（基础兽医学专业论文）mstn基因rnai双元素表达载体构建及效果研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名： 导师签名： 裘诗 嘲数 时间。1 年6 月他日 时间：7 年5 月佃 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使 用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：吴丹 导师签名： 嘲兰 时间：7 年6 月7 i 调 时间：潮年b 月媚 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 肌肉生成抑制素基因( m y o s t a t i n ，m s t n ) ，又称生长分化因子- 8 ( g d f - 8 ) ，是转 化生长因子b ( t g f b ) 超家族成员之一，最初从小鼠骨骼肌c d n a 文库克隆得到。 m s t n 基因“敲除”的超级鼠及双肌牛的研究证明该基因是骨骼肌发育的负调控因子。 r n a 干扰( r n a i ) 是近几年发现的在自然界广泛存在的由d s r n a 介导的特异性阻 断相应基因表达的现象，属于转录后基因沉默。目前已经成为一种新的研究特定基因功 能的技术手段。 本试验以鸡为作为动物模型，研究m s t n 调节骨骼肌发育的分子机制，设计并构建 了含有m s t n 的r n a i 双元表达载体p e g f p - n 1 - m s t n l - m s t n 2 ，以在体内转录出含有 m s t n 基因发夹结构的d s r n a ，发挥干扰m s t n 蛋白表达的作用。 试验i 利用b l a s t2s e q u e n c e 软件将本实验室已经扩增出的大骨鸡肌肉组织 m y o s t a t i n 基因全部c d n a 序列与g c n b a n k 中m y o s t a t i n 基因进行同源性比对，找到其保 守序列，然后利用p r i m e rp r h - a e r5 0 程序自行设计了一对引物，按照5 端所加酶切位点 的不同，由( 大连) 宝生物公司合成两对引物。通过p c r 扩增出两条长度均为3 9 3 b p 的相 同d n a 片段，将其分别命名为m s t n 1 和m s l n - 2 。将m s t n - 1 和m s t n - 2 进行t a 克隆，并将通过菌落p c r 和单、双酶切鉴定的克隆分别命名为p m d - m s t n 一1 和 p e g m m s t n - 2 。对p m d m s t n - 1 和p e g m - m s t n - 2 序列测定后与g e n b a n k 中m y o s t a t i n 基因核苷酸序列进行同源性分析，结果表明扩增出的大骨鸡肌肉组织m y o s t a t i n 基因核 苷酸序列同己知m y o s t a t i n 序列同源性为1 0 0 。双酶切p m d - m s t n - 1 与中间载体 p h a n n i b a l 后将m s t n 1 与中间载体p h a n n i b a l 连接，双酶切鉴定，将鉴定正确 的克隆命名为p h a n m s t n t 。双酶切p h a n - m s t n l 与p e g m - m s i n 一2 后回收并连接相 应片断，双酶切鉴定，将鉴定正确的克隆命名为p h a n - m s t n - m s t n 2 。双酶切 p e g f p - n 1 和p h a n - m s t n i - m s t n 2 ，回收相应片断、连接构建r n a i 双元表达载体， 将单、双酶切鉴定正确的重组质粒命名为p e g f p - n 1 - m s t n i - m s t n 2 ，即为m y o s t a t i n 基 因的r n a i 双元表达载体。 试验l t 利用脂质体成功地将构建好的p e g f p - n 1 m s t n l - m s t n 2 转染到体外培养的 1 中文摘要 成肌细胞中，观察成肌细胞的增殖与分化、细胞的融合率和测定m s t n 蛋白表达量，结 果细胞的增殖与分化增多、细胞的融合率增加，通过w e s t e r nb l o t 分析m s i n 蛋白表达 量也发现m s t n 表达增多。 结果证明：本试验构建的p e g f p - n 1 - m s t n i - m s t n 2 x 叹元表达载体可以抑制成肌细 胞中m s i n 基因的表达，从而促进成肌细胞的增殖与分化。 