m o u n ta n d h i g hb i o a c t i v i t y o f i m m o b i l i z e de n z y m e st o w a r d se n h a n c e dd e t e c t i o nl i m i ta n dl i f et i m et h er e s u l t i n g b i o s e n s o r s t h ed e t a i l e dw o r k sa r es h o w na sf o l l o w s ： 1 an o v e li m m o b i l i z a t i o n p l a t f o r m h a sb e e nd e v e l o p e df o r f a b r i c a t i n g e n z y m e b a s e db i o s e n s o r so fd i r e c te l e c t r o c h e m i s t r yb ys y n e r g i s t i c a l l yu s i n gz n o c r y s t a l sa n dn a n o g o l d z n oc r y s t a l sw e r es y n t h e s i z e dw i t hf l o w e r - l i k es t r u c t u r et ob e c a s t e do nt h ee l e c t r o d em e d i a t e db yc h i t o s a ns oa st op r o v i d el a r g e rs u r f a c ea r e af o r a n c h o r i n gh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) - l a b e l e dn a n o g o l d t h er e s u l t a n te n z y m e b i o s e n s o rw a st e s t e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fh e 0 2a sam o d e lo ft e s t s y s t e m e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a th r p c o u l db ei m m o b i l i z e do n t ot h en a n o c o m p o s i t e m a t r i xw i t hh i g hl o a d i n ga m o u n ta n dw e l l - r e t a i n e db i o a c t i v i t y m o r e o v e r ，r a p i da n d d i r e c te l e c t r o nt r a n s f e r r i n gc o u l db ea c h i e v e db e t w e e nt h ee n z y m e sa c t i v es i t e sa n d t h ee l e c t r o d es u r f a c e ，t h u s f a c i l i t a t i n g t h ed i r e c t e l e c t r o a n a l y s i s o fh 2 0 2 t h e d e v e l o p e de n z y m es e n s o rc a nd i r e c t l yd e t e r m i n eh 2 0 2i nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m 1 5 1 0 6t o4 5 1 0 。4m m 0 1 l w i t had e t e c t i o nl i m i to f7 0 1 0 。