（植物学专业论文）利用农杆菌转化葡萄细胞生产有用次生代谢产物——白藜芦醇.pdf

摘要 本实验以葡萄愈伤组织为材料，以根癌农杆菌7 0 2 菌株为感染菌株， 进行植物基因转化，经过筛选获得转化细胞系m o 。用h e - n e 激光对m o 进 行诱变，经过筛选获得突变细胞系t 。z 。最后研究了不同的诱导子对白藜芦 醇合成的影响。 ( 在农杆菌转化部分，实验结果表明，葡萄果皮愈伤组织预培养3 天， 其间用4 0 m o l l 的甘露醇处理6 小时；浸染时间2 0 钟；浸染温度2 4 。c ； 共培养时间3 6 小时；抑菌抗生素用5 0 0 m g l 头孢塞圬钠；以b 5 培养基为 基本培养基，可使转化率提高到7 8 左右。经过高压纸电泳实验证明m o 能合成冠瘿碱，说明t - r n a 已经整合到葡萄细胞核基因上并表达。对m 。 进行测定，发现它生长迅速，生物量提高2 0 3 0 。用h e n e 激光器对m o 进行辐射，结果表明：对m o 辐照1 2 分钟时，获突变细胞株t 1 ：，对t 。2 进 行测试，发现它的生长周期和生产周期比比照提前8 天左右。同时白藜芦 、 醇的合成量提高到对照的1 5 i 8 倍。) l 在最后一部分，研究结果表明，不论是化学诱导子或是真菌诱导子都对 白藜芦醇有促进作用。最佳的诱导子组合是：a l c l 3 ( 7 5 m g l ) + 灰色葡萄孢 ( 1 0 m g l ) ，在加了这两种诱导子的培养基上，细胞合成藜芦醇的量提高到 对照的3 倍以上。通过对诱导加入时间的考察，结果表明，当在细胞生长 的第3 0 天左右加入子a 1 c 1 3 ( 7 5 m g l ) + 灰色葡萄孢( 1 0 m g l ) 诱导子时， 可使白藜芦醇的产量在细胞胞本身生长不受影响的条件下增加4 0 0 5 0 0 。 一 、 关囊f 】；瓢葡萄；农杆菌；7 白藜芦醇? 转化：h e n e 激光y 诱导子 a b s t r a c t m a s t e rd e g r e ed i s s e r t a t i o n ( c o l l e g eo f l i f es c i e n c e ，n o r t h w e s t u n i v e r s i t y , c h i n a ) o u ob i n ( b o t a r l y ) d i r e c t e db yw e iy a - h u i r e s v e r a t r o l ，p l a n ts e c o n d a r y m e t a b o l i t e ，p r o d u c t e db yt r a n g e n e t i eg r a p e c e l lw i t h a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s r e s v e r a t r o l ，s t i l l b e n ec o m p o u n d ，f o u n di nm a n yp l a n t s ，e x p e c i a l l yi ng r a p e ， s h o w s t ob ea c t i v ei na r t i o x i d a n t ，a n t i i n f l a m m a t o r ya n da n t i o n c o g e n i ce t c ，b u t ，t h ec o n t e n t o fr e s v e r a t r o li s v e r y l i t t l ei nv a r i o u sp l a n t s ，w h i c hi s n o t e n o u g h f o r p e o p l e r e q u i r m e n t s o ，t h et a r g e t o ft h i s i n v e s t i g a t i o ni s t o i m p r o v et h ep r o d u c t i v i t y o f r e s v e r a t r 0 1 i nt h ec o u r s eo fi n v e s t i g a t i o n t h r e es t e p sa r ei n c l u d e da sf o l l o w s t h ef i r s ts t e pi s g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nt og r a p ec e l l w i t ha g r o b a c t e r i u m t h i ss t e pi st oi m p r o v et h e g r a p e c e l l sb i o m a s si n c r e a m e n t t h es e c o n do n ei sr a d i a t i n gb yh e n el a s e rt ot h e c e l la b t a i n e dt h r o u g ht