关键词：肌肉生成抑制素，r n a 干扰，双元表达载体，成肌细胞培养 2 沈阳农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t m y o s t a t i n , a l s oc a l l e dg r o w t ha n dd i f e r e n t i a t i o nf a v o r - 8 ( g d f - 8 ) ，b e l o n g st ot h e t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - 1 3 ( t g f - 1 3 ) s u p e r - f a m i l y , w a s 娜c l o n e df r o ms k e l e t a lm u s c l e c d n al i b r a r yi nm i c e m y o s t a t i nn u l lm i c ea n dn a t u r a l l ym y o s t a t i nm u t a n td o u b l e - m u s c l i n g c a t t l e ss h o wt h a tm y o s t a t i nw a sa l li n h i b i t o ro fs k e l e t a lm s c l e g r o w t h r n ai n t e r f e r e n c e ( r n a i ) ，ap h e n o m e n o no fp o s t - t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n d i n g ( p t g s ) t r i g g e r e db yd s r n a t h a tc a nb l o c kt h ee x p r e s s i o no fc o r r e s p o n d i n gg e n e n o wr n a ih a s b e e nu s e da san e wm e t h o dt oi n v e s t i g a t eg e n ef u n c t i o n h e r et h ea u t h o rc o n s m l c t e dt h ec h i c k e n s m y o s t a t i ng e n er n a ib i n a r yv e c t o r p e g f p - - n i - m s t n i - - m s t n 2 , t r a n s f e c t e di ti n t om y o b l a s tt h a tc u l t u r e di nv i t r ot h e ne x e r t e d t h e f u n c t o n d 略c t o b l o c k e x p r e s s i o n o f m s t n g e n e i n m y o b l a s t mt h ec h a p t e ro n et h ea u t h o rc o m p a r e dt h em y o s t a t i nc d n ao fb i g - b o n ec h i c k e nt h a t h a db e e nc l o n e di no u rl a b o r a t o r yw i t ht h ee d n ao fm y o s t a t i ni ng e n b a u kt of i n dt h e h o m o l o g o u sr e g i o no ft h e mt h r o u g hb l a s t2s e q u e n c es y s t e mf i r s a y ，t h e nd e s i g n e do n e p a i ro fp r i m e r sw i t ht h ep d l i l e rp r i m e r5 0s y s t e m , s y n t h e s i z e dt w op a i r so fp r i m e r sb y t a k a r ab i o t e c h n o l o g y ( d a t i a u ) c o ，l t d ，w h i c ha d d e dd i f f e r e n tr e s t r i c t i v ee n z y m e s 砒5 p o r t t w os a m e3 9 3 b pe d n af r a g m e n to fm y o s t a t i ng e n ew a so b t a i n e dt h r o u g hp c i lt h e nc a r r i e d o nt w of r a g m e n t si n t ot ac l o n ev e c t o ra n dn a m e dt w op o s i t i v ec l o n e sa sp m i ) m s t n 一1a n d p e g m - m s t n - 2 t h r o u g hs e q u e n c ea n a l y s i sw i t hb l a s t2s e q u e n c es y s t e ms e p a r a t e l y ， t h eo b t a i n e dn u c l e o t i d es e q u e n c eo f m y o s t a t i ne d n a w a sp r o v e dt ob e1 0 0 h o m o l o g yw i t h t h eb i gb o n ec m c k e ne q u e n c eo fm y o s t a t i ne d n ai ng e n b a n k d i g e s t e dt h ep m d - m s t n - 1 a n dt h em i d d l ec a r r i e rv e 1 2 t o ro fp h a n n i b a lw i t ht w oc o r r e s p o n d i n gr e s t r i c t i v ee o z 肿e s a n dc o n n e c t e dt h eo b j e c t i v en u c l e o t i d ei np m d - m s t n - ia n dp h a r 州m a ln a n l e dt h e p o s i t i v ec l o n ea sp h a n - m s t n l d i g e s t e dt h ep e g m - m s t n - 2a n dp h a n - m s t n lw i t ht h e d o u b l er e s t r i c t i v ee c u z y n l e sa n dc o n n e c t e dt h eo b j e c t i v en u c l e o t i d ei np e g m - m s t n 2w i t h p h a n - m s t n l 。n a n l e dp o s i t i v ec l o n ea sp h a n m s t n t - m s t n 2 d i g e s t e dt h ee x p r e s s i o n 3 英文摘要 v e c t o ro fp e g f p n ia n dp i - i a n - m s t n l - m s t n 2 w i t ht w oc o r r e s p o n d i n gr e s t r i c t i v e 虹l z 鹏 c a r r i e do i lt h ec o n n e c t i o n a f t e rt h el i s t ，n a m e dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dt h a td i g e s t e db yt w o c o r r e s p o n d i n gr e s t r i c t i v ee n z y m e s a n dp r 0 v e dc o r r e c ta s p e g f p - n 1 - m s t n l - m s t n 2 r l m l l y c o n s t r u c tm y o s t a t i ng e n er n a i b i n a r yv e c t o rs u c c 鼬u ， i nt h ec h a p t e rt w o ，c u l t u r em y o b l a s ti nl e gm u s c l e so f1 4d a y sb 培_ b ec h i c k e ne m b r y o i nv i t r o w h e nt h ed e n m 哆o fm y o b l a s tu pt o1 0 5u t i l i z e dl i p i d o s o n l et r a n s f e c tt h e p e g f p - n 1 - m s t n t - m s t n 2t dm y o b l a s tt h a tc u l t u r e di nv i t r o o b s e r v e dt h eh y p e r p l a s i a , d i f f e r e n t i a t i o n ，f u s er a t eo fm y o b l a s ta n dd e t e c t e dt h eq u a n t i t yo fm y o s t a t i np r o t e i n e x p r e s s i o n t h a tw f f f ot r a n s f e c t c d ，w ef o u n dt h a tt h en u m b e r , f u s er a t e ，h y p e r p l a s i a , d i f i 确t i a l i o na n dp r o t e i nq u a n t i t yo f m y o b l a s tw e 舱a l li n c r e a s e d