7m m o l l 2 ah i g h l yr o b u s te n z y m ei m m o b i l i z a t i o np l a t f o r mh a sb e e nf a b r i c a t e df o r e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sb ys y n e r g i s t i c a l l yu s i n gb i o - m i m e t i cd o p a m i n ep o l y m e r f i l ma n dn a n o g o l d t a k i n gh r pa sa ne n z y m em o d e l ，t h i sp r e s e n t e dp l a t f o r mh a sb e e n i i i 硕十学位论文 s u c c e s s f u l l ye x p l o i t e dt od e v e l o pan o v e le l e c t r o c h e m i c a le n z y m es e n s o rf o rt h e d e t e c t i o no fh 2 0 2 e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tt h en a n o c o m p o s i t em a t r i xc a na l l o w h r pt ob ei m m o b i l i z e dw i t hh i g h l o a d i n ga m o u n t a n dw e l l r e t a i n e db i o a c t i v i t y m o r e o v e r ，i tc a na c h i e v er a p i de l e c t r o nt r a n s f e r r i n gb e t w e e nt h ee n z y m e sa c t i v es i t e s a n dt h ee l e c t r o d es u r f a c e ，f a c i l i t a t i n gq u i c ke l e c t r o a n a l y s i so fh 2 0 2 i na d d i t i o n ， c o m p a r e dw i t ho t h e rp o l y m e rm a t e r i a l s ( i e ，c h i t o s a n ) ，t h ea s p r o p o s e db i o s e n s o r d e s i g nu s i n gb i o - m i m e t i cd o p a m i n ep o l y m e rc a ns h o wm u c hb e t t e ra n a l y t i c a l p e r f o r m a n c e si nt e r m so fl i n e a rc o n c e n t r a t i o nr a n g e ，d e t e c t i o nl i m i ta n ds e n s i t i v i t y ， d e t e c t i o nr e p r o d u c i b i l i t y ，a n ds t o r a g es t a b i l i t y 3 i no r d e rt oi m p r o v et h el o a d i n ga m o u n ta n ds t a b i l i t yo fe n z y m e ，an e we n z y m e i m m o b i l i z a t i o n p l a t f o r m h a sb e e n d e v e l o p e du s i n gh i g l y a d h e s i v e d o p a m i n e ， c o n d u c t i v en a n o g o l da n dm a g n e t i cf e 3 0 4n a n o p a r t i c l e s h e r e ，f e 3 0 4n a n o p