（作物遗传育种专业论文）水稻黄叶基因ygl3的遗传分析和精细定位.pdf

u n i v e r s i t yc o d e ：! q 鱼3 s t u d e n tn u m b e r ：1l2 0 0 8 3 2 6 0 0 218 5 d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e r sd e g r e eo f s o u t h w e s tu n i v e r s i t y g e n e t i c a n a l y s i sa n d f i n em a p p i n go fa y e l l o wg r e e nt e a l ( m a s t e rd e g r e ec a n d i d a t e ：d up e n g s u p e r v i s o r ：p r o f h eg u a n g h u a d i s c i p l i n e ：c r o pg e n e t i c sa n db r e e d i n g d i r e c t i o n ：r i c em o l e c u l a ra n db r e e d i n g c h o n g q i n g 。c h i n a m a y , 2 0 1 1 西南大学硕士学位论文 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 第1 章文献综述1 1 1叶色突变体的来源与分类1 1 3 第2 章 第3 章 3 1 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 1 1 1 叶色突变体的来源l 1 1 2 叶色突变体的分类2 叶色突变体的生理生化研究进展一5 1 2 1水稻叶绿素合成缺陷突变体表型与叶绿素含量的关系5 1 2 2 水稻叶绿素合成缺陷突变体的叶绿体结构6 1 2 3 水稻叶绿素合成缺陷突变体的氨基酸含量一6 1 2 4 水稻叶绿素合成缺陷突变体的蛋白质7 1 2 5 水稻叶绿素合成缺陷突变体的叶绿素生物合成7 1 2 6 水稻叶绿素合成缺陷突变体的光合特性8 叶色突变体的分子生物学研究进展9 1 3 1 叶色相关突变发生的分子机理一9 1 3 2 水稻叶色突变体的遗传方式1 0 1 3 3 水稻叶色突变体的基因定位1 0 1 3 4 水稻叶色突变体的基因图位克隆1 3 叶色突变体的应用价值1 3 1 4 1叶色突变体可应用于植物生理学和基因组学的研究1 3 1 4 2 叶色突变体能作为一种优良的种质资源1 4 1 4 3 叶色突变体是观赏植物新品种培育的重要来源1 4 1 4 4 叶色突变体基因导入不育系能简化种子纯度鉴定程序1 4 弓i 言1 6 材料与方法1 7 供试材料1 7 突变体农艺性状调查1 7 突变体和野生型的超显微结构观察17 叶绿素含量的测定1 7 s o d 酶活性分析18 叶绿素荧光动力学参数测定18 西南大学硕士学位论文 目录 3 7 遗传群体的构建1 9 3 8 水稻d n a 的提取1 9 3 8 1 c 1 a b 法1 9 3 8 2 简易碱煮法1 9 第4 章结果与分析2 0 4 1 突变体的农艺性状调查和表型分析2 0 4 2 叶绿素含量的测定2 0 4 3 光合速率和叶绿素荧光参数的测定2 1 4 4 透射电镜的观察2 2 4 5 s o d 酶活性的测定2 3 4 6 遗传分析2 3 4 7 分子定位2 4 第5 章结论与讨论2 7 5 1 结论2 7 5 1 1 y g l 3 突变体的表型分析和农艺性状调查2 7 5 1 2y g l 3 突变体的叶绿体超微结构观察2 7 5 1 3 y g l 3 突变体的叶绿素和s o d 酶含量测定一2 7 5 1 4 y g l 3 突变体的遗传分析2 7 5 1 5 y g l 3 基因的精细定位2 7 5 2 讨论2 7 参考文献3 0 j ! e 谢3 5 在校期间所参加科研课题和发表论文3 6 西南大学硕士学位论文摘要 水稻黄叶基因y g l 3 的遗传分析和精细定位 作物遗传育种专业硕士研究生：杜鹏 指导教师：何光华教授 摘要 光合作用植物所特有的细胞器是叶绿体，叶绿素是叶绿体中进行光合作用的主 要色素成分。黄叶突变体不仅可以直接揭示叶绿素的合成和代谢，并且对于阐明 叶绿体发育过程，光合作用进行过程及环境信号对叶绿体和其它光合相关器官的 形态建成等问题，都有着重要的意义。本研究利用甲基磺酸乙酯( e m s ) 诱变水 稻恢复系缙恢1 0 号，在突变体库中发现了一个黄叶突变体，将该突变体命名为y g l 3 。 