t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tp e g f p - n i - m s t n l - m s t n 2c a l lb l o c ke x p r e s s i o no fm y o s t a t i n i nm y o b l a s ta n dt h e np r o m o t e dm y o b l a s th y p e r p l a s i aa n dd i 付酿l t i a l i o n k e yw o r d ：m y o s m t i n ( m s t n ) ，r n ai n t e r f e r e n c e ( r n a i ) ，b i n a r ye x p r e s s i o nv e c t o r , m y o b l a s tc u l t u r e 4 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章前言 肌肉生长抑制素( m y o s t a t i n ，m s t n ) 是1 9 9 7 年由m c p h e n o n 等人发现的骨骼肌特 异性因子，属于转化生长因子b ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rb e t a ，t g f - p ) 超家族成员之 一，又名生长分化因子- 8 ( g r o w t ha n dd i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r8 ，g d f - 8 ) ，是可以负调控肌 肉质量的一种分泌蛋白。在胚胎生成过程中，肌肉抑制素在生肌节细胞和正在发育的骨 骼肌细胞中表达，调节最终形成的肌纤维数量。在成体中，肌肉抑制素由骨骼肌产生， 在血液中循环，限制肌纤维生长。 2 0 0 1 年，由m i c h e lg e o r g e s 领导的研究小组，历经十余年的研究，发现比利时蓝牛 ( b e l g i m n b l u e ) 的双肌性状是由于肌肉生长抑制素基因突变造成的。与此同时，由t i m s m i t h 领导的研究小组和由霍普金斯大学的s e j i n k 领导的研究小组也发现比利时蓝牛 及皮尔蒙特牛( p i e d m o n t e ) 的双肌性状是肌肉生长抑制索基因突变造成的( j e a n p l o n g e e ta l ，2 0 0 1 ；m a s s a g u ej , t 9 9 0 ；k a m b a d u rr ，e ta l ，1 9 9 7 ；g r o b e t ，或a l ，1 9 9 7 ) 。鉴于m s t n 对骨 骼肌发育的负调控作用，育种专家把目光投向敲除m s t n 基因，蛋白的研究。从另一个 角度，研究人员也期望将m s t n 同人的肌肉萎缩等疾病联系起来，并由此找到肌肉相关 疾病的治疗手段。 r n a 干扰( r n ai n t e r r i n g ，r n a i ) 技术于1 9 9 0 年首次发现，是现代分子生物学中 研究基因功能的新方法，是指将外源或内源性的双链i e n a ( d o u b l es l t a n d sr n a , 7 0 ) ，室温或3 7 c 放置2 分钟。( 注意：提高洗脱温度到5 5 8 0 c 有利于 提高d n a 的洗脱效率) 。 h ) 1 2 0 0 0 r p m 室温离心1 分钟，离心管中的液体即为回收的d n a 片段，可立即使用或 保存于- 2 0 备用。 2 2 6 感受态细胞的制备 a ) 从3 7 c 培养1 2 1 6 小时的l b 平板上挑取大肠杆菌d h 5 a 单菌落，转入5 0 m ll b 液体培养基中3 7 c 、3 0 0 r p n v m i n 培养3 4 小时，期间测定0 d 2 6 0 ，当o d u 舻- 0 3 o 5 时停止培养。 ”于无菌工作台中将细菌转移到l m l 无菌离心管中，冰浴3 0 m i n 。 c ) 4 ，4 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 。 d ) 倒尽培养液，倒置离心管于无菌滤纸上流尽痕量培养液。 e ) 加入2 0 0 u l 冰预冷0 i m 的c a c l 2 重悬菌体。 f ) 4 ，4 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n 。 g ) 倒尽培养液，倒置离心管于无菌滤纸上流尽痕量培养液。 ”加入1 0 0 u l 冰预冷0 1 m 的c a c h 重悬菌体，4 c 保存1 2 2 4 小时内用于转化试验 或保存于一8 0 。 