h ef i r s ts t e p t h ek e yo ft h i ss t e pi e st oa b t a i nag o o ds t r a i n w h i c hh a sah i g h e rc a p a b i l i t yo fp r o d u c i n gr e s v e r a t r 0 1 a n dt h el a s ts t e pi st oi n d u c e t h ee x p r e s s i o no fr si ns h o r tt i m ea n dp r o m p tt h ec o m p o s i t i o no fr e s v e r a t r o lb y e l i c i t o r s t h e nt h ep r o d u c t i v i t yo fr e s v e r a t r o li n c r e a s e sd r a m a t i c l y a tt h es a m et i m e ， t h e o p t i m a lt i m e o f t h e a d d i n g o fe l i c i t o r si ss c r e e n e d t h r e ee x p e r i m e n t sa r ec a r r i e do u tw i t ht h ec a l l u so fg r a p e ，a n dt h ee x p e r i m e n to f g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nw i t ha g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s7 0 2s t r a i ni st h eb a s i so f t h e o t h e r s t r a s g e n i cc e l l i so b t a i n e dc a l l e dm 0 t h ec h a r i c t e r i s t i c so fm 0a r et h a tt h e p r o d u c t i o no f c e l li se n h a n c e dr e m a r k a b l y , t h o u 曲t h ep r o d u c t i o no fr e s v e r a t i o lw a s e q u a lt ot h ec o n t r 0 1 t h ee f f e c t so fs e v e r a lf a c t o r so nt r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c yi s s t u d i e d ，a n dt h er e s u l ts h o w st h a tt r a n s f o r m a t i o n 靠e q u e n c yi sr a i s e dd r a m a t i c l yb y p r e c u l t u r i n gt h ec a l l u sw i t ho 4 m o l lm a n n i t o lf o r6 hd u r i n gp r e c u l t u r et i m e ( 3 d a y ) b e f o r eb e i n gi n f e c t e dw i t ht h e7 0 2s t r a i n a n dt h eb s m a t e r i a li st a k e na sb a s a l s e l e c t i o nm e d i u m i nt h ec o n d i t i o n ，t h et r a n s f o r m a t i o nf r e q u e n c yi su pt oo v e r8 0 t h r o u g hp a p l ee l e c t r o p h o r e s i s t h e n ，t h em 0i sr a d i a t e db yh e n el a s e r av a r i e t yc e l l ( n t 1 2 ) o fs e c o n d a r y m a t t e ri sb r e db yt h ef i r s ta n ds e c o n ds c r e e na n ds t u d i e do ns t a b i l i “o fm u t a n t s t r a i n s t h ey i e l do fs e c o n d a r ym a t t e rf 2 0 3 0 ) t h a nc o n t r a s t t h es h a p ea n dp r o p e r t i e so f h e r e d i t y o ft 1 2i s s t e a d y , a t t h es a m et