a r t i c l e s w e r ef i r s tl a b e l e dw i t he n z y m ea n dt h e nc o n j u g a t e dw i t hn a n o g o l dm e d i a t e db y d o p a m i n e t ob e m a g n e t i c a l l y i m m o b i l i z e do n t ot h e p i e z o e l e c t r i c e l e c t r o d e e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tt h es y n e r g i s t i c a le f f e c t so fi n n e rp o l y m e rc o n j u g a t i o n a n dt h ee x t e r i o rm a g n e t i ca n dt h ee l e c t r o nc h a n n e lf u n c t i o no fn a n o g o l dc o u l dl e a dt o g r e a t l yi n c r e a s e dl o a d i n ga m o u n ta n ds t a b il i t yo fi m m o b i l i z e de n z y m e ( h r pa sa m o d e ls y s t e m ) ，a n de m h a n c e dd e t e c t i o ns e n s i t i v i t ya n dl i f e t i m eo fh 2 0 2b i o s e n s o r s s h o w i n gd i r e c te l e c t r o c h e m i s t r y k e y w o r d s ：d i r e c te l e c t r o c h e m i c a ls e n s i n gp l a t f o r m ；h 2 0 2s e n s o r ； z n o n a n o p a r t i c l e ；n a n o g o l d ；m a g n e t i cf e 3 0 4n a n o p a r t i c l e ；d o p a m i n e p o l y m e rf i l m i v 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名：私五和 日为1 。1 年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：系五申 日期： 2 ，眇7 年月日 别磁轹多聿等汐师醐：一佯明卯 硕十学位论文 第1 章绪论 生物传感器是以固定化的生物成分( 酶、蛋白质、d n a 、抗体、抗原、生物 膜等) 或生物体本身( 细胞、微生物、组织等) 为敏感材料，通过各种物理、化 学换能器捕捉目标物与敏感材料之间的反应，然后，将反应的程度转变成电信号， 根据电信号推算出被测量的大小。它具有特异识别分子的能力，以生物体内存在 的活性物质为测量对象。它与传统的化学传感器和离线分析技术( h p l c 或质谱) 相比，具有方便、省时、精度高、便于计算机处理和数据收集又不会或很少损伤 样品和造成污染等优点，现己广泛应用于临床医学检测、发酵生产、食品工业、 环境监测及军事医学等领域。 1 9 6 2 年，c l a r k 和l y o n s 1 j 提出了葡萄糖生物传感器的原理，他们表示用一 薄层葡萄糖氧化酶覆盖在氧电极表面，通过氧电极检测溶液中溶解氧的消耗量， 间接测定葡萄糖的含量。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s 2 】根据此原理首次将葡萄糖 氧化酶膜覆在铂电极上制成酶传感器，用于定量检测血清中葡萄糖的含量，成功 地制成了第一支葡萄糖生物传感器，这标志着第一代生物传感器的诞生。从此以 后，酶生物传感器引起了各领域科学家的高度重视和广泛研究，得到了迅速发展。 1 1 酶生物传感器 酶传感器是生物传感器领域中研究最多的一种类型。