2 2 7 目的基因克隆 m s t n 一1 与p m d l 8 - ts i m p l ev e c t o r 进行t a 克隆，示意图如( 图2 1 ) ： 沈阳农业大学硕士学位论文 瞳2 - i m s t n - i 与p m d - 1 8 ts i m p l e 裁体鲍t a 克隆示意围 f i g 2 - it h es k e t c h n 印o f m - 2l l g a t i o nw i t hp m d - 1 8ts i m p l ev e c t o r m s t n 一2 与p e g m - t e a s y v e c t o r 进行t a 克隆，示意图如( 图2 - 2 ) ： 圈2 - 2 i 憾t n - 2 与p e g m - t e a s y 载体t a 克隆示意图 f i g 2 - 2 t h e 出既c 娜o f m s t n - 2 l i g a f i o n w i t h p e g m - t e a s y v e c t o r 具体试验步骤包括片断和载体的连接、连接产物转化大肠杆菌、阳性克隆的培养和鉴定； ( 1 ) 片断和t 载体的连接 2 5 墨三兰丝! 型薹里型生翌歪壅垄墼笪塑塑堡 m s t n - 1 与p m d l 8 - ts i m p l ev e c t o r 连接，m s t n 一2 与p e g m - te a s yv e c t o r 连接，连 接体系如下： p m d l 8 - ts i m p l ev e c t o r i n s e r td n a ( m s t n n l i g a t i o ns o l u t i o n 1 0 5 u l 4 5 u l 5 u l p e g m te a s yv e c t o r i n s e r td n a ( m s t n - 2 ) l i g a t i o ns o l u t i o n 1 0 5 u l 4 5 u l 5 u l 1 6 连接过夜。 ( 2 ) 连接产物转化大肠杆菌 a ) 把事先做好的d i - i s a 和s c s l l 0 感受态细胞置于冰中融化。 b ) 1 0 u l 的连接液全量转化至1 0 0 u l 的感受态细胞中( m s t n 一1 的t a 克隆连接产物转 化s c s l l 0 感受态细胞，m s t n 2 的t a 克隆连接产物转化d h s a 感受态细胞) 。 c ) 冰浴3 0 分钟。 d ) 4 2 热激9 0 1 2 0 秒。 e ) 冰中放置2 3 分钟。 f ) 加入3 7 预温好的l b 液体培养基至终体积为l m l 。 g ) 3 t c ，1 6 0 2 2 5 p r m 振荡培养约1 小时。 h ) 取适量的上述菌液在含有i p t g 和x - g a l 的l b + a g a r 培养基上涂平板。 i )放置2 0 3 0 分钟后在3 7 c 的振荡培养箱中1 8 0 r p m 过夜培养。 ( 3 ) m s t n 1 与m s t n - 2t a 克隆阳性重组质粒鉴定 首先进行蓝、白斑筛选 随机挑选白色菌落进行菌落p c r 鉴定 取单菌落m o d e ld n a 牙签量即可，溶于适量水中，9 9 变性1 0 分钟之后放在冰上 骤冷，之后按下列组成配制p c r 反应液： 1 0 p c rb u f f e r d n t p s ( 1 0 m m ) e x 驹胁h sp o l y m e r a s e t 载体通用上游引物( 1 0 p m o l u l ) 2 5 u l o 5 u l 0 1 2 5 u l 0 2 5 u l 沈阳农业大学硕士学位论文 - 载体通用下游引物( 1 0 p m o l u l ) m o d e ld n a o 2 5 l l l o 1 u l p c r 运行程序、产物琼脂糖凝胶电泳和凝胶染色照相，将通过菌落p c r 初步鉴定 正确的阳性克隆分别命名为p m d - m s t n - i 和p e g m m s t n - 2 。 菌落p c r 鉴定为阳性的克隆小量摇菌培养并提取质粒( 碱裂解法) a ) 无菌条件下，用无菌牙签挑取单个转化菌落，接种于5 m l 含相应抗生素的l b 液体 培养基中，3 7 2 2 0 r p m m i n 振摇培养过夜。 b ) 将培养物移入1 5 m le p p e n d o r f 管中，1 2 0 0 0 r p n v m i n 离心2 m i n ，将管倒置于吸水纸 上，尽可能地吸去残留的培养液。 c ) 用5 0 u l r e 悬浮沉淀，4 c8 0 0 0 r p n v m i n 离心3 0 s e e ，弃上清，收集菌体。 d ) 用1 0 0 i l l 冰预冷加入5 1 a l l o m g m lr n a 酶的溶液i ，重悬细菌沉淀。 e ) 加入2 0 0 1 a l 新配制的溶液i t ，快速颠倒离心管5 次，混匀内容物冰浴静止5 m i n 。 f ) 加入1 5 叩l 冰预冷的溶液i h ，温和颠倒混匀，使溶液在稠的细菌裂解液中分散均匀， 冰浴5 m i n 。 