i m e ，t h ep e r i o do fp r o d u c t i o ni s s h a r p l y s h o 九e n e d b e s i d e s ，t h ee f f e c to fe l i c i t o r so nt h ep r o d u c t i o no f r e s v e r a t r o li si n v e s t i g a t e di n t h el a s te x p e r i m e n t t h er e s u l t ss h o w st 1 1 a tt h ea d d i t i o no fa i c l 3f 7 5 ) a n db o t n i s c i n e r a ( 10 m g l ) i n t o t h em a t e r i a lc e l lc u l t u r e so ft 1 2a tt h ef i n a l s t a g e o f f a s t g r o w i n gp h a s e ( t h e3 0 “d a yo fc u l t u r e ) d o e sn o ti n h i b i t e dt h ec e l lg r o w t h ，b u t d r a m a t i c a l l yi n c r e a s e d r e s v e r a t r o ly i e l d ，w h i c hi sa s4 - 5t i m e sa sc o n t r 0 1 k e yw o r d s ：g r a p e ；a g r o b a c t e r i u m ；r e s v e r a t r o lt r a s f o r r n a t i o n ；c i t o r ；h e - n el a s e r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得酉i e 盍堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名：害p 姒 签字日期：a 上，口文年占月7 日 耻查塑型墅堕一 利用农杆菌转化葡萄细胞生产有用次生代谢产物 白藜芦醇 第一部分文献综述 1 1 白藜芦醇的研究进展 111 植物中白藜芦醇的存在 白藜芦醇( r e s v e r a t r o l ，简称r e s ) ，化学名为芪三酚( 3 ，5 ，4 - t r i n y d r o l y s t i b e n e ) ， 结构式为【1 1 ： 噗艘哇 。溯 白藜芦醇是以葡萄属植物的一种抗逆物质首先被发现的，后来又在其他许多植物 ( 例如：虎杖、买麻藤、落花生、朝鲜槐l “、欧洲云杉 3 1 、乌苏藜芦醇1 4 1 ) 中相继发现。 人们对其分子结构、化学性质等方面作了一定研究，尤其在发现它是葡萄酒中的一种重 要营养成份后，对其药理作用进行了大量研究，现在白藜芦醇已经作为一种高效保健品 进入市场。 尽管白藜芦醇分布比较广泛，但植物体内含量非常低，而在葡萄中含量相对较高”i 。 从葡萄果实、种子、到葡萄酒，都有学者对其中的白藜芦醇含量进行过研究。陈雷、韩 雅珊【6 1 用h p l c 法测定了葡萄果肉、叶柄、种子、叶片、果皮及果穗轴中自藜芦醇的含 量，发现葡萄品种间各组织中的含量差异很大，葡萄果皮和果穗轴中的含量较高。 1 1 2 白藜芦醇的研究价值 白藜芦醇之所以受到如此的关注，主要归功于其广泛而有效的药理作用。人们已经 发现它具有抗菌、抗脂质过氧化、预防心脏病、抗癌、抗血小板凝集、血管松弛、降血 脂和抗诱变等作用。 ( 1 ) 抗菌作用白藜芦醇是葡萄对微生物或其它异物感染或伤害作出反应的产物， 具有较高韵抗菌性。f e a n d e t - p 等”1 研究发现，在葡萄受到灰色葡萄孢( b o t ，y t j s ， c j n a e r e a ) 侵染后，距离坏死果实较近且没有受到侵染的果实中的白藜芦醇含量很高。 $ b a g h i m 。等将高度降低白藜芦醇含量、中度降低白藜芦醇含量和不降低白藜芦醇含量 的三种b c i n e r e a 接种到离体培养的沙地葡萄( v i t i sr a p e s t r i s ) 中，发现它们分别 西北大学硕士学位论文 有高的、中等的和无效的病症。他们进一步研究发现，白藜芦醇含量的降低与培养滤液 中虫漆酶的活性有关，在对1 3 种葡萄及其变种研究后，他们还发现葡萄的抗菌性与其 所含白藜芦醇量密切相关。这一特征可以作为葡萄抗菌性的标记。3 。o i e s b r e c h “”等从哥 伦比亚买麻藤( g n e t u np a r i c u l a t i u 研) 中提取的白藜芦醇具有抗金黄色葡萄球菌 f s j a p h y j o c o c t l c s a u r o u s ) ，表皮葡萄球菌( s e p i d e r m i d i s ) 和耻垢分枝杆菌 ( 肌c 。b a c t e r i a ms m e g m t f c s ) 的作用。