（植物病理学专业论文）淡紫拟青霉固体发酵技术研究.pdf

华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 摘要 淡紫拟青霉( p a e c i l o m y c e sl i l a c i n u s ) 是根结线虫、胞囊线虫等线虫的寄生菌，具有 防治植物线虫病害的潜力。本文研究了淡紫拟青霉固体发酵基质、固体发酵工艺和淡 紫拟青霉应用。 固体发酵基质的初步筛选，首先根据淡紫拟青霉3 6 1 菌株在小麦粉、玉米粉、 稻谷粉琼脂培养基上生长差异，确定淡紫拟青霉固体发酵的主要营养物质为玉米粉： 以发酵产物孢子含量为指标，兼顾发酵原料成本，筛选出淡紫拟青霉固体发酵比较理 想的基本配方：玉米秆：玉米粉为1 ：1 ，米糠：玉米粉为l ：1 ( 重量比) 。 淡紫拟青霉3 6 1 固体发酵菌种配方筛选是以发酵产物易分散、不易污染、孢子 含量和产孢产量等为指标，确定固体发酵菌种的配方为：米糠玉米粉清水= o 3 ：0 3 ： 0 4 ( 重量比) 。菌种配方接种后在2 5 条件下发酵l o d 后，孢子含量为2 2 9x1 0 9 ( 4 g 湿重) ，产孢量为3 1 2x1 0 9 ( 个儋投入干料) 。 淡紫拟青霉3 6 1 固体发酵化生产配方是以成本、孢于含量、产孢产量等为指标。 单因子试验表明，水分含量和外加氮源对淡紫拟青霉3 6 1 菌株的生长及发酵产物孢 子含量和产量影响比较大生，水分含量为6 0 比较好，有利于菌丝生长和产孢；外加 氮源中以加硫酸铵含量为o 5 左右比较好，可显著提高发酵产物的孢子含量和产孢 量；添加蔗糖则影响不大。以玉米秆、米糠、玉米粉、硫酸铵为因子进行正交试验表 明，影响发酵产物产孢量大小依次为：硫酸铵 玉米秆 米糠 玉米粉。经不同因子不 同水平对产孢量的影响分析与验证，生产配方最终确定为：玉米秆米糠玉米粉 = o 6 o 彰1 5 ( 重量比) ，硫酸铵含量为o 1 ，加水含量5 0 o 。生产配方接种后在2 5 条件下发酵l o d 后，孢子含量为7 2 9 x1 0 9 ( 个儋湿重) ，产孢量为7 7 7 x1 0 9 ( 个 儋投入干料) 。 淡紫拟青霉固体发酵工艺研究主要是接种量、发酵周期及固体发酵产物室温下贮 存时间对孢子萌发的影响。当菌种孢子含量达1 0 9 ( 个g 湿重) 以上时，接种量为1 0 9 6 ： 在温度为2 5 1 2 ，自然湿度条件下，淡紫拟青霉发酵周期为1 0 1 2 d ；室温下贮存时间 对孢子萌发影响很大，保存时间2 1 1 个月，孢子萌发率仍保持在9 0 左右。 耐药性测定表明，淡紫拟青霉3 6 1 对多菌灵、百菌清、苯醚甲环唑、丙环唑等 很敏感，因此不宜和这些杀菌剂混用，但对常用杀虫剂阿维菌素和辛硫磷不敏感，可 以考虑和这些杀虫剂混用，以提高防治线虫的效果。 关键词：淡紫拟青霉；固体发酵：玉米秆；生物防治 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 a b s t r a c t p l a n tp a t h o g e n i cn e m a t o d e sc a u s es e r i o u sd i s e a s e so fm a n yc r o p s ，w h i c hl e a d st ol o s s e s o f10 p r o d u c t i o na n n u a l l yi nt h ew o r l d ，a n dc a u s e sc r o pl o s s e so v e r $ o 3b i l l i o na n n u a l l y i n c h i n a ，m y l o i d o g y n ea n dh e t e r o d e r aa r et w oo fm o s ti m p o r t a n tn e m a t o d e s b i o c o n t r o li s f r i e n d l y t oe n t i r o n m e n ta n dd u r a b l e ，w h i c hp r e v a i l sm o r ea n dm o r e p a e c i l o m y c e sl i l a c i n u s ，an e m a t o p h a g o u sf u n g u s ，h a sg r e a tp o t e n t i a l f o rb i o c o n t r o l