酶生物传感器是把酶看 作生物敏感基元，通过各种物理、化学信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的反 应所产生的与目标物浓度成比例关系的可测信号，实现对目标物定量测定的分析 仪器。与传统分析方法相比，酶生物传感器具有独特的优点：( 1 ) 选择性高，能 够直接在复杂试样中进行测定；( 2 ) 反复多次使用；( 3 ) 响应时间短；( 4 ) 体 积小，可实现在线监测；( 5 ) 成本低，便于推广普及。 1 1 1 酶生物传感器的组成及工作原理 酶生物传感器的基本结构单元是由物质识别元件( 固定化酶膜) 和信号转换 器( 基体电极) 组成。当酶膜上发生酶促反应时，产生的电活性物质由基体电极 对其响应。基体电极的作用是使化学信号转变为电信号，从而加以检测，基体电 极可采用碳质电极( 石墨电极、玻碳电极、碳糊电极) 、p t 电极及相应的修饰电 极。其工作原理是：当酶电极浸入被测溶液，待测底物进入所固定的酶分子层的 内部并参与反应，大部分酶促反应都会产生或消耗一种可被电极测定的物质，当 反应达到稳态时，电活性物质的浓度可以通过电位或电流模式进行测定。 新型纳米复合材料用于直接电化学酶传感器的研究 1 1 2 酶生物传感器的分类 酶传感器基于信号传导方式的不同可分为电化学酶传感器和光化学酶传感器 两类。 ( 1 )电化学酶生物传感器 电化学酶传感器按照测量信号不同可分为电流型酶传感器、电位型酶传感器 和电导型酶传感器等。 电流型酶传感器是生物传感器领域中最重要、研究得最早也最多且最灵敏的 一种类型。它基于酶催化的氧化还原反应和异相电子转移反应，即在恒电位下， 利用固定在电极表面上的酶对酶底物的催化氧化或还原，产生在电极上还原或氧 化的组分，获得电流信号( 有时这一过程需要外加电活性媒介) 。电流型酶传感器 的研究多与流动注射分析联用，以满足过程分析，活体检测的需要。电极的微型 化技术如半导体技术、丝网印刷技术、分子自组装技术等应用与生物传感器的制 备使其应用更加广泛，可应用于液相色谱，毛细管电泳分扩的检测器。 电位型酶传感器是将酶促反应所引起的物质的变化转变成电信号输出，电位 信号大小与底物浓度的对数值呈线性关系。多用的基础电极有p h 电极、气敏电极 ( c 0 2 、n h 2 ) 等，它影响着酶电极的响应时间、检测下限等许多性质。电位型酶 电极的适用范围不仅取决于底物的溶解度，更重要的取决于基础电极的检测限， 一般为10 1 0 m o l l ，当基础电极的选择适宜时可达1 0 一10 m o l l 。目前研 究较成熟的有尿素电极、g p t 传感器、n o x 传感器、味觉传感器。 电导型酶传感器是利用酶催化底物反应，导致反应体系中离子种类及浓度的 变化，从而引起溶液导电性的改变，以溶液的电导率为信号。 ( 2 ) 光化学酶生物传感器 这类传感器利用酶的高选择性，待测物质从样品溶液中扩散到生物催化层在 固定化酶的催化下生成一种待测物质，当底物扩散速度与催化产物生成速度达成 平衡时即可得到一个稳定的光信号，大小与底物浓度成正比。a r n o l d 等【3j 将碱性 磷酸酯酶通过双层尼龙网固定于双臂光纤的公共端制成了光导纤维电化学发光 p 硝酸苯基磷酸盐生物传感器。由于在碱性溶液中酶催化p 硝酸苯基磷酸盐反应 的产物p 硝基酚在4 0 4n m 波长处有较强吸收，从而使该传感器构造非常简单。 光化学传感器与其它原理的传感器相比，具有安全性好、可远距离检测、分辨力高、 工作温度低、耗用功率低、可连续实时监控、易转换成电信号等优点。随着光纤 技术及光集成技术的迅猛发展，光化学传感器引起了人们的极大关注，并且已经 广泛地应用于工业、环境、生物医学的检测。 硕 = 学位论文 1 1 3 酶生物传感器的发展 酶生物传感器的发展经历了三个阶段，即以酶的天然介体氧来沟通酶与电极 之间的电子通道，直接检测反应底物的减少或产物的生成的第一代传感器；基于 检测媒介体的电流变化来反映底物浓度的变化的第二代生物传感器和利用酶自身 与电极之间的直接电子转移来完成信号的转换的无媒介体存在下的第三代生物传 感器【4 。 ( 1 ) 第一代酶生物传感器 第一代生物传感器是利用氧作为媒介体。以葡萄糖氧化酶为例，作用机理是 0 2 在葡萄糖氧化酶作用下，催化氧化葡萄糖，生成h 2 0 2 ，如公式( 1 ) 所示。