d e r c k s w 等“选择了三株离体培养抗性葡萄， 发现在接种葡萄生单轴霉后，葡萄对组织坏死的反应和白藜芦醇的积累相关。白藜芦醇 的积累量则和接种量相关，随着接种量的加大，白藜芦醇的含量也随之增高。接种后， 抗性葡萄株一( c v c a s t o r ) 中白藜芦醇的含量是敏感性葡萄株一( c v r i e s l i n g ) 的5 倍， 并能在整个生长期间保持同样高的含量。溶于水中的6 0 m g m l 的白藜芦醇能抑制7 5 的 葡萄生单轴霉孢子的萌发。 ( 2 ) 抗氧化作用白藜芦醇有很强的抗脂质过氧化作用。b l o n d 等“2 1 以硫代巴比士 酸( t b a ) 试验，发现白藜芦醇比丁基羟基甲苯( b h t ) 、槲皮、生育酚有更高的抗氧化 能力。在小鼠肝的脂质体中，如果没有酶和n d p h 参与，抑制5 0 t b a 反应物的浓度只是 槲皮素的1 3 。k i n m u r a 等“”对p o l y g o n u m s s p 根的提取物研究发现它们有抑制脂质过氧 化物在小鼠肝中沉积的作用，能降低小鼠血清中天冬氨酸和丙氨酸的水平，还能抑制小 鼠肝微粒体中由a d p h 引起的脂质过氧化。白藜芦醇能抑制铜介导的低密度脂蛋白( l d l ) 的氧化还能通过螯合作用和消除自由基来保护l d l 的过氧化。c h a n v i t a y a p i n g s s 等 “”在p c - 1 2 细胞培养中加入f e ”和t 一丁基氢过氧化物产生氧化压力，发现白藜芦醇具有 提高细胞的抗氧化作用。若白藜芦醇结合维生素c 和维生素e 则细胞的抗氧化能力将更 强。h a n 等“6 发现白藜芦醇的抗氧化活性与其竞争性的抑制单胺氧化酶a 有关。 ( 3 ) 预防心血管病和防癌作用 b i o c h e m i c a la n d b i o p h y s i c a lr e s e a r c h c o n u n i c a t i o n s1 9 9 9 年2 5 4 卷3 期报道，1 9 9 2 年s i e m a n n 等在红葡萄酒中发现白藜芦 醇，并认为它可能具有临床意义，同时，流行病学调查表明，适量饮用红葡萄酒可防治 心血管病。此后证明，红葡萄酒中可保护心血管的化合物就是白藜芦醇，它可以减轻低 密度脂蛋白( l d l ) 的氧化，从而防止动脉粥样硬化的产生。r u f 等于1 9 9 5 年发现白藜 芦醇可抑制与动脉粥样硬化有关的血小板凝集”。b e r t e l l iaa 等“8 1 调查发现，白藜芦 醇的浓度在3 6 5 p g l 时，能降低5 0 3 1 8 3 的血小板凝集，稀释的红葡萄酒中自藜芦 醇的浓度为1 2 p g l ，能降低4 1 9 2 1 1 的血小板凝集。b e r t e 1 a a e 等“2 “给 小鼠口喂红葡萄酒并测定血浆、血液、心脏、肝、肾中自藜芦醇的含量，发现心脏中自 藜芦醇的含量很高。 白藜芦醇还具有化学防癌的作用。西班牙巴塞罗那大学生物学院生物化学和分子生 物学系的科学家c a r b o 等( 1 9 9 9 ) 证明，将白藜芦醇接种于快速生长的小鼠恶性腹水肝 细胞瘤，可使肿瘤细胞内含物减少2 5 “”。m e is h i a n g3 a n g 等”发现用含白藜芦醇的 ：亘! ! 查兰堡主兰垡堡奎一 培养基培养h l 一6 0 细胞1 ，白藜芦醇能抑制癌症的进程。在正常的培养条件下h l 一6 0 细 胞能无限增生，在含白藜芦醇的培养基中，该细胞合成氮蓝四唑( n i t r o b l u e t e t r a z o l i u m ，n b p ) 的反应被抑制，同时，无定型酸性脂酶和巨噬细胞被大量合成。具 有 3 h 标记的胸腺嘧啶脱氧核苷的合成被终止，这标志着h l 一6 0 细胞无限增生得到抑制。 ( 4 ) 抗诱变作用用甲醇从y u c c as c h i d i g e r a ( y e ) 提取的白藜芦醇有抑制t r p p - 1 ( 3 氨基一1 ，4 - 二甲基5 h - , b e 啶( 4 ，3 - b ) 吲哚) 诱导的鼠伤塞沙门氏杆菌t a l 5 3 5 伊s k l 0 0 2 u m u 基因表达的s o s 作用。另外，白藜芦醇还有抑制2 一氨基蒽和活化的r r p p - 1 作用【2 3 1 。 ( 5 ) 对脂肪氧化酶产物和酪氨酸蛋白激酶的抑制作用。白藜芦醇能抑制5 一脂肪氧 化酶的产物5 - h e t e ( 5 一羟基6 ，8 ，1 1 ，1 4 一二十碳四烯酸) 、5 - d i h e t e 和l t c 4 ( 白细胞三 烯c 4 ) 。5 0 抑制效应的浓度分别为8 9 0 1 0 一m o l l ，6 7 0 1 0 。m o l l 和1 3 7 1 0 m o l l 。 它还能抑制溶酶体酶的释放【2 ”，对酪氨酸蛋白激酶也有强抑制作用。 ( 6 ) 其它作用。除以上作用外，白藜芦醇还有抗自由基，抑制h 十一心一a t p 酶和降 低e x o 一d 葡萄糖苷酶活性等作用f 2 ”。 1 1 3 白藜芦醇的研究现状 ( 1 ) 白藜芦醇的提取，纯化方面的研究 白藜芦醇为无色针状结晶，m p 2 5 6 - 2 5 7 。