n e m a t o d ed i s e a s e s s o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o ns u b s t r a t e ，s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o nt e c h n i c s ，a n dp e s t i c i d e t o l e r a n c eo fp 1 i l a c m 岱w e r es t u d i e di nt h i st h e s i s b a s e do nt h ec o n i d i a lc o n t e n to ft h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t i o na n dt h ec o s to f f e r m e n t a t i o ns u b s t r a t e ，t h eb a s i cf o r m u l aw a ss c r e e n e d r a t i oo ff i c eb r a n c o mf l o u r w a t e r w a s0 3 1 0 3 1 0 4i nt h ei a o c u l u mf o r m u l a a f t e ri n o c u l a t e da n df e r m e n t e d10d a y sa t2 5 。c ， t h ee o n i d i a lc o n t e n to ft h ei n o c u l mp r o d u c t i o nw a s3 12 1 0 9 ( c o n i d i a gd r ys u b s t r a t e ) a n a l y z e dt h ee f f e c to fd i f f e r e n tf a c t o r st oc o n i d i a ly i e l do ft h ef i n a l l y f e r m e n t a t i o n p r o d u c t i o n , c o m p a r e dw i t ht h ec o s ta n dq u a l i t y ( t h ec o n i d i a lc o n t e n ta n d t h ec o n i d i a ly i e l d ) o fp r o d u c t i o n 。t h ep r o d u c t i v ef o r m u l aw a sd e t e r m i n e d 。i tw i l l sc o r n s t a l k | r i c eb r a n | c o r n f l o u r = 0 6 0 4 1 5 ，a d d i t i o n a l l y a m m o n i t i ms u l f a t e0 1 ，w a t e r5 0 珊ss o l i d s t a t e s u b s t r a t ew a si n o c u l a t e da n df e r m e n t e d10d a y sa t2 5 ，t h ec o n i d i a lc o n t e n to ft h e p r o d u c t i o nw a s7 2 9 10 9 ( c o n i d i a gw e t ) a n dt h ec o n i d i a ly i e l dw a s7 7 7 10 9 ( c o n i d i a g d r ys u b s t r a t e ) s o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o nt e c h n i c sr e s e a r c hi n c l u d e di n o c u l a t i n ga m o u n t ，f e r m e n t a t i o n p e r i o d s ，a n df e r m e n t a t i o np r o d u c t i o ns t o r ei nr o o mt e m p e r a t u r e a st h ei n o c u l u mc o n i d i a l c o n t e n t 1 0 