由 于还原态葡萄糖氧化酶( g o d r e d ) 的氧化还原活性中心在酶分子内部，被蛋白质 包围，不易直接与常规电极交换电子，因而得不到可测量的电信号。可以通过测量 反应物中0 2 的减少量或生成物中h 2 0 2 的产生量等方法获得电信号。但这种方 法有局限性，响应信号与氧的分压或溶氧关系很大，而且通常利用的是生成的 h 2 0 2 在电极上的氧化响应信号来指示底物浓度的，较大的工作电位会使其他活性 物质氧化而造成干扰信号。把酶分子固定在铁氰酸盐修饰电极上制备酶传感器 5 - 7 1 ，利用它对h 2 0 2 的电还原催化在较低的电位下进行，可消除干扰而达到检测 目的。 q 日1 2 。6 + 2 h 2 0 + 。2 塑塑塑! j 盟一g 日1 2 。7 + 2 h 2 q ，、 llj ( 2 ) 第二代酶生物传感器 酶一般都是生物大分子，其氧化还原活性中心被包埋在酶蛋白质分子里面， 它与电极表面间的直接电子传递难以进行，即使能够进行，传递速率也很低，这 是因为其氧化还原活性中心与电极表面间的电子传递速率随两者间距离的增加呈 指数衰减。电子传递介体( m ) 的引入克服了这一缺陷，它的作用就是把葡萄糖 氧化酶氧化，使之再生后循环使用，而电子传递介体本身被还原，又在电极上被 氧化。 利用电子传递介体后，既不涉及0 2 ，也不涉及h 2 0 2 ，而是利用具有较低氧 化电位的传递介体在电极上产生的氧化电流，对葡萄糖进行测定，从而避免了其 它电活性物质的干扰，提高了测定的灵敏度和准确性。h a l e 等【8 】人采用二茂铁修 饰硅氧烷聚合物，再用此聚合物与葡萄糖氧化酶混合，制成性能稳定、电子传递 速率较高的电极。用循环伏安法和稳态电势法测得：由上述方法制得的葡萄糖生 物传感器对小于0 0 1m m o l l 的低浓度葡萄糖溶液也可快速响应( 响应时间小于 1m i n ) 。 新型纳米复合材料用于直接电化学酶传感器的研究 ( 3 ) 第三代酶生物传感器 由于酶与常规电极之间的直接电子传递较为困难，考虑选择合适的接合剂，把 酶生物分子共价键合到化学修饰电极上，或把酶分子固定到多孔电聚合物修饰电 极上，使酶氧化还原活性中心与电极接近，直接电子传递就能够相对容易地进行。 第三代酶生物传感器是酶与电极之间进行直接电子传递【9 】，是生物传感器构造中的 理想手段。这种传感器与氧或其它电子受体无关，无需媒介体。近年来，主要用 以下材料实现酶在电极上的固定化，以实现电极上的直接电子传递：有机导电聚 合物膜、有机导电复合材料膜、金属纳米颗粒或金属和非金属纳米颗粒。d e g a i n 等 o j 提出了通过化学修饰酶形成电子转移中继体( e l e c t r o t r a n s f e rr e l a y s ) 可缩短电 子隧道距离，从而实现酶的直接电化学。j i a 等【l l j 采用自组装技术将纳米金组装到 带巯基的溶胶凝胶网状结构上，再将辣根过氧化物酶( h r p ) 吸附到纳米金上， 借助纳米金的催化性能实现了h r p 酶的直接电化学。 1 2 酶生物传感器的固定方法 在酶生物传感器的构建中，一个关键技术就是如何把酶稳定、高活性地固定 到换能器表面，构建酶生物传感器的敏感识别部分。酶的固定化是把酶生物分子 束缚于特殊的载体，使它与整体相分隔，但仍能与底物进行分子交换，这种固定化 了的酶，既具有酶的催化特性，又具有能回收、反复使用等特点，使用寿命和贮存 寿命都比溶液酶长。固定化酶的性能取决于固定化酶所使用载体材料的性质和固 定化方法，而酶的固定化程度直接决定酶生物传感器的检测性能。通常酶的固定化 技术应满足如下条件：( 1 ) 固定后的酶仍能保持好的生物活性；( 2 ) 活性组分与 转换器紧密接触，且能适应多种测试环境；( 3 ) 固定化酶层要有良好的稳定性和 耐用性；( 4 ) 减少生物膜中生物组分的相互作用以保持原有的高度选择性。 经典的固定酶的方法主要有吸附固定法【1 1 1 ，共价偶联法【12 1 、化学交联法【1 3 ，14 1 、 包埋法【1 5 ，1 6 】、夹心法等。虽然常用于固定生物材料的方法很多，但每种技术都存 在自身的优势与不足，大多数成膜时，膜较厚，均匀度较差，附着力低，影响了 生物传感器的灵敏度、重现性和再生性。