对其形态特征、叶绿素含量的动态变化、荧光动力学参数、农艺性状、叶绿体显 微结构、s o d 酶活性等参数进行了测定和观察，并对该基因进行了精细定位，主 要结果如下： 1 y g l 3 突变体的表型分析和农艺性状分析 叶片在整个生育期均表现为黄色，即使在生育后期也不恢复为绿色，而且叶 鞘也表现黄色，也是全生育期型的，能正常结实。各项农艺性状显著降低，特别 是有效穗和主穗重，分别降低了4 3 和3 0 。 2 y g l 3 突变体的叶绿体超微结构 野生型苗期叶片的叶绿体，有大量垛叠的基粒类囊，而突变体苗期叶片的叶绿 体，基粒类囊呈现空的片层状，且排列不规则。 3y g l 3 突变体的叶绿素和s o d 酶含量 突变体y g l 3 的叶绿素含量明显降低，包括叶绿素a ，叶绿素b 和总叶绿素。全 生育期y g t 3 的平均叶绿素含量是1 0 9m g g ，显著低于野生型的3 2 6 m g g 。突变体 k 记3 的s o d 酶活性也显著升高。 4 y g l 3 突变体的遗传分析 西南大学硕士学位论文摘要 采用2 个保持系与y 9 1 3 进行正反交，1 个不育系与y g l 3 进行杂交，结果5 个 组合f l 叶色均表现绿色，说明该黄叶性状受隐性核基因控制，不受细胞质影响。 f 2 分析表明，绿色与黄叶分离比例符合3 ：1 ，表现为1 对基因的遗传方式。因此， 该黄叶性状由一对隐性核基因控制。 5y g z 3 基因的分子精细定位 y g l 3 基因被定位在第3 染色体长臂末端上，位于标记s w u 3 1 和s w u 3 2 之 间1 0 1 k b 的区域。 6 候选基因的分析 镁离子螯合镁d 亚基( m a g n e s i u m c h e l a t a s es u b u n i tc h l d ) 与该黄叶性状高度 相关，但该基因是否是编码镁离子螯合镁d 亚基的基因，或者是其他的尚未发现 的基因，还有待进一步定位及对相关候选基因的互补验证。 关键词：水( o r y z a s a t i v al ) ；黄叶突变体( y g l 3 ) ；遗传分析；精细定位 i i 曲南大字臼贝士竿位诧又 a b s t r a c t g e n e t i c a n a l y s i sa n d f i n em a p p i n go fa y e l l o wg r e e nl e a f ( r g l 3 ) g e n ei nr i c e ( o r y z as a t i v al ) m a jo r ：c r o pg e n e t i c sa n db r e e d i n g a u t h o r ：d up e n g t u t o r ：h eg u a n g h u a a b s t r a r t c h l o r o p l a s t sa r et h es i t eo fp h o t o s y n t h e s i si np l a n t sa n do t h e rp h o t o s y n t h e s i z i n g o r g a n i s m s c h l o r o p h y l li st h em o s tm o l e c u l eo fp h o t o s y n t h e s i si nc h l o r o p l a s t s ，t h e d e f e c t i v e s y n t h e s i so fc h l o r o p h y l li s ac o m m o nm u t a n tt y p ei nn a t u r e t h ec o l o r v a r i a t i o no fl e a fi st h eo u t s t a n d i n gf e a t u r e t h ed e f e c t i v es y n t h e s i so fc h l o r o p h y l li sn o t o n l yt od i r e c t l yr e v e a lt h es y n t h e s i sa n dm e t a b o l i s mo fc h l o r o p h y l l ，b u ta l s ot oe x p l a i n t h ed e v e l o p m e n tp r o c e s so fc h l o r o p l a s t sa n dm o r p h o g e n e s i so fc h l o r o p l a s t sa n do t h e r o r g a n sw h i c ha r ei n f l u e n c e db ye n v i r o n m e n ts i g n a l t h e ya l lh a v et h ei m p o r t a n t t h e o r e t i c a lv