9 g ，t h ei n o c u l a t i n ga m o u n tw a s1 10 0 ；m eo p t i m a lo ft h ef e r m e n t a t i o np e r i o d s w a s10 12 d a y sa t2 5 c ；t h et e s to ff e r m e n t a t i o np r o d u c t i o ns t o r ei nr o o mt e m p e r a t u r e s h o w e dt h a tt h es p o r el i v a b i l i t yw a sa b o u t9 0p e r c e n tw h e ns t o r e d2 1 1m o n t h s ，n l et e s to fp a e c i l o m y c e sl i l a c i n u s3 6 1t o l e r a n c et o p e s t i c i d e s s h o w e dt h a t c a r b e n d a z i ma n dc h l o r o t h a l o n i li n h i b i t e dg e r m i n a t i o no ft h es p o r eo fp a e c i l o m y c e s l i l a c i n u s3 6 - 1m o r es t r o n g e l yt h a na b a m e c t i na n dp h o x i m k e yw o r d s ：p a e c i l o m y c e sl i l a c i n u s ；s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n ；c o r n s t a l k ；b i o c o n t r o l 2 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 是如需保密，解密时间2 0 0 8 年1 2 月3 0 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：j = 衷幺 1 8 n ：泖年 石月华日 学位论文使用授权书 本人完全了解。华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定一，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权- b 学位论支作者签名：莎霖袋 导师签名：市墨红 签名日期：知一，年石月7 - 日签名日期：0 乡年月f 8 日 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 第一章文献综述 1 植物线虫病害概况及其综合治理 1 1 植物线虫的危害 根据估计，全世界每年因线虫危害给粮食和纤维作物造成的损失大约为10 。我 国农作物种植业因线虫病每年约损失2 3 3 亿元( 国家统计局编，1 9 9 2 ) 。甜菜胞囊线虫 ( h e t e r o d e r as c h a c h t i 0 、马铃薯金线虫( g l o b o d e r ar o s t o c h e i n s i s ) ，温暖地区的根结线虫 ( m e l o i d o g y n es p p ) 等是世界上引起严重植物线虫病害的主要线虫种类之一。在我国， 东北和黄淮地区的大豆胞囊线虫( h e t e r o d e r ag l y c i n e s ) 、甘薯茎线虫( d i t y l e n c h u s d i p s a c o 、粟线虫和水稻干尖线虫( 均为a p h e l e n c h o i d e sb e s s e y i ) 一直造成生产上的严重 损失。近年来松材线虫( b u r s a p h e l e n c h u sx y l o p h i l u s ) 已传人我国并在江苏、安徽等省 蔓延，引起一些松树树种的毁灭性危害( 刘维志等，2 0 0 0 ) 。因此植物的线虫病害直 受到人们的重视。 1 2 植物线虫病害的综合治理 1 2 1常用防治方法 植物线虫病常用的防治方法有：( 1 ) 深耕、轮作、合理的栽培管理等。能有效地 减轻根结线虫的危害。