所以人们一直在努力探索生物材料新的 固定方法，以达到高稳定固定、高生物活性保持、简单实用和良好的固定重复性 能等目的。 1 2 1 分子自组装固定化技术 分子自组装是利用分子之间自发的相互识别，通过非共价键弱相互作用力( 如 氢键、范德华力、静电力、疏水作用力、7 c 7 【堆积作用、阳离子兀吸附作用) 形 成的具有特定排列顺序的分子聚合体。它能维持白组装体系结构的稳定性和完整 性，但也并不是所有分子都能够发生自组装。它的产生需要两个条件：自组装的动力 硕l ：学位论文 和导向作用。自组装的动力为分子自组装提供能量，自组装的导向作用是指分子的 空间尺寸和方向要达到重排的要求。分子自组装技术在非线性光学器件、化学生 物传感器、信息存储材料以及生物大分子合成方面有着广泛的应用前景，故受到格 外的重视。 自组装膜( s a m s ) 是分子通过化学键作用自发吸附在固液或气固界面上，形 成热力学稳定和能量最低的紧密的有序的二维纳米级的超薄膜。通常在成膜分子 之间还存在范德华力的作用，形成的膜层更加稳定。s a m s 具有以下优点：原位自 发形成、热力学稳定、制作方便简单、对基底材料形状要求低、可人为地通过合 成来设计分子结构和进行分子剪裁。由于金表面硫醇自组装膜的优良性能，人们选 取双官能团的含硫化合物先在金表面形成s a m s ，再利用其另一端的官能团可将 蛋白质、酶等固定在金表面获得多层有序膜，此类膜可望用于研究膜中生物分子之 间定向的电子转移、能量传递以及生物化学传感器的设计与制造【1 7 】。以巯基化合 物l 半胱氨酸( c y s t e i n e ，c y s ) 为电子转移促进剂的研究报道非常多【l 引，因为l 一 半胱氨酸分子小，很容易与金电极形成金。硫键，自组装效果非常好，在金e ! ! 极与 酶分子之间形成了一座桥梁，极大的缩短了酶分子与电极之间的距离，促进了电 子的转移。 1 2 2 树枝状化合物的放大技术 树枝状化合物( d e n d r i m e r s ) 是目前正在蓬勃发展的一类三维的、高度有序且 具有可修饰性强的外官能团的新型合成高分子。聚酰胺胺树枝形大分子( p a m a m d e n d r i m e r s ) 是一类末端含n h 2 的树枝状化合物，可作为结构单元在电极表面进 行自组装而形成高度有序而且稳定的超薄膜。y o o n 等【l9 j 基于上述原理提出了由葡 萄糖氧化酶和第四代聚酰胺胺树枝状化合物经多层组装而构成的传感器界面。 1 2 3 溶胶凝胶技术 溶胶凝胶法是指前驱物等溶于溶剂中( 水或有机溶剂) 形成均质溶液，溶质 与溶剂发生水解或醇解反应，反应生成物聚集成1n m 左右的粒子并形成溶胶， 把酶溶液加入其中后，溶胶经蒸发干燥转变为凝胶，同时酶也被固定其中的一种 方法。这是一个物理包埋过程，凝胶网络是围绕酶逐渐形成的，对酶的尺寸无特 殊要求，温和的反应条件和凝胶的非晶态结构都有利于保持酶的结构完整性和表 面微观结构的各向同性。常用的基质材料如二氧化硅等比普通包埋固定中使用的 有机聚合物材料更具有化学和热稳定性、良好的坚固性和抗磨性。另外，由于基 质含有足够的水，酶分子处于水溶液的微环境中，保持了它的活性和稳定性，与 在水溶液中有相似的行为。李军等【2 0 】以正硅酸乙酯( t e o s ) 为前驱物制备溶胶- 凝胶固定h r p ，他们采用了密闭老化法制备溶胶凝胶膜，并用透射电子显微镜 ( t e m ) 观察了包埋h r p 的溶胶凝胶膜的内部结构。结果表明，酶包埋于此溶 新型纳米复合材料用于直接电化学酶传感器的研究 胶凝胶的网格之后，酶的各个部位得以充分舒展，并且呈均匀分布，有利于保持 酶的催化活性；溶胶凝胶内部形成的硅氧键像“网兜”一样把酶分子牢固地包埋于 其中，固定在溶胶凝胶中的酶不易流失。 1 2 4 导电高聚物固定技术 常规固定方法使用的载体一般为非导电高聚物，随着导电高聚物的出现又出 现了用导电高聚物作载体固定酶的方法，如“一步法”、“两步法”和“模板法”。 一步法是指在聚合前把酶与单体、支持电解液混合，在电极上电解生成导电 聚合物膜的同时，酶被包裹于聚合物中其中聚吡咯及其衍生物更被广泛应用。 p e r e i r a 2 l 】将异柠檬酸脱氢酶、辅酶( n a d p + ) 和媒介体麦尔当拉蓝一起在含有缓 冲液及吡咯的溶液中共电聚合于电极上，其响应时间2 0s ，线性范围7 7 1 0 一一 1 0 4 xl0 m o l l 。