a l u ea n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e i nt h i sp a p e r ，j i n h u i10h a sb e e ni n d u c e db y e m s ，i nw h i c hw eh a v ef o u n day e l l o wm u t a n ty g l 3 t h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r , t h e d y n a m i cc h a n g eo fc h l o r o p h y l lc o n t e n t ，t h ef l o r e s c e n c ed y n a m i cp a r a m e t e r , e c o n o m i c a l c h a r a c t e r , t h em i c r o s t r u c t u r eo fc h l o r o p l a s t s ，s o de n z y m ea c t i v i t ya n do t h e rp a r a m e t e r s h a v eb e e ns u r v e y e da n do b s e r v e d i na d d i t i o n , y g l 3h a sb e e nl o c a t e do ng e n e t i c sm a p t h em a i n l yr e s u l t sa sf o l l o w s ： 1 t h em o r p h o l o g i c a la n a l y s i sa n de c o n o m i c a lc h a r a c t e ro f y g l 3 t h el e a fo fy g l 3a l w a y se x p r e s s e sy e l l o wi nt h ew h o l eg r o w t h e v e ni nt h el a t e g r o w t hp e r i o d ，t h ey e l l o wc o l o rd o e sn o tc h a n g et og r e e n m o r e o v e r , s h e a t ha l s os h o w y e l l o wa n dh a sn o r m a ls e t t i n gp e r c e n t a g e o t h e re c o n o m i c a lc h a r a c t e rl e a dt oam a r k e d l o s si na b s o l u t ep l a n ta n dt h ew e i g h to fm a i n l ys p i k e s ，w h i c ha r ed e c r e a s e dt o0 4 3 ，0 3 ， r e s p e c t i v e l y , 2 t h eu l t r a s t r u c t u r eo f y g l 3 i i i 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ec h l o r o p l a s to fl e a fo fw i l dt y p ei ns e e d i n gs t a g eh a sg r a n u mt h y l a k o i d ，w h i c h a r es t a c k i n ge a c ho t h e r b u tg r a n u mt h y l a k o i do fy g l 3e x p r e s se m p t yl a m e l l a ra n da l s o i r r e g u l a r 3 n l ec h l o r o p h y l lc o n t e n ta n ds o d e n z y m ea c t i v i t yo f y g l 3 n l ec h l o r o p h y l lc o n t e n to f y g l 3w a sd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y , i n c l u d i n gc h l o r o p h y l l 钆c h l o r o p h y l lba n dt o t a lc h l o r o p h y l l r n l ea v e r a g eo fc h l o r o p h y l lc o n t e n to fy