c ，2 6 1 升华，易溶于乙醚、氯仿、甲 醇、乙醇、丙酮等。在3 6 6 n m 的紫外光照射下能产生荧光，并能和三氯化铁一铁氰化钾 起显色反应l 圳。根据这些性质可以对其进行提取，分离和鉴定。王振目等卅从毛脉酸膜 ( r u m e xg m e l i n i ) 根的甲醇提取物中分离鉴定了白藜芦醇。王丹等以甲醇冷浸3 6 小 时，索氏提取器提取6 小时对白藜芦醇甙进行了分离和鉴定，并用紫外分光光度计在 3 0 3 n m 下进行了含量检测。赵伟杰等1 2 9 】以乌苏里藜芦根茎粉末经乙醇渗漉提取，减压浓 缩，回收乙醇，得粗提物，然后用5 0 0 0 硅胶上柱层析，先以丙酮氯仿、丙酮、甲醇洗 脱，然后用丙醇- 氯仿洗脱得组分2 5 、2 8 、3 0 。再分别进行制备薄层层析，得化合物( i ) 即为白藜芦醇。m a t t i v i 等口0 】以反向c 柱进行固相提取，并用光敏散管矩阵探测仪进行 h p l c 分析，可以准确、快速、简便地测出葡萄酒中自藜芦醇的含量，且最4 , n 得含量 可以达到1 0 a g l 。 ( 2 ) 白藜芦醇作用机理研究 白藜芦醇对生物体( 人体) 广泛的生物学效应已被肯定，然而在白藜芦醇作用的分 子机理方面几乎还是空白。目前，对白藜芦醇作用机理的研究主要集中在癌症方面。白 藜芦醇( m e d i a ne f f e c t i v ed o s ee d s 0 = 1 5 m ) 可以抑制环加氧酶( c y c l o x y g i n a s e ) 1 的活性， 从而阻止了花生四烯酸( a r a c h i d o n i ca c i d ) 与炎症前体物如前列腺素( p r o s t a g l a n d i n s ) 的结合，达到对肿瘤细胞的抑制作用【3 l 3 2 】。它的抑制强度比同类药物如阿斯匹林 ( e d s 0 2 8 8 0m ) 大的多。白藜芦醇的抗癌作用主要与它对环加氧酶】的抑制有关，而 与环加氧酶2 无关 引】。j i e b ol u 等0 1 】在研究中发现白藜芦醇能够抑制s v 4 0 ( 由w 1 3 8 正常细胞改造而来) 的生长，诱导s v 4 0 程序性死亡，而对正常的w 1 3 8 细胞则无影响。 西北大学硕士学位论文 经分析得知，白藜芦醇可诱导p 5 3 g a d d 4 5 h 和b a x 基因的表达，抑制w 1 3 8 v a 细胞中 b c l 2 基因的表达，这样在w 1 3 8 v a 细胞中出现大量的p 5 3 产物。p 弱的大量表达在生物 体对异常细胞的抑制及异常细胞的程序性死亡中扮演着重要的角色p 。另有报道，白藜 芦醇能够抑制n f k b 基因的表达。n f - k b 是与炎症肿瘤相关的基因，进一步研究表明， 白藜芦醇是通过抑制n f k b 激酶而达到抑制n f k b 基因的表达【3 4 j 。s e u n gj o o n b a c k 等【3 5 】 认为白藜芦醇先诱导p 5 3 的表达，然后p 5 3 表达产物进一步促进n a g 一1 的表达。n a g 1 是抑制非正常细胞生长的众多成员中一员，在白藜芦醇的协助下，p 5 3 表达产物识别 n a g 一1 序列，并与其结合，使n a g 一1 大量合成，从而达到抗炎、抗肿瘤的作用。 f 3 ) 白藜芦醇合成酶的研究 白藜芦醇合成酶( r e s v e r a t r o ls y n t h a s e ，简称r s ) 是白藜芦醇生物合成途径中的关键 酶之一，它以4 香豆酰辅酶a 和丙二酰辅酶a 为底物催化合成白藜芦醇【3 6 r s 是一同二 聚物f 3 刀，分子量为9 0 0 0 0 d a l t o n 左右，等电点为4 8 5 4 【3 83 纠。r s 对底物的作用具有高 度的专一性。s c h o p p n e r 等i j m 研究证明在催化反应中丙二酰辅酶a ( k 。= 1 0um ) 不可 以被其它乙酰基辅酶a 代替，4 香豆酰辅酶a ( k m = 2 um ) 则是r s 的最适底物，若将 其换为其它结构类似物则酶活力大大下降且无白藜芦醇生成。m o r i t a 等通过改变r s 的 底物研究了r s 合成其它新型聚酮化合物的能力，结果显示很微小的化学修饰就可引导 r s 催化反应形成一系列不同的新产物1 4 。r s 催化反应是一连续的缩合反应【4 1 】，它的催 化步骤如图l 所示一“4 “。 图1r s 催化的反应步骤 f i g ，i r e a c t i o ns t e p sc a t a l y z e db yr s r s 在某些植物中属于结构酶，而在另一些植物中属于诱导酶，但无论是哪一种类型， 诱导处理都会大大提高r s 的合成率和活性。通过对r sm r n a 合成的动力学研究证明， 诱导因子可迅速刺激r s m r n a 的合成，并在诱导后一定时期内达到高峰期，随后m r n a 的积累将终止”。以葡萄细胞悬浮培养为基础的研究显示r sm r n a 的瞬时表达总是存 在两个高峰期，即诱导后6 h 和2 4 h 。