这种方法的优势是没有化学反应参与，可保持酶的活性，通过电 聚合过程电荷转移的量可准确地控制聚合物膜的厚度但此法需在大量支持电解 液的环境下进行，这有可能造成酶的失活。 两步法克服了这一缺点，它是先把酶与单体分散于溶液中，共吸附于电极上， 然后在电解质溶液中电聚合【22 。对较小的蛋白质分子，仅仅物理包埋在许多情况 下是不足以实现长期保留的，且由于聚合物产生的空间约束可能阻碍酶与底物的 亲和。 1 2 5 纳米材料固定化技术 纳米是长度度量单位，一纳米为十亿分之一米。纳米科技这一初始概念是已 故美国著名物理学家、诺贝尔物理学奖得主费恩曼( r f e y n m a n ) 于1 9 5 9 年在美 国加州理工学院作题为“在低部还有很大空间”的讲演中提出的。纳米科技的迅速 发展是在1 9 8 0 年代末1 9 9 0 年代初，在1 9 9 0 年7 月，第一届国际纳米科学技 术大会和第五届国际扫描隧穿显微学大会在美国巴尔的摩同时召开，正式宣告了 纳米科技作为一门学科的诞生。纳米科学是指研究在1 1 0 0n m 尺寸范围内物质 具有的物理、化学性质和功能的科学。其中纳米材料是纳米科技的基础和先导， 已成为世界各国纳米科技发展的热点。纳米材料是指材料的几何尺寸达到纳米级 尺度，并且具有特殊性能的材料。纳米材料尺寸小，会产生常规材料所不具有的 小尺寸效应、表面与界面效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应以及大的比表 面等，使纳米材料具有许多不同于传统材料的独特性能，从而使得纳米材料与生 物材料有着特殊的相互作用。特别指出的是纳米颗粒的尺寸量子化效应。当颗粒 尺寸减小时，其吸收光谱蓝移，禁带宽度增大，价带逐渐移向低能量，而导带则 明显地移至高能量，此时颗粒已不只是个惰性体，而是一个活泼地能给电子和 取电子的物体，或者说变成了一个化学活性物质。同时，纳米粒子具有壳层结构， 粒子表面层占很大比例。纳米颗粒的巨大比表面使量子化尺寸十分突出，也正是 硕 ：学位论文 由于这种效应，使得纳米颗粒与生物体有着特殊的相互作用。 纳米材料的介入为传感器的发展提供了无穷的想象空间，可以广泛地应用于 敏感分子的固定，信号的检测和放大。由于纳米材料的量子尺寸效应和表面效应， 可把传感器的性能提高到新水平，使其不仅体积小，而且速度快，精度高，可靠 性好，还能实现多功能化和选择检测。 ( 1 ) 纳米金属颗粒固定化技术 纳米金属颗粒作为一种纳米材料，比表面积大，表面反应活性高，从而具有 较好的催化活性，金溶胶是以稳定形式存在于溶液中的纳米金粒，具有较高的稳 定性和催化活性。1 9 7 1 年，f a u l k 和t a l o r 2 3 】首先将胶体金作为标记物引入到免 疫学的研究中。之后大量研究表明纳米金能稳定而迅速吸附蛋白质，而且能加快 蛋白质与电极之间的电子转移。因此可以用来构建不需要电子媒介的第三代生物 传感器【2 4 l 。l u o 等【2 5 1 将葡萄糖氧化酶、纳米金和壳聚糖通过电沉积固定到金电极 上构制不需要电子媒介的葡萄糖传感器，固定在电极上的纳米金提高了固定化酶 的稳定性同时有利于h 2 0 2 在金电极表面的氧化。x i a o 和c h e n 等【2 6 】将h r p 自 组装到纳米金、半胱胺修饰的金电极上构制了第三代的h r p 生物传感器。 ( 2 ) 纳米磁性颗粒固定化技术 纳米磁性材料是2 0 世纪7 0 年代中期开始应用于生物领域。它以磁性微球 为生物反应的载体，将生物技术和磁性控制技术有机结合，具有固相化试剂特有 的优点以及生物免疫反应的特异性，分离速度快，效率高，可重复性好，操作简 单，不需要昂贵的设备，不影响细胞活性等特点。酶传感器中主要将纳米磁性粒 子作为固定酶的载体。采用磁性纳米粒子作为酶载体有三大优势：( 1 ) 亲水性磁 性纳米粒子能够比较稳定地悬浮在水溶液中，并可在外加磁场作用下定位于某一 部位，其表面可固定各种功能分子如酶、抗体、d n a ，甚至细胞等，因此在分子 生物学、免疫测定、细胞分离与分类、基础医学、临床诊断、临床治疗等方面具 有良好的应用前景；( 2 ) 作为酶的固定化载体，磁性高分子微球有利于固定化酶 从反应体系中分离和回收，还可以利用外部磁场控制磁性材料固定化酶的运动和 方向，从而代替传统的机械搅拌方式，提高固定化酶的催化效率；( 3 ) 磁性高分 子微球作为酶的固定化载体还具有以下优点：固定化酶可重复使用，降低成本； 可以提高酶的稳定性，改善酶的生物相容性、免疫活性、亲疏水性、分离效果及 酶的回收操作，适合大规模连续化操作。