g l 3i s 1 0 9m e g gi nw h o l eg r o w t h , w h i c ha r es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di n3 2 6 m g go fw i l dt y p e h o w e v e r , s o de n z y m ea c t i v i t yh a si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y 4 g e n e t i ca n a l y s i so f y g l 3 t w om a i n t e n a n c el i n ea n dy g l 3a n do n es t e r i l e l i n eh a v er e c i p r o c a lc r o s s e d ，t h e f i v ea s s o c i a t i o no ff l a r ea l w a y ss h o w i n gg r e e n , w h i c hi l l u s t r a t e dt h eg e n ea r e c o n t r o l l e db yr e c e s s i v en u c l e a rg e n e n l er e s u l t so ff 2s h o w st h a tt h ep r o p o r t i o no f g r e e na n dy e l l o wi s3t o1 ，w h i c hd e m o n s t r a t e dt h eg e n ei sc o n t r o l l e db yap a i ro fg e n e t h e r e f o r e ，t h ec h a r a c t e ro fy e l l o wl e a fi sc o n t r o l l e db yap a i ro fr e c e s s i v en u c l e a rg e n e 5 f i n em a p p i n go fy g l 3 t h eg e n eo fy g l 3i sm a p p e do nt h el o n ga r mo fc h r o m o s o m e3 w h i c ha r el o c a t e d b e t w e e ns s rm a r k e rs w u 3 1a n ds w u 3 - 2 ，t h ep e r i o do f10 1 k b 6 a n a l y s i so fp r e d i c t e dg e n e s m a g n e s i u m c h e l a t a s es u b u n i tc h l d i s h i g h l yc o r r e l a t e dw i t hy g l 3p h e n o t y p e h o w e v e r ，w h e t h e rt h eg e n eh a se n c o d e dr h eg e n eo fm a g n e s i u m c h e l a t a s es u b u n i tc h l d o ro t h e rg e n e st h a th a v en o tb e e nd i s c o v e r e dn e c e s s a r i l yn e e dt om a k ef u r t h e rl o c a t i o n a n dc o m p l e n e n t a r yv e r i f i c a t i o nw i t ho t h e rr e l a t i v eg e n e s k e yw o r d s ：r i c e ( o r y z as a t i v al ) ；y e l l o wg r e e nl e a fm u t a n t ( y g l 3 ) ；g e n e t i ca n a l y s i s ； g e n ef i n em a p p i n g i v 西南大学硕士学位论文文献综述 第1 章文献综述 粮食不但是人类赖以生存和进行社会经济活动的能源基础，而且也是保持社会和 谐发展与稳定的重要战略物资。对于我国最重要的粮食作物水稻就是其中之一，在我 国5 0 以上的人口是以稻米为食粮。2 0 0 4 年，我国水稻有2 8 4 百万公顷的种植面积， 总产量1 7 9 1 百万吨，分别占了谷类作物种植面积和总产量的3 6 6 和4 4 2 ，而且 稻谷总产量是居于世界第一。因此，水稻在我国国民经济中占有举足轻重的地位。 