g ) 4 4 c1 2 0 0 0 r r a i n 离心1 0 m i n ，转移上清至另一e p p e n d o r f 管中，加入等体积的酚，氯仿 ，异戊醇，振荡均匀，离心2 m i n ，取上层水相，至于另一e p p e n d o r f 管中用等体积的 酚，氯仿，异戊醇再抽提一次。 h ) 取上层水相至另一e p p e n d o f f 管中，加入2 倍体积的无水乙醇，振荡均匀，- 2 0 c 放 置3 0 m i n 。 i ) 1 2 0 0 0 r p m m i n 离心1 0 m i n ，弃上清取沉淀，加7 0 乙醇洗涤沉淀以去掉小分子物质， 室温下风干。 j ) 用5 q a ld d h 2 0 溶解沉淀。 州d - m s t n l 和p e g m - m s t n - 2 的双酶切鉴定 将上述菌落p c r 鉴定为阳性p m d - m s t n 1 重组质粒进行b a m h f c l a i ，p e g m - m s t n - 2 进行x h o l t k p n i 双酶切鉴定，酶切体系如下： p m d - m s t n 一1p l a s m i d b a m m c 缸i 1 0 mb u f f e r d d h 2 0 t o t a l 8 u l 1 u l 1 u l 2 u l 8 u l 2 0 u l p e g m - m s t n - 2p l a s m i d 第二章m s t n 基因r n a i 双元表达载体的构建 k p n i 跏i 1 0 kb u f f e r d d h 2 0 t o t a l l u l l u l 2 u l 8 u l 2 仇i l 3 7 条件下酶切2 3 小时。单酶切鉴定按照宝生物工程( 大连) 有限公司限制性 内切酶说明书进行操作。酶切产物进行1 5 琼脂糖凝胶电泳、染色和凝胶图像采集。 将菌落p c r 和单、双酶切鉴定均为阳性的重组质粒送交宝生物工程( 大连) 有限公 司测序，用b l a s t ns e q u e n c e 软件对测定结果与c - e n e b a n k 上的m y o s t a t i n 基因核苷 酸序列进行同源性比较。 2 2 8m s t n 。l 的亚克隆 具体试验步骤包括b a m i - h i c l a i 双酶切p m d - m s t n - i 和p h a n n i b a l 。1 2 琼脂糖 凝胶电泳，回收相应的目的片段，片断和载体的连接、连接产物转化大肠杆菌、阳性克 隆的培养和鉴定： m s t n 1 亚克隆过程示意图如( 图2 - 3 ) 圈2 - 3m s t n - 1 与p h a n n i b a l 载体亚克隆示意图 埏2 - 3 t h es u b c o l n es k e t c h m a p o f m s t n - 1w i t h p h a n n i b a l v e c t o r ( 1 ) p m d - m s t n - 1 和p h a n n i b a l 载体的b a m h i i c l a l 双酶切处理 沈阳农业大学硕士学位论文 b a m h f c a i 双酶切重组质粒p m d - m s t n l 和p h a n n i b a l 载体，酶切体系如下： p m d - m s t n 一1d n a p l a s m i d l o mb u f f e r b a m c k i d d h 2 0 t c ，t a l 酶切时间 6 i 口u l 5 u l 2 j u l 2 5 u l 3 0 u l 1 0 0 u l 6 1 1 p h a n n i b a lp l a s m i d l o mb u f f e r b a r n m c k i d d h 2 0 t o t a l 酶切时间 3 0 u l 2 5 u l 1 2 5 u l 1 2 5 u l 1 5 u l 5 0 u l 3 h 反应结束后取全部反应液进行1 2 琼脂塘凝胶电泳，然后按照2 2 5 中的方法进行 胶回收相应目的片段和载体。 ( 2 ) m s t n 一1 和p h a n n i b a l 载体片断的连接 连接体系如下： p h a n n i b a ld n a m s t n 1d n a l i g a t i o ns o l u t i o n i t o t a l 2 u l 3 u l 5 u l 1 0 u l 1 6 过夜连接。 ( 3 ) 转化方法同2 2 6 ( 2 ) ，l b + a m p 培养基培养，按照2 2 6 ( 3 ) 步骤提质粒。 ( 4 ) 将通过菌落p c r 鉴定和c l a i i b a m h i 单、双酶切鉴定正确的重组质粒命名为 p h a n - m s t n l 。 