亢菊侠等( 2 0 0 6 ) 认为，深翻土壤2 5 c m 造成缺氧，从而减少 线虫数量；用韭菜等非线虫寄主轮2 年以上，断绝线虫的食源，可以有效减少有害线 虫的数量；同时种植具有抗线虫的植物如万寿菊也可有较减少有害线虫的虫口密度； ( 2 ) 选用抗病品种。不同品种对线虫的抗性是有差异的。因此选用抗性品种是减轻 植物线虫病有效的手段之一。王年等( 2 0 0 0 年) 在烟草对根结线虫的抗病性研究中 发现，供试的烟草品种和品系中，对南方根结线虫l 号小种存在明显广泛的抗病品种 但对爪哇根结线虫和花生根结线虫2 号小种，没有或很少抗病材料。因此了解当地植 物寄生线虫的种群及合理选用品种就可以达到减少线虫的危害；( 3 ) 使用有机或无 机土壤改良剂。土壤改良剂包括油粕、厩肥、几丁质和蛋白质混合物等。土壤改良剂 处理的土壤中，主要是释放氨而起到抑制线虫的作用。氨在土壤p h 为偏碱性时，具 有一定的杀线虫性能；而甲壳类物质( 主要是甲壳素) ，也可有效降低根结线虫的数量 ( 杨新玲，张利兰等，2 0 0 1 ) ；( 4 ) 植物检疫。植物检疫是防治植物线虫病的有效手 段之一，优其是无病区域，可切断其传播来源，限制病害发生的范围；( 5 ) 化学防治； 药剂防治是目前防治线虫的主要手段，但由于大多化学杀线剂多为广谱杀虫剂见( 表 1 - 1 ) ，毒性大，用量多，易造成人畜中毒和污染环境，因此使用范围受到很大的限制。 3 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 整理白农药电子手册，中华人民共和国农业部农药检定所主编，2 0 0 4 年版。 从上表中不难发现，在防治植物线虫病的药剂中，化学农药多，用量大毒性高； 生物农药制剂少，用量低，毒性也较低。 1 2 2生物防治 生物防治是利用某些有益生物及其代谢产物防治线虫的方法。植物寄生线虫生防 因子有食线虫菌物、寄生细菌、根际细菌、杀线虫植物等。食线虫菌物是指对植物寄 生线虫具有拮抗作用菌物的统称，根据作用方式的差异，可分为捕食性菌物、内寄生 菌物、机会菌物、产毒菌物、泡囊丛枝菌根及其他内寄生菌5 大类( 祝明亮等，2 0 0 4 ) 。 在食线虫菌物中研究和应用较多的有淡紫拟青霉( a t k i n s 等，2 0 0 4 ) 、厚垣轮枝菌( d el i j f a 等，1 9 8 9 ) 防治的对象为根结线虫、胞囊线虫；寄生细菌主要是巴氏杆菌，由于 它是专性寄生菌必须用寄主进行扩大培养再用于田间线虫病害的防治( m i n t o nna 等，1 9 8 9 ) ：根际细菌有蜡状芽孢杆菌、荧光假单胞杆菌等，通过产生拮抗物质或营 养和空间位点竞争等减少线虫对寄主作物的为害；杀线虫植物种类比较多，有瓜叶菊 属植物，万寿菊属植物，野白合属植物，金合欢属植物，桉属植物，苋属植物，香茅 属植物，蓝刺头属植物，油麻藤属植物，苜蓿属植物，罗勒属植物，葱属植物，牧豆 树属植物，牛角瓜属植物等，对根结线虫( 杨秀娟等，2 0 0 4 ) 、松材线虫( 翁群芳等， 4 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 2 0 0 5 ) 等有一定的抑制效果。p a n th 等( 2 0 0 4 ) 研究不同生防菌对鹰嘴豆根结线虫的 防治效果及对其根围微生物的影响，结果表明淡紫拟青霉、哈氏木霉、黑曲霉、集球 囊霉( 菌根菌) 对鹰嘴豆根结线虫的防效都很好，最佳使用剂量( 棵) ：淡紫拟青霉( 5 0 0 0 孢子) 、集球囊霉( 5 0 个厚垣孢子) 、哈氏木霉( 5 0 0 0 孢子) 、黑曲霉( 5 0 0 0 孢子) 。集 球囊霉( 菌根菌) 促进作物长高和提高产量最明显，淡紫拟青霉减少根结线虫侵染较果 最好。集球囊霉可有效提高根围细菌的数量，但和哈氏木霉一样可减少根围真菌和寄 生性线虫数量。 尽管目前生物制剂规模化和商品化的产品比较少，已进行登记的产品有厚孢轮 枝菌、淡紫拟青霉等。但随着生物防治研究的不断深入，商品化的意识不断加强，生 物防治在线虫病害防治中将占越来越重要的位置。 2 淡紫拟青霉的研究进展 2 1淡紫拟青霉的生物学特性 。淡紫拟青霉( p a e c i l o m y c e sl i l a c i n u s ) 属于半知菌亚门，丛梗孢目，丛梗孢科，拟 青霉属，是重要植物病原线虫的卵寄生真菌( 王昌家等，1 9 9 7 ) 。它的分布广泛，在国 外，澳大利亚、加拿大、菲律宾、美国等均从土壤或线虫中分离到( 刘维志主编，植 物病原线虫志，2 0 0 0 ) ：在我国，湖北、云南、山东等地也分离到不同的线虫卵寄生 淡紫拟青霉菌株( 王明祖等，1 9 9 0 ；杨树军等，2 0 0 4 ；武侠等，2 0 0 4 ) 。