叶绿素在植物叶绿体内，它是参与了光合作用的重要色素。叶绿素合成缺陷突变 是一类非常明显的性状突变，早在3 0 年代就有所研究( s u z u k i 等1 9 9 7 ) 。叶绿素合 成缺陷突变体不仅在高等植物的叶绿素生物合成，光合作用，叶绿体结构、功能、遗 传、分化与发育以及细胞器的移植、细胞融合、遗传转化、基因表达调控等基础研究 中都具有十分重要的意义，而且作为标记性状在杂种优势利用中利用( 马志虎等2 0 0 1 ， z h a o 等2 0 0 0 ，赵海军等2 0 0 4 ) ，如利用淡绿叶性状作为标记性状可以比较好地解决 两系法杂交稻的制种纯度问题，从而为两系法杂交稻应用于生产提供一条新的途径。 因此，鉴定控制水稻叶绿素合成的突变体基因，不断开展叶绿素合成缺陷突变基因定 位、克隆及其突变体作用机理等方面的研究，都具有重要的理论意义和应用价值。 1 1 叶色突变体的来源与分类 1 1 1 叶色突变体的来源 叶色突变体的来源十分广泛，其中包括人工诱发突变、自发突变、基因沉默突变 和插入突变。每种来源的突变体都各有其优缺点。 自发突变在自然条件下发生，没有经过复杂的生物技术操作手段，而是将其直接 用于常规育种，不存在转基因的安全性问题。但是自发叶色突变的频率极低，即便是 获得了不错的突变体，也需要通过繁琐的图位克隆法分离自发突变基因，时间长，难 度大。这些不利因素也极大限制了自发叶色突变在功能基因组学研究中的利用。 人工诱发植物基因突变是选育新品种、创造新种质的有效途径。通过人工诱变可 在较短时间内获得大量不同类型突变体，由此而产生的叶色突变已广泛应用于育种工 作中，并取得了很大的成就( z h a o 等2 0 0 0 ) 。然而诱发突变在功能基因组学研究中的 应用价值十分有限。理化因素通常诱发点突变和缺失突变，仍需通过图位克隆的方法 分离突变相关基因；组织培养引起的染色体重排和断裂，( p h i l l i p s 等1 9 9 4 ) 以及d n a 西南大学硕士学位论文文献综述 甲基化( k a e p p l e r 等1 9 9 8 ) ，在基因功能鉴定中很难加以利用。 插入突变最大的好处在于，它可将插入元件作为标签从基因组中直接找出相应的 基因。从反向遗传学来看，根据目的基因设计好引物，通过p c r 从突变体库中找出 目的基因发生插入突变的叶色突变体，全面了解叶色突变基因功能。从正向遗传学来 看，鉴定插入叶色突变体，根据插入序列迅速克隆到突变基因，确定突变基因功能， 阐明叶色突变机制。但是值得注意的是，插入突变以转基因技术为基础，涉及到转基 因安全性问题，在将插入叶色突变体用于农业生产之前，必须对其环境安全性和食用 安全性进行深入研究并分析。 基因沉默引起的叶色突变体主要用于分析特定基因功能。目前仅从拟南芥( k u m a r 和s o i l2 0 0 0 ) 、烟草( m o n d e 等2 0 0 0 ) 等仅有的少数植物中分离出基因沉默的叶色突变 体。 1 1 2 叶色突变体的分类 叶色突变一般在苗期中表达，并且比较容易识别，因此苗期叶色一直是最为常用 的叶色突变体的分类标准。然而苗期的叶色分类法通常以表型性状为基础，具有局限 性。植物的表型性状与内部遗传物质之间的关系并不是相互对应的。同样的叶色突变 性状可能会受不同基因控制；同一基因发生突变，由于基因功能缺损的程度不同，可 能会造成不同的表现类型。k u m a r 和s 0 1 1 ( 2 0 0 0 ) 将h e m a 基因( 编码谷氨酰t r n a 还 原酶) 的反义r n a 转入拟南芥后，转基因植株问即存在明显的叶色差异，并且叶色 变异程度与h e m a 基因的表达水平成反比。番茄黄叶突变体a 1 2 和y g - 2 的表型性状极 为相似，但研究表明在这两个突变体中分别发生了血红素加氧酶和光敏色素生色团合 酶基因突变( t e r r y 和k e n d r i c k1 9 9 9 ) 。由此可见，简单以叶色为标准对突变体进行划分， 有可能不利于研究基因的生物学功能。但由于还未能找到更为合理的分类方法，所以 目前仍然根据苗期叶色表现划分叶色突变体。 大多数水稻叶色突变体的显著特征是叶片表现为不正常的颜色，多数在苗期表 达，出现诸如白化、黄化、浅绿、条纹、斑点等叶色表型，其中白化，黄化的叶色突 变体出现最多。 据不完全统计，目前水稻中已发现7 7 个相关的叶色突变体( 表1 1 ) ，其中包括 白化1 2 个，黄化1 6 个，条纹1 1 个，转绿型1 4 个，斑点1 4 个等5 大类型。从表中 2 i i i i i i i i 宣i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 宣i i i i i i i i i i _ _ 。o 。_ 。 可以看出除了第1 2 染色体外，其他1 1 条染色体都有叶色突变基因的分布。 