高水平的r s r n r n a 为后期合成r s 奠定了基础， 然而诱导因子的作用不仅仅局限于此，它使r s 的活性也得到提高，同时白藜芦醇代谢 - 4 堕! ! 奎堂! 壁兰堡! ! 苎 途径中的其它相关酶活性也同样提高【3 9 1 。另外，对r s 诱导的直接结果是白藜芦醇的大 量积累，实际上诱导也间接调动了植物体的防御机制，如木质素状物质沉积、富含羟脯 氨酸的糖蛋白的积累及某些特定水解酶活性的提高【州。研究证明二苯乙烯类植物抗毒素 对于花生、葡萄和松树这三种植物而言是非常重要的 4 “，而这三例中诱导后r s 基因的 表达及白藜芦醇的形成都是一个快速过程眇4 。伴随着基因工程操作技术的建立与发 展，r s 的转基因研究已倍受科学家的关注。h a i n 等从花生中分离出r s 基因，并将其 与卡那霉素抗性基因一同转入烟草，选用紫外光进行诱导，结果显示r s 基因迅速在烟 草细胞中得到表达，1 0 m i n 后检测到了特异m r n a ，花生和转基因烟草悬浮培养物的 r sm r n a 合成的比较研究也显示了相同的基因表达动力学参数1 4 。t m p f 等将r s 和查 尔酮合酶( c h a l c o n es y n t h a s e ，简称c h s ) 的编码区共同转入大肠杆菌的p q e 6 质粒载 体，结果二者共同表达，同时他们应用突变分析证明c y s ”9 是r s 活性表达的必需氨基 酸【4 8 】。y a m a g u c h i 等【4 2 l 也将r s 与c h s 基因共同转入大肠杆菌，二者也得到了表达，相 应的产物也已检测到，但重要的是，他们发现这两个基因在大肠杆菌中得到了交叉表达， 即r s 可催化形成柚皮素( 占白藜芦醇的1 4 - 2 3 ) ，而c h s 可催化产生白藜芦醇( 占柚 皮素的2 7 4 2 ) ，这可能是由于它们活性位点构象的柔性所导致的。f e t t i g 等 4 7 1 将嵌合 的r s 基因转入两种德国春小麦( c o m b i 和h a n n o ) ，通过r t p c r 证明了r s 基因的表 达，用h p l c 法和质谱分析法检测到白藜芦醇。进一步的研究证明r s 基因不仅在亲本 中得到表达，按孟德尔法分离的两个品种的子一代也表达了r s 基因，同时他们的研究 显示r s 基因的失活伴随着该基因的甲基化。 1 2 利用农杆菌转化植物细胞生产有用次生代谢产物的研究进展 1 2 1 农杆菌的发现 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌。根据其所带的质粒不同，可分为两种：一为根癌 农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f u c i e u s ) ，它含有t i 质粒，能诱导被侵染的植物组织形成肿 瘤，即冠瘿瘤。二为发根农杆菌( a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ) ，它含有砌质粒，能够诱 导被侵染的植物细胞产生毛状根。 1 9 0 7 年发现植物冠瘿瘤是由农杆菌诱发的。3 5 年后，b r a u n 等( 1 9 4 2 ) 进一步研究 冠瘿瘤与农杆菌的关系。他们发现不同菌株的农杆菌诱发不同的根瘤，有的菌株不能诱 发根瘤。由于农杆菌组织能在正常细胞不能生长的培养基( 无激素培养基) 上无限生长， 也不需要细菌存在，因而人们对细菌诱发肿瘤的说法产生了怀疑。b r a t m 提出了肿瘤诱 导因子( t u m o e i n d u c i n gp r i c i p l e ，t i p ) ，他推测是一种染色体外的遗传因子。也有人提 出该因子是噬菌体或农杆菌的一个组成部分。6 0 年代，法国m o v e l 等人发现植物肿瘤 组织中含有高浓度的特殊氨基酸，常见的是章鱼碱( o c t o p i n e ) 和胭脂碱( n o p a l i n e ) ， 他们总称为冠瘿碱( o p i n e s ) 。肿瘤组织合成的冠瘿碱种类取决于菌株的种类，而与宿主 植物无关，并且这些菌株分别能专性的利用肿瘤组织合成的不同类型的冠瘿碱作为菌株 生存的唯一碳源和氮源。这一结果为t i p 因子的假说提供了有利的证据，并且作者还推 里j ! 奎兰! 坠兰生堡奎一 测细菌携带的遗传物质因子进入了植物细胞。这种遗传物质既诱发肿瘤，又可决定肿瘤 的形态和冠瘿碱的合成。k e r r 发现农杆菌的致瘤能力可以在菌株间转移。将无致瘤能力 的菌株和有致瘤能力的菌株同时接种到植株上，数星期后将它们分离出来，结果原来不 致瘤的菌株获得了致瘤能力。l e a r e ns e h e l l 和v a r nl a r e b e b e 等( 1 9 7 4 ) 从致瘤农杆菌中 分离出一类巨大质粒，称为致瘤质粒( t 【1 1 1 1 0 r i n d u c i n g p l a s m i d ) ，简称t i 质粒( p t i ) 。凡 丢失质粒的农杆菌其致瘤能力完全丧失，从而证明t i 质粒就是b u a u n 假设的肿瘤诱导 因子t i p 。此后一系列的研究结果进一步证明冠瘿碱合成和其他一些功能都是由t i 质粒 携带的遗传信息所决定的。