2 2 9m s t n - 2 的亚克隆 具体试验步骤包括k p n f x h o i 双酶切p e g m - m s t n 2 和p h a n - m s t n l ，1 2 琼脂 糖凝胶电泳，回收相应的目的片段，片断和载体的连接、连接产物转化大肠杆菌、阳性 2 9 第二章m s l n 基因r n a i 双元表达载体的构建 克隆的培养和鉴定： m s t n - i 亚克隆过程示意图如( 图2 - 4 ) 图2 - 4m s t n - 2 与p h a n - m s t n l 亚克隆示意图 f j g 2 - 3t h es u b c o l n em c e t c h m a po f m s t n - 2w i t hp h a n - m s t n l ( 1 ) p e g m m s t n 2 和p h a n m s t n l 的双酶切处理 k p n i i x h o i 双酶切重组质粒p e g m m s t n - 2 和p h a n m s t n t ，酶切体系如下： p e g m - m s t n - 2d n a p l a s m i d l o kb u f f e r k p n i 勋d i d d h 2 0 t o t a l 酶切时间 6 0 u l 5 u l 2 5 u l 2 5 u l 3 弧l 1 0 0 u l 6 h p h a n m s t n ip l a s m i d l o kb a f t e r k p n i 劢d i d d h 2 0 3 0 u l 2 5 u l 1 2 5 u l 1 2 5 u l 1 5 u l 沈阳农业大学硕士学位论文 t o t a l 酶切时间 5 0 u l 3 h 反应结束后取全部反应液进行1 2 琼脂糖凝胶电泳，然后按照2 2 5 中的方法进行 胶回收相应目的片段和载体。 ( 2 ) m s t h - 2 和p h a b i - m s t n i 的连接 连接体系： p h a n - m s t n id n a m s t n - 2d n a l i g a t i o ns o l u t i o n i t o t a l 2 u l 4 u l 5 u l 1 0 u l 1 6 c 过夜连接。 ( 3 ) 转化方法同2 2 6 ( 2 ) ，l a + a m p 培养基培养，按照2 2 6 ( 3 ) 步骤提质粒。 ( 4 ) 将通过b a m h i i x h o i 单、双酶切鉴定正确的重组质粒命名为p h a n - m s t n t - m s t n 2 。 2 2 1 0 构建m s t n 基因r n a i 双元表达载体 具体试验步骤包括b a m h l l x h o i 双酶切p h a n - m s t n i m s t n 2 和p e g f p - n 1 ，1 2 琼脂糖凝胶电泳，回收相应的目的片段，片断和载体的连接、连接产物转化大肠杆菌、 阳性克隆的培养和鉴定： 构建示意图如( 图2 - 5 ) 。 围2 - 5m s t n 基因r n a i 双元衰达载体的构建 f i g 。2 - 5 ( b n 醴眦幻n0 1 1r h a ib i n a r yv e c t o r o f m s t n 3 1 第二章m s t n 基因r n a i 双元表达载体的构建 ( 1 ) b a m h l x h o l 双酶切重组质粒p h a n - m s t n l - m s t n 2 和p e g f p - n 1 ，酶切体系如下： p h a n - m s t n l - m s t n 2p l a s m i d 1 0 kb u f f e r b a 掰m x h d i d d h 2 0 t o t a l 酶切时间 6 0 u l 5 u l 2 5 u l 2 5 u l 3 0 i l l 1 0 0 u l 6 h p e g f p - n 1p l a s m i d l o kb u f f e r b 口m m 黝d i d d h 2 0 t o t a l 酶切时间 3 0 u l 2 5 u l 1 2 5 u l 1 2 5 u l 1 5 u l 5 0 u l 3 h 反应结束后取全部反应液进行1 o 琼脂糖凝胶电泳，然后按照2 2 5 中的方法进行 胶回收相应目的片段和载体。 ( 2 ) m s t n i m s t n 2 与p e g f p - n i 的连接： m s t n t m s t n 2d n a p e g f p - n id n a h g a t i o ns o l u t i o n i t o t a l 2 u l 3 u l 5 u l 1 0 1 1 l 1 6 过夜连接。 ( 3 ) 转化方法同2 2 6 ( 2 ) ，在l b + k a n 的培养基中培养，按照2 2 6 ( 3 ) 提质粒。 ( 4 ) b a m h l l x h o i 单、双酶切鉴定正确的重组质粒即为m s t n 基因的r n a i 双元表达载体， 将其命名为p e g f p - n 1 - m s t n l - m s t n 2 ，至此已经将r n a i 双元表达载体构建完成。 