表1 1 水稻中已报道的叶色突变体( 自吴自明2 0 0 7 ) t a b l e l 1 l e a fc o l o r a t i o nm u t a n t sr e p o r t e di nr i c e ( f r o mw u z i m i n g2 0 0 7 ) 类型 总数突变体符号 染色体距禺( c m ) t y p e t o t a lm u t a n t ss y m b o l c h r o m o s o m ed i s t a n c e 1 2 a d s 白化 禾知禾知 a l - v ( t ) 4 未知 a u ( d k l ) 6未知 a l l o3 7 3 a 1 25 1 1 1 a 1 3 55 1 口脾 11 0 6 口巧 4未知 a 1 6 ( t ) 55 6 a17(t)4 未知 a z 8 1未矢口 a 1 9 ( t ) 6未知 浅绿 1 b g 5 8 2 黄化 1 6 c h t l ( c h l ) 3 1 8 8 c h l l o 2 1 4 2 c 办陀 3 7 3 c h l 3 3 1 6 5 c h l 46 8 2 c h l 5 1未知 c 办形 1 8 4 c h l 7 6未知 c h l 8 8未知 c h l 98未知 c h s l ( t ) 9未知 3 西南大学硕士学位论文文献综述 4 西南大学硕士学位论文文献综述 1 2 叶色突变体的生理生化研究进展 1 2 1 水稻叶绿素合成缺陷突变体表型与叶绿素含量的关系 水稻叶绿素合成缺陷突变体的叶绿素含量变化总是与突变体表型变化有一定关 系。夏英武( 1 9 9 6 ) 等的研究发现叶绿素含量的变化规律与叶色表型变化相符，白色转 绿型突变系w 2 5 转绿前时叶绿素含量明显低于正常株，随着叶色的加深，叶绿素的含 量逐渐增加，完全转绿时，叶绿素含量达到正常植株的水平。随后，何瑞峰等( 2 0 0 1 ) 西南大学硕士学位论文文献综述 对“斑马叶”水稻突变体的叶绿素含量分析表明：叶片间断失绿，叶绿素含量的下降、 上升与“斑马纹”的出现、消失相一致。一般认为叶色的深浅是叶绿素含量的外在表现， 但林任琼( 2 0 0 2 ) 等的研究发现t 1 5 2 4 4 1 的叶色比野生型略淡些，叶绿素a ，叶绿素b 和总叶绿素的含量却明显高于野生型。 1 2 2 水稻叶绿素合成缺陷突变体的叶绿体结构 叶绿体是植物进行光合作用的主要场所，多数研究发现由叶绿素合成缺陷而产生 的突变体，其叶绿体内部结构也将发生一定变化。s u n 等( 1 9 7 4 ) 对水稻白化苗叶片的 质体观察表明，叶中前质体存在，并可以发育出初始片层，但不能发育成相关基粒， 质体中有d n a 状纤丝存在，但无核糖体，故认为核糖体的缺失不能合成蛋白质，可 能是造成白化的直接原因。吴殿星等( 1 9 9 7 ) 对白化转绿突变体w 2 5 的叶绿体结构分析 发现，完全白化的叶绿体轮廓完好，但内部的结构简单，缺乏丰富、高度组织化的内 膜系统，部分转绿和完全转绿叶片的叶绿体已有基粒和基粒片层结构，但完全转绿的 基粒片层层数也较多。此性状受细胞核内单个基因控制，核基因位点的突变对叶绿体 的发育有不利影响。邵继荣等( 1 9 9 9 ) 观察了水稻间断失绿突变体1 1 0 3 s ，在性状表达期 间，淡黄区的叶绿体类囊体膜发生了不断产生退化，基粒垛叠片层数明显减少，有的 甚至整个叶绿体为囊泡状的结构。但在同一叶片的绿区，只是基粒片层数减少，排列 相当不规则，嗜饿小球聚集。在叶片复绿的过程中，失绿区的变化可以逆转，内部结 构发生重组，最后再恢复正常。 1 2 3 水稻叶绿素合成缺陷突变体的氨基酸含量 吴殿星等( 1 9 9 7 ) 研究了白化转绿型突变体w 2 5 在转绿时两种不同温度下氨基酸含 量，结果表明：s e r ，g l u ，v a l ，a r g ，p r o ，t h r 变化比较大，s e r ，g l u ，v a l 在2 5 比2 0 时低，但a r g ，p r o ，m 却相反，尤其是m 变化较明显，其含量在2 0 时很 低，而在2 5 时却接近亲本水平。在2 0 下w 2 5 三叶期完全不能转绿，喷洒1 0 0m g l 的t h r 有较好的转绿效果，这说明t h r 与其转绿有密切的关系。谢戎等( 2 0 0 1 ) 对“斑马” 突变体1 1 0 3 s 的氨基酸含量进行分析，结果发现在性状表达时，g l u ，a s p 的含量比正 常植株略高，而其它氨基酸的含量下降；在复绿时，g l u ，a s p 和m e t 的含量下降， 其它氨基酸含量不断上升。说明此期间氨基酸代谢表现出部分的阻遏调控作用。 6 西南大学硕十学位论文文献综述 1 2 4 水稻叶绿素合成缺陷突变体的蛋白质 对间断失绿的突变体1 1 0 3 s 研究发现，在性状表达期间，蛋白质含量随性状的表 达不断锐减，蛋白酶活性增高。