r i t t i c h 等【27 】比较了自由和固定化酶的活 化条件，固定化酶的最大活化p h 值低于自由酶，而且可以多次重复使用。h d r k 等 1 2 8 j 通过种子乳液聚合法制备了h e m a c o e d m a ( 甲基丙烯酸羟乙酯和甲基丙烯 酸乙二醇酯) 高分子共聚物磁性微球，将r n a s ea 固载到磁性微球表面，结果表 明r n a s ea 固定后活性未受到影响。 新型纳米复合材料用于氲接电化学酶传感器的研究 ( 3 ) 碳纳米管固定化技术 碳管纳米( c n t ) 是一种新兴的纳米材料，由于尺寸处在原子、分子为代表 的微观物体和宏观物体交界的过渡区域，使它既非典型的微观系统也非典型的宏 观系统，因而具有表面效应、体积效应、量子效应和宏观量子隧道效应四大效应。 由于c n t 具有良好的导电性、催化活性和较大的比表面积，尤其对过电位的大 大降低及对部分氧化还原蛋白质的直接电子转移现象，因此被广泛用于修饰电极 的研究。c n t 的发现为发展酶传感器打开了一个广阔的新天地。很多酶生物传感 器是利用氧化酶将底物氧化，同时产生过氧化氢，通过在电极表面检测过氧化氢 的量来达到生物检测的目的。研究发现，c n t 修饰电极对过氧化氢的还原表现出 优异的电催化效果 2 9 ，30 1 。 c n t 作为酶的固定材料，同时也作为基础电极的修饰材料制成传感器即成为 新型的碳纳米管修饰酶传感器【3 1 1 。该类传感器有许多优点，最突出的有以下三点： ( 1 ) c n t 良好的电学性质使得它作为一种修饰材料，在电化学反应中能够有效 地促进电子传输【3 2 1 ，提高酶传感器的检测速度，降低过电位，提高检测的灵敏度； ( 2 ) c n t 大的比表面积能够提高酶的负载量，从而改善传感器的灵敏度；( 3 ) c n t 良好的生物相容性，有利于保持酶的活性，因而有利于提高酶传感器的稳定 性和使用寿命。x u e 等【33 】以单壁c n t 为生物传感器的固定材料，将羧酸功能化 的c n t 涂在铂电极上后，通过共价连接固定葡萄糖氧化酶，从而构建一个葡萄 糖生物传感器，该生物传感器在较宽的p h 值范围内显示了稳定的伏安反应，并 在四个月后仍保持9 0 的活性，稳定性高。 ( 4 ) 纳米复合材料固定化技术 纳米有机无机复合材料是指有机和无机材料在纳米级上的杂合，包括在有机 基质内分散无机纳米微粒和在无机材料中添加纳米级的有机物或高聚物。它是一 种特殊的功能材料，具有很高的研究价值。有机化合物具有结构多样性、力学可 塑性、发光性以及易处理等特性，无机物则通常有良好的导电性、机械性、热稳 性、磁性和光学性能等。无机纳米粒子和有机基质在纳米范围内结合，两相界面 间存在静电、氢键等作用，通过协同效应影响两相的化学物理性质，形成无机该 性的有机功能材料或少量有机成分改性的无机功能材料，从而成为综合性能远优 于各单组分，并具有单组分所不具备的新型功能复合材料。近年来具有良好生物 相容性的有机无机纳米复合材料开始应用于构制生物传感器【3 4 确1 。y a n g 等【3 5 1 报 道了纳米氧化锆一壳聚糖复合膜用于构制第三代葡萄糖生物传感器；z h a n g 等【3 6 1 把尿酶生物分子固定在氧化锌纳米棒上，制备了无电子媒介的尿酸传感器。 硕i j 学位论文 1 3 酶生物传感器发展的瓶颈及前景展望 酶生物传感器的研制过程有诸多难点，其一是如何高效地筛分出高活性的酶： 其二为了使传感器具有令人满意的灵敏度，关键是保证有足够量高活性酶尽可能 牢固地固定在半导体片上。同时，为了缩短传感器的响应时间及延长寿命，在工 艺上将基膜做得尽可能的薄。其三个难点就是如何改进传感器对应用条件的适应 性与稳定性。为了从根本上解决这些难题，自2 0 世纪9 0 年代以来广泛采用了 可溶解正离子复合膜、人工生物材料与分子生物材料等新技术。近年来被学术界 公认为最成功的、最具有实用性价值的与食品有关的酶生物传感器的应用范例有： ( 1