淡紫拟青霉对 营养物质要求不高，可以在多种培养基中生长并产孢。在碳源中以葡萄糖最好，蔗糖、 果糖、阿拉伯糖利用较好；p h 值为卜1 2 均能生长，p h 值为7 最好：温度1 2 c 以下不 能生长，1 7 3 7 均能生长，3 0 c 生长最好，培养适温2 5 3 0 6 c ，有利于生长和产孢。 光照时间长短对营养生长无影响，产孢量，全黑暗 半光照 全光照( 王明祖等，1 9 9 2 ) 。 它在液体培养条件也可产生大量孢子，芽孢子和分子孢子都有一定数量( 肖炎农 等，19 9 9 ) 。 在遗传稳定性方面，n a g e s hm ( 2 0 0 5 ) 等研究表明，经过重复继代培养( 2 8 4 - 1 ) 到第九代后孢子的活力显著下降，到第十代淡紫拟青霉侵染力也显著下降：经过继代 培养，对孢子活力的影响比对孢子侵染力大。i n g l i s ，p e t e rw ( 2 0 0 5 ) 等认为可以用间隔 序列p c r 方法用来控制淡紫拟青霉等生物产品的质量。他们通过对染色体未端指纹 分析得出，淡紫拟青霉有7 条染色体，而玫烟色拟青霉( pf u m o s o r o s e u s ) 有6 - 9 条 染色体。p e t e rw i n g l i s 等( 2 0 0 6 ) 通过对5 8 sr d n a 和转录间隔( i t s la n di t s 2 ) 序列 分析方法，确定不同淡紫拟青霉种间亲缘关系。张延新等( 2 0 0 5 ) 用r a p d 的方法 鉴定菌株是否突变及突变程度。这些分子生物学技术的应用将为淡紫拟青霉生产和保 证产品质量提供坚实的基础。 5 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 2 2 淡紫拟青霉防治线虫的机制 淡紫拟青霉主要防治线虫的机制主要为卵寄生。a l a m g i rk h a n 等( 2 0 0 4 ) 研究表 明，淡紫拟青霉蛋白酶和几丁质酶对爪哇根结线虫卵壳有很强的降解作用。淡紫拟青 霉蛋白酶可以使卵壳脂层完全降解，几丁质层变薄；它的几丁质酶可以降解卵的几丁 质层，卵的几丁质层出现很大的液泡，卵黄层开裂，失去完整性。用淡紫拟青霉的蛋 白酶和几丁质酶处理爪哇根结线虫卵，都能显著减少卵的孵化。除卵寄生外，它的代 谢产物中含有促进作用生长物质及抑制线虫的物质等。 2 3淡紫拟青霉在土壤中的定殖及其对作物生长的影响 在淡紫拟青霉与作物根际关系中，孙漫红等( 1 9 9 8 年) 用m - 1 4 菌株和大豆进行 研究，结果表明：包衣量为2 4 1 0 6 粒的大豆种子，在无菌土上种植1 周后有2 4 1 0 5 的生防菌能在大豆根际定殖，其中内根际( 根表与根内) 可检测到2 4 1 0 3 个 孢子，两周后，内根际菌量提高1 0 倍，4 周后有所下降；大豆胞囊线虫感病土中， 该菌3 周后开始大量增殖；病土引入菌剂，1 周后根标其它微生物有些减少，4 周后 与对照相似。祝明亮等( 2 0 0 4 年) ，研究表明，淡紫拟青霉i p c 菌株可以在烟草外根 际、根表定殖和生长对根际土壤微生物具有一定的抑制作用，但一个月后抑制减弱。 p a k n y a tm 等( 2 0 0 1 ) 研究淡紫拟青霉在加入不同营养基质的酸柠檬根围的定殖情况 表明，在土壤中加小麦秸秆，淡紫拟青霉可大量定殖，在温室的酸柠檬根固定殖时间 超过1 8 0 d ，在果园中定殖时间超过3 0 0 d 。h o l l a n dr i t aj 等( 2 0 0 3 ) 研究发现，淡紫 拟青霉2 5 1 菌株尽管可以在作物根部上定殖，但在作用根内没有菌丝，它并不是植物 的内生菌。s i m o nd a t l d n s 等( 2 0 0 5 ) 用实时p c r 和种特定的引物技术对淡紫拟青 霉进行鉴定并用于检测淡紫拟青霉在土壤中的数量、植物根部的分布情况、线虫卵的 寄生等，为了解淡紫拟青霉在土壤中的动态产品质量检测提供新的手段。 林茂松等( 19 9 9 年) 对淡紫拟青霉代谢产物生理活性物质的研究表明：淡紫拟青霉 代谢产物对多种作物有生理活性。在番茄幼苗上3 0 d 的试验结果表明，以1 0 5 万个孢 子m l 浓度的培养滤液，促进番茄生长作用最明显，地上部鲜重平均比对照高4g ，根 重高o 2 9 。而大豆、小麦、水稻种子对代谢产物( 8 x 1 07 个孢子m l 的发酵滤液) 敏感 程度不同。