p a g e 扫描结果发现，处理前后2 5k d ，2 0k d ，4 1k d ， 5 0k d 含量比较高，特别是2 5k d 蛋白；在性状表达期间，它们的含量一直都在减少， 但黄区比绿区减少更为明显，比较黄、绿区发现，黄区缺少1 8k d 蛋白，绿区含量也 极少。有的研究认为1 8k d ，3 0k d ，2 4k d 是p si i 中水裂解释放氧的酶系统重要多肽 结构蛋白，因此，黄、绿区1 8k d 蛋白的变化可能是造成同一叶片不同区域叶绿素失 绿状态不同的原因。随后，何瑞峰等( 2 0 0 1 ) 又对1 1 0 3 s 及其转育的具“斑马”性状的武 金4 b 蛋白含量进行分析，结果表明性状表达时，蛋白质含量降到最低点，仅为低温 处理前的一半左右，且黄区的含量仅为绿区的一半左右，而此时对照的蛋白质含量则 逐渐上升。田红英等( 2 0 0 2 ) 又对叶绿体功能蛋白进行分析，发现r u b i s c o 酶的大、小 亚基的结构和分子量在降温前后和表达时基本没有变化，但酶活性却显著不同，突变 体的低于野生型。利用双向电泳对突变体和野生型研究后发现，突变体r u b i s c o 大亚 基旁的一个5 6 2k d 蛋白质位点消失，但在降温前这一特异蛋白质存在，说明这一特 异蛋白质位点可能与r u b i s c o 酶活性有关。k n c e t z e l 和s i m p a o n ( 1 9 9 1 ) 对水稻附白绿 突变系的分析表明，r u b i s c o 酶的大、小亚基缺失。l m 等( 2 0 0 3 ) 在研究两个叶绿素b 缺失的水稻突变体时后发现，可溶性蛋白和r u b i s c o 的含量明显比野生型的含量增高， 特别是r u b i s c o 酶的小亚基r s s 。胡忠( 1 9 8 3 ) 对一水稻黄绿色突变体叶绿素蛋白质复 合体进行分析，发现突变体虽然缺乏2 4k d 的捕光叶绿素a b 蛋白质复合体，但富含 2 8k d 的叶绿素a 蛋白质复合体c p 4 7 c p 4 3 。由此可以推论，捕光叶绿素a f o 蛋白质 复合体的含量与叶绿体片层的垛叠存在有正相关关系，但非垛叠片层却富有叶绿素 a f o 蛋白质复合体c p 7 c p 4 3 。翁晓燕等( 1 9 9 9 ) 在研究w 2 5 的白化期发现，蛋白质含量 极低，只为对照的3 2 1 6 ，说明白化期蛋白质合成速率远远低于对照的绿叶。r u b i s c o 酶含量，白化苗为对照绿苗的3 6 4 3 。随叶片转绿，蛋白质含量增加，在类囊体合成 的r u b i s c o 大亚基也增加，说明白化期r u b i s c o 低含量可能与缺乏类囊体片层相关。 1 2 5 水稻叶绿素合成缺陷突变体的叶绿素生物合成 植物的叶绿素如果因基因突变而使某一合成过程受阻，就会引起叶绿素含量的异 常。崔海瑞等( 2 0 0 1 ) 为了研究温度对水稻突变叶色机理的影响，研究了具有苗期白化 7 西南大学硕十学位论文文献综述 i l l 可复绿的温敏型叶色突变体w 1 的叶绿素生物合成过程。w 1 在低温下叶色为白色， 高温下叶色则为绿色，研究发现低温下p c h l 、m g p r o t oi x 和p r o t oi x 的含量都明显 低于高温下野生型的含量，与叶色及c h l a 的变化趋势相同；但a l a 、p b g 的积累量 却明显大于高温下的含量，且也高于同温度下野生型含量，与叶色及c h l a 的变化趋 势相反，根据叶绿素生物合成途径g l u - a l a p b g - u r o g e n l l i c o p r o g e n l i i p r o t oi x m g p r o t oi x p c h l c h l a 可知叶绿素的合成受阻，在p b g 部位缩合成的叶啉原。研究发现 m 9 2 + 离子在叶绿素的生物合成过程中具有重要的作用，它是p r o t oi x 向m gp r o t oi x 转化过程中形成四吡咯环最重要的螯合酶，几乎所有的叶绿素缺失突变体都是由于镁 螯合酶突变并导致p r o t oi x 含量升高和m gp r o t oi x 含量下降。多数研究认为具有失 绿性状突变体由于缺乏镁螯合酶通常都是致死的。镁螯合酶包含有3 个亚基，即c h l i ， c h l d 和c h l h 。j u n g 等( 2 0 0 3 ) 在研究水稻黄绿色突变体时后发现，控制此性状的 伪衄己h 基因编码镁螯合酶的最大亚基a r 彳上厨，t - d n a 插入使a 也日亚基缺失了c 。 末端，由于c 末端对c h l h 亚基的活性有影响，因此c 末端的缺失导致酶活性的降低， 从而导致该突变体叶绿素合成的受阻。 