c h i l t o n 等( 1 9 7 7 1 9 7 8 ) 利用分子杂交技术证明植物肿瘤细 胞中存在一段外来d n a ，它与t i 质粒的d n a 有同源性，是整合到植物染色体的农杆 菌质粒d n a 片段，称为转移d n a ( t r a n s f e r e dd n a ，简称t d n a ) ，其内有致瘤和冠 瘿碱合成酶等基因。由于根癌农杆菌不仅使植物细胞转化为肿瘤状态，而且使肿瘤细胞 大量合成冠瘿碱，并释放到土壤为农杆菌的生长繁殖提供氮源，从而促进t i 质粒的转 移，扩大侵染范围，故有人将这个过程称为分子内共生和遗传殖民地化。这是自然界中 存在的天然植物基因工程，因此t i 质粒引起了人们极大的兴趣。后来d o m 等发现t i 质粒上有致瘤区域即v i r 区域( v i m l a n c e r e g i o n ) 。上述研究工作为今后的冠瘿瘤研究奠 定了基础。近几年来的研究已确定了t i 质粒的基因位点及它们在植物细胞中的表达。t i 质粒作为基因载体，将外源基因引入植物细胞已获得了成功。 发根农杆菌( a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ，a r ) 和根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s ，a t ) 都可以侵染植物细胞，但引起不同的病症，根癌农杆菌感染植物细胞 后诱导冠瘿瘤和冠瘿碱，故称为瘤诱导t i 质粒( t r e m o ri n d u c i n gp l a s m i d ) 。发根农杆菌 侵染植物组织后产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称为毛状 根( h a i r i n gr o o t ) ，也称为发状根，分别简称为毛根或发根，质粒为根诱导质粒( r o o t i n d u c i n gp l a s m i d ) 。长期以来，人们很重视t i 质粒的研究，并取得了较大的进展。对发 根农杆菌的研究主要集中在毛根的病害及与根癌农杆菌的相似性上。直到8 0 年代以后， 科学家们才对尉质粒的研究开始产生兴趣，特别是目本、欧洲、美国等发达国家的有 些学者己从多方面研究了砌质粒及其转化特点。 1 2 2 农杆菌侵染的对象及侵染后植物组织的特征 农杆菌的主要侵染对象是双子叶植物和裸子植物，单子叶植物对农杆菌一般不大敏 感，因此多使用原生质体或基因枪的转化方法，但原生质体培养难度大，周期长，适用 的品种少，限制了转化的应用，基因枪法不仅价格比农杆菌昂贵，而且在整合过程中经 常发生重排和高拷贝插入现象，容易导致转化的外源基因失活。近几年，随着对农杆菌 转化因素的进一步研究，改进转化条件，已在单子叶植物中成功地建立了高效转化系统， 现已在水稻、玉米、小麦、大麦等有重要价值的单子叶植物中成功地获得了转基因植株。 j e s u s 等于1 9 9 6 年在玉米分生细胞的t d n a 转化中发现，最早期的未成熟胚f d a p 、1 0 天之前不能被农杆菌感染，而1 2 d a p 至2 0 d a p 间的未成熟胚转化率逐渐增高，结果表 明t d n a 转移依赖于植物发育，农杆菌识别玉米细胞表面的关键受体成分可能在幼胚 堕j ! 奎堂堡主兰篁丝苎一 的发育中逐渐获得，并在2 0 d a p 左右获得最大活性。 当农杆菌侵入植物后，t i 质粒进入植物细胞并整合到植物d n a 上时，该细胞表现 出以下的特点：能合成冠瘿碱，根癌农杆菌合成的冠瘿碱主要有三大类型，即胭脂碱 ( n o p a l i n e ) ，章鱼碱( o c t o p i n e ) 和农杆碱( a g r o p i n e ) 。发根农杆菌合成的冠瘿碱主要 有三大类型，农杆碱型，甘露碱型和黄瓜碱型。能在无激素培养基上迅速生长。根癌 农杆菌能形成冠瘿瘤，而发根农杆菌则形成毛状根，常规的细胞培养需要添加植物激素， 生长慢，而转基因组织和器官培养则具有生长迅速，不需要添加外源植物激素，成为近 1 0 年来植物细胞培养领域的研究热点。转基因组织和器官培养主要指毛状根和冠瘿组织 培养，毛状根和冠瘿组织是由于t i 质粒( t u m o r - i n d u c i n g p l a s m i d ) 上一段基因整合到植 物核基因上并表达而形成。t i 质粒含有一段特殊的d n a 即t d n a ，t d n a 上具编码 生长素合成酶的基因i a a m ( t m r ) ，i a a h ( t m s 2 ) 及编码细胞分裂合成酶的基因i p t ( t m r ) 。当农 杆菌侵染植物时，将t d n a 整合到植物细胞的基因组上后，在植物细胞内i a a m 及i a a h 基因分别表达编码色氨酸单加氧酶及吲哚乙酸酰胺水解酶，这两个酶共同作用合成吲哚 乙酸( i a a ) ，i p t 基因表达编码异戊烯腺嘌呤( i p a ) ，y d n a 指导的生长素及细胞分裂 素的合成导致了转化植物组织出现冠瘿瘤的形态，而发根农杆菌m 质粒的t d n a 上有 与t m s 及t m s 基因同源的片段，还有4 个与根的形态发生有关的位点r o l a b c d ，这些位 点及t i n s 基因的同源片段在植物细胞中的表达，使该细胞能在无激素培养基上生长，并 形成毛状根。