大豆种子，1 2 0 倍稀释液对促进萌发和生长作用最显著；水稻种子，2 0 倍 稀释液作用明显：小麦种子，1 0 倍稀释液才表现出刺激生长作用。高浓度滤液均对 种子表现出抑制萌发和生长作用。高学彪等( 1 9 9 8 年) 研究也表明，淡紫拟青霉5 咖z 和1 0 咖2 固体菌剂处理( 孢子含量为3 1 07 个儋) 对番茄有明显的促进生长和增重作用， 9 3 d 后番茄株高分别增加1 7 2 和4 9 6 ，地上部鲜重分别增加1 0 0 和1 4 5 9 。王明 祖等( 1 9 9 9 年) 研究表明施用淡紫拟青霉把苦瓜苗的有效生长期延长近6 0 d ，有效提 高苦瓜的产量。 6 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 2 4 淡紫拟青霉的使用 淡紫拟青霉防治谱比较广，除能防治根结线虫、胞囊线虫外对常见的土传病害如 棉花枯萎病( 王明祖等，1 9 9 6 ) 、水稻立枯病( 肖炎农等，1 9 9 6 ) 等有较高的防效。 有关应用技术的研究集中在用量和施用方法等方面。 2 4 1使用剂量 付艳平等( 1 9 9 8 年) ，用淡紫拟青霉3 6 1 菌剂防治豇豆根结线虫结果表明，用 1 0 、5 0 、1 0 0 倍菌剂浸根处理，3 0 d 后防治效果分别为6 6 4 ，6 2 7 ，3 7 4 。高学 彪等( 1 9 9 8 年) 在温室盆栽试验中，用剂量为5 9 m 2 和1 0 9 m 2 固体菌剂( 孢子含量 为3 x 1 0 7 个儋) 处理，9 3 d 后番茄根围土壤中南方根结线虫二龄幼虫的群体密度比对照 分别降低6 2 3 和6 6 9 ；汪来发等( 1 9 9 8 年) 将淡紫拟青霉固体菌剂( 含菌量1 4 2x 1 0 6 个活孢子曲和厚壁轮枝茵固体制剂( 含菌量2 7 7x1 0 6 活孢g ) 按1 ：1 混匀，制成复 合菌制剂，7 穴，小区试验结果为防病效果3 1 1 ，增产1 2 o ；r e g i n am d g o m e s c a r n e i r 等( 1 9 9 1 年) 研究淡紫拟青霉的使用剂量和防治效果中认为：在温室灭菌 土壤中，每g 土中淡紫拟青霉孢子的数量为1 0 6 对番茄根结线虫的寄生效率最高。淡 紫拟青霉孢子含量为1 0 1 1 儋的制剂中，以1 0 10 0 9 m 2 处理可以有效的控制线虫的第 二、第三代，但在第一代，0 0 1 、0 1 、1 o 、1 0 0 、1 0 0 0 9 m 2 处理防效差异不太明显： 而在大田生产防治试验的防病效果达4 5 o ，增产1 5 o 。王昌家等( 1 9 9 7 ) 研究表 明，不同菌株淡紫拟青霉培养菌料施2 2 5 k g h m z ，对大豆胞囊线虫不但当年有4 5 9 6 6 9 的较好防效，而且第2 年和第3 年仍然有2 2 5 - 3 7 7 和7 3 一2 2 9 的后效。k i e w n i c k ， s 等( 2 0 0 3 ) 研究淡紫拟青霉2 5 1 菌株防治根结线虫认为，剂量为2 - 4 x 1 0 9 棵处理防 效最好，2 3 个月以后作物根围淡紫拟青霉数量下降较多，不足以控制整个作物生长 期线虫的为害，要重复使用几次才能确保防效。 2 4 2 使用方法及影响防效因子 淡紫拟青霉可以穴施、拌种等。p a t h a n ，m 。a 等( 2 0 0 5 ) 研究表明，淡紫拟青霉 可以有效的促进番茄生长和减少线虫对番茄的侵染；在线虫侵入番茄前使用淡紫拟青 霉，防治效果最好，当线虫侵染后使用，效果不怎么理想。k i e w n i c k ，s ( 2 0 0 5 ) 等研 究如何有效提高淡紫拟青霉2 5 1 菌株对根结线虫的防治时认为，种子处理可以有效提 高防效。种子处理与提前施用相结合或种子处理与种植后土壤处理相结合都可减少根 结数和提高作物产量。 无机肥料、有机肥料及不同使用时期对淡紫拟青霉防效都有影响。d a w a r s 等 ( 2 0 0 3 ) 研究无机肥料对淡紫拟青霉防治绿豆根部病害的影响时发现，不同施用时期、 不同防治对象及不同的无机肥料对淡紫拟青霉防效影响不同。播种当天，只用淡紫拟 青霉进行土壤处理就可显著减少镰刀菌的为害：播种后1 0 d ，用淡紫拟青霉和磷酸氢 二铵进行土壤处理，可以完全抑制镰刀菌的侵染；播种后4 0 d 用淡紫拟青霉和尿素进 7 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 行土壤处理，可以完全抑制菜豆壳球孢菌丝核菌的侵染；播种后4 0 d 用淡紫拟青霉和 尿素、过磷酸盐、磷酸氢二铵、氮磷钾混合肥进行土壤处理，