1 2 6 水稻叶绿素合成缺陷突变体的光合特性 胡忠等( 1 9 8 3 ) 在研究一水稻黄绿色突变体的光合特性后发现，突变体的叶绿素悬 浮液具有比较高的铁氰化钾光还原活性，在6 0 0 0l x 光照下，以叶绿素为单位来计算， 其光还原活性为对照的2 2 3 。在弱光下，突变体叶片同化c 0 2 速率低于对照叶片， 但在2 0 0 0 0l x 下，以单位叶面积计算为对照叶片的7 5 ，以单位叶绿素计算为对照 1 8 5 。且该突变体的捕光c h l a c h l b 蛋白质复合物极少，并且基粒明显缺乏。研究表 明，叶绿体结构与捕光c h l a b 蛋白含量成呈正相关，但它并非是光合作用基本过程所 必需。d a i 等( 2 0 0 0 ) 对一叶绿素b 含量低的突变体研究发现，其截光率是o 4 2 ，比野 生型的o 8 l 要低。该突变体在叶片全展前后主要降低了外周捕光天线色素蛋白复合体 i i 含量，只是野生型的2 3 ，到叶片发育后期接近野生型，但它的光合结构在叶片一 生中比较稳定，且在强光下似乎比野生型稳定，具有较强的耐受强光特性，与以往的 研究结果相反，即l h ci i 含量的减少并没有影响光系统i i 的稳定性，使突变体对高温 和强光的耐受性低于野生型。这可能是由于突变减少光系统截获的光能，相对提高光 能利用率，减少了0 2 3 对突变体的某些破坏。 8 1 3 1 1叶绿素生物合成结构基因突变 叶绿素分子普遍存在于光合有机体中，其生物合成是一个极其复杂、高度保守的 过程( 如图1 1 ) ( f r o m m e 等2 0 0 3 ，n a g a t a 等2 0 0 5 ，b e a l e 等2 0 0 5 ) 。叶绿素的合成 早期催化步骤( 从a l a 到p r o t oi x ) 与血红素合成早期步骤相同，这些步骤相关酶类 的鉴别都是通过研究非光合结构获得，如大肠杆菌( n a r i t a 等1 9 9 6 ) ；后续的几个步骤 与细菌叶绿素a 的合成步骤大致相同( p o n t o p p i d a n 等1 9 9 4 ，n a k a y a s h i k i 等1 9 9 5 ， t a n a k a 等1 9 9 8 ，p o r r a1 9 9 7 ，s u z u k i 等1 9 9 7 ) 。运用定向突变分析光合细菌突变体， 发现了大量参与细菌叶绿素合成的基因信，息( b o l l i v a r 等1 9 9 4 a1 9 9 4 b ) 。通过同源性分 析克隆到氧化生物叶绿素合成相关基因( j e n s e n 等1 9 9 6 ) 。随着d v r 基因鉴别，高等 植物中参与叶绿素合成的所有基因都已经被全部鉴定( n a g a t a 等2 0 0 5 ) 。n a g a t a 等 f 2 0 0 5 ) 分析拟南芥的叶绿素合成从g l u t a m y l 。t r n a 到c h l b ，共有2 7 基因，编码1 5 种 酶参与叶绿素的合成( 表1 2 ) 。除t r n a 一谷氨酰转移酶( t r n a g m ) 外，参与叶绿素 合成酶均由核基因编码( k a n n a n g a r a 等1 9 8 8 ) 。叶绿素合成途径中任何酶发生突变都可 能促进或阻碍叶绿素合成，改变叶绿体中各种色素的比例，引起了叶色变异。不同的 叶色突变类型叶绿素合成受阻的步骤存在差异( s u z u k i 等1 9 9 7 ) 。白化是由于叶绿素合 成过程中卟啉原形成受阻，如水稻聊叶色突变体( 崔海瑞等2 0 0 1 ) ；黄化、斑点、浅 绿是由于叶绿素合成酶的螯合形成步骤受阻，如水稻“斑马叶”( 何瑞锋等2 0 0 0 ) 、 o s c h l h 突变体( j u n g 等2 0 0 3 ) 、o s c h l d 和o s c h l i 突变体( z h a n g 等2 0 0 6 ) 、大麦 x a n t h a - f 叶色突变体( w e t t s t e i n 等1 9 7 6 ) ；绿白一般是由叶绿素酸酯a 形成步骤受阻， 如拟南芥的d v r 叶色突变体( n a g a t a 等2 0 0 5 ) 。此外，常绿叶色突变体可能是突变延 缓了叶绿素的降解速率，其降解过程哪一步受阻仍然不清楚( c h a 等2 0 0 2 ) 。 1 3 1 2 血红素_ 光敏色素生色团生物途径中基因突变 血红素生物合成和叶绿素生物合成是四吡咯生物合成途径的两个不同分支，原卟 9 西南大学硕士学位论文文献综述 啉与m 孑+ 螯合产生镁原卟啉，与f e 2 十螯合形成血红素，血红素经一系列反应最终 形成光敏色素生色团。叶绿素合成速率受细胞内血红素含量的影响，若血红素_ 光敏 色素生色团途径受阻，细胞内血红素含量则上升，引起突变体叶色变异( t e r r y 和 k e n d r i c k1 9 9 9 ) 。缺乏光敏色素生色团的叶色突变体是研究血红素对叶绿素合成的调节 作用的理想的材料。光敏色素生色