刺激次级代谢产物的合成。 1 2 3 农杆菌诱导下的植物遗传转化机理 农杆菌介导的d n a 转移过程大致是：在酚类等信号物质的刺激下，农杆菌通过供 体和受体的特异相互识别并附着到受体细胞表面，刺激物( 诱导物) 激活v i r 基因的表 达，v i r 功能蛋白加工产生t - d n a 转移形式，t 一复合体，在核定位信号和运输蛋白的作 用下，t - 复合体通过细胞壁，细胞膜和细胞核膜障碍进入受体细胞内，通过类似转录的 机制重组到受体基因组中并表达。现分述如下： 1 2 3 1 农杆菌对受体细胞的识别和附着 农杆菌对受体的识别和附着是农杆菌感染植物细胞的第一步。农杆菌附着位点是受 体细胞壁上富含脯氨酸的糖蛋白。这一过程与农杆菌染色体上的毒性基因( c h r o m o s - o m ev i r u l e n c e ，c h r ) 如c h v a 、c h v b 、p s c a 、a t t 、c h v d 、c h v t 、c h v g 、c h v i 等的表 达有关 4 “。它们大多编码一些膜相关蛋白，这些蛋白质直接参与农杆菌识别附着过程。 c h v a 编码一种与c h v b 和e x o c 编码的葡聚糖运输相关的内膜蛋白。c h v b 合成b l ，2 葡聚糖。c h v d 编码一种周质糖( 葡聚糖合半乳糖) 结合蛋白，能识别受体细胞产生的糖 类分子并与之结合，促进基因的诱导表达；c h v g 编码一种a t p 结合蛋白，在低p h 值 和磷酸饥渴时诱导v k g 保持一定表达水平。c h v g 和c h v i 编码的蛋白可能与农杆菌在 植物伤口组织酸性环境下存活有关，a f t 突变会导致细胞外膜和周质蛋白合成异常，从 而抑制农杆菌附着。c e l 基因控制一种含脂多糖的合成，从而合成纤维细丝使农杆菌紧 密附着在细胞表面【4 ”。此外，植物细胞的一些蛋白质和糖分子对细胞识别也有作用 5 0 】， 亘苎查兰堡圭堂篁兰墨二一 类似于动物细胞的细胞表面受体，最近通过t - d n a 标签鉴定到一些拟南芥变种没有与 农杆菌结合的能力5 ”。在农杆菌染色体毒性基因所表达的产物的诱导下和植物细胞表面 物质及其他植物基因表达产物的趋化下，农杆菌细胞识别并附着在植物细胞上。这是一 个非常迅速的过程，随后，农杆菌便会产生出细微的纤丝将自身束缚在植物细胞壁的表 面，同时，别的细菌也会被包陷在由这些细胞组成的网络之中。最后，在植物细胞壁上 出现细菌集结。 1 2 3 2t - d n a 转移的机理 1 ) t d n a t d n a 是指t i 质粒或硒质粒上的一段转移d n a l 5 。5 9 】，在农杆菌侵染植物时，这 段d n a 被加工、切割、复制、穿过细菌膜以及进入植物细胞并整合到植物基因组中， 随基因组进行表达和遗传。t d n a 没有序列特异性，可用任何d n a 片段将其两个2 5 b p 边界序列之间的区段进行转换而不影响其转移，即t d n a 可以将其携带的外源基因整 合到植物基因组中，但t d n a 上的基因与t d n a 的转移与整合无关。t d n a 上较重 要的是t - 区两端左右边界各为2 5 b p 的重复序列即边界( b o r d e rs e q u e n c e ) 分别称之为 左边界( b l 或t l ) 和右边界( b r 或t r ) 。该2 5 b p 边界序列t g a c a c g a l 肖r a t t g g c g g g t a a a c 属保守序列，但通常右边界( t r ) 序列更为保守，左边界( t l ) 序列在某 些情况下有所变化。t d n a 的核心部分为1 0 b p ( c a c g a t a t a t ) 和4 b p ( g t a a ) 两组完 全保守的序列。这两个边界是t d n a 转移所必需的，其中尤以右边界最为重要。胭脂 碱型农杆菌菌系的t i 质粒上为单一的t d n a 。只有左、右各一个边界序列，t - d n a 右 边界的右侧约1 7 b p 以外有一个2 4 b p 的超驱动序列为有效转移t d n a 所必需，起增强 子作用。将其置于2 5 b p 边界序列的上游或下游，直到离边界6 k b 仍有促进t d n a 转移 的作用。 2 ) v r i 基因 与转化有关的基因包括农杆菌染色体基因和t i 质粒上的v i r 基因【6 0 6 6 1 。v i r 区与 t d n a 在质粒d n a 上彼此相邻，合起来占质粒的三分之一。它左边连接复制起点o r i 基因。r 区具有很高保守性，t i 质粒和r i 质粒的v i r 区同源。v i r 区约2 0 4 0 k b 距 t d n a 3 5 b p 左右，v i r 区基因不发生转移，但它在t d n a 转移过程中起着十分重要的 作用，这个区域缺失或突变，菌株都将无侵染能力。v i r 区含有8 个主要的基因座即v i r a 、 v i r b 、v i r