2 3 结果 2 3 1m s t n 基因片断的扩增 用本实验室已经得到的大骨鸡m s t n 序列，与g - e n b a n k 中其它动物m s t n 基因 沈阳农业大学硕士学位论文 的e d n a 序列进行b l o t 比较，找其保守区，借助咖p r 】【m 盯5 0 软件以其保守区为模 板设计对特异性引物，其中在引物上下游分别加上b a m h i 和c a i 酶切位点的引物为 p f i m e f m s t n - 1 ，在引物上下游分别加上k p n i 和x h o i 酶切位点的引物为p l j m o f m s t n 2 ， 以实验室保存的大骨鸡胚胎m s t n 基因e d n a 为模板。成功扩增的出两段长度为3 9 3 b p 的相同m s t n 基因d n a 片段，与预期大小相符，可初步判断为m s t n 基因的部分保守 片断，将两片段分别命名为m s t n 1 和m s t n - 2 。p c r 结果如( 图2 4 i ) 。 圈2 - 6 大骨鸡黔佃基西保守区部分片段麟扩增结果 f i g 2 - 6p c ra m p li f i o a t i o l lp r o d u a t 5o f8 i f b o n ao h i c e n l e gn t u s c l o sm y o s t a t i i lo o n s e r v a t i v r e g i o l l m ：d n a m a r k 耐d l 2 0 0 0 ) l ：m s t n 一1 ( 3 9 3 b p ) 2 ：m s t n n 3 9 3 b p ) 2 3 2m s t n 基因片断的克隆 m s t n - 1 和m s t n 一2 经切胶回收分别与p m d1 8 - ts i m p l ev e c t o r 和p e g m - te a s y v e 叫k ) r 连接后转化感受态细胞，在含有氨苄青霉素和i p t g 的l b 培养基中培养，通过蓝、 自斑筛选具有氨苄青霉素抗性的菌落，如( 图2 - 7 ) ，随机挑选耐药性的白色菌落做菌落 p c r 鉴定，对菌落p c r 鉴定为的阳性菌落摇菌提质粒，单双酶切鉴定后将正确阳性质 粒分别命名为p m d - m s t n 1 和p e g m - m s t n 2 ，质粒电泳结果如( 图2 - 8 ) 。双酶切 p m d - m s t n - i 和p e g m - m s t n - 2 阳性质粒，电泳检测结果如( 图2 - 9 ) 显示。 白斑 圈2 7t 克隆的兰，白斑菌落 f i 2 - 7b l u ea n dw h i t eo o e n o b i u m lo f t ac l o n e 蓝斑 第二章m s t n 基因r n a i 双元表达载体的构建 图2 - 8p d - s t i 卜1 和p e g i i - i i s t n - 2 重组质粒电泳结果 f j 2 - 8a g a r o s e 扣ie l e a t r o o h o r e s i o fp h s t n - 1a n d 口e g - 卜t 卜2r e c o m b i m i n tp l a e m i d s m ：d n a 螂l i s 0 0 0 ) l lp m d - m s t n l ( 0 4 k b + 2 7 k b ) 2 ：p e g m - m s t n - 2 ( 0 4 0 i o a + 3 k b ) 图2 - 9 h s t h - 1 和p e g i h i s t n - 2 重组质粒的单、双酶切鉴定 f i g 48 in g l ea n dd o u b i ed i g e s t i o no fp i l d - m s t n 一1 、 p e g m 舶t n - 2r e c o m b i n a n tp i a s m i d m ：d n a m a r h 玎d l 4 5 0 0 ) l ：p m d m s l n 1 ( a b o u t3 0 k b ) 2 - 4 ：p m d - m s t n ls i n g l ea n dd o u b l ed i g e s t e db yb a m h ia n dc a l 5 ：p e g m - m s t n - 2 ( a b o u t3 4 k b ) 6 - 8 ：p e g m - m s t n 一2s i n g l ea n d d o u b l e d i g e s m d b y k o n i a n d x b o i 2 3 3t a 克隆测序结果 将p m d - m s t n l ，p e g m - m s t n - 2 两质粒送交宝生物工程( 大连) 有限公司进行测 序，测序结果如( 图2 - 1 0 ) ： c t g g g a i ，i t g c t g g t g t a c c a g g t g a g t g t g c g g g t n r r r i 了r 1 3 t a g a a a c a c a a 戌n g c 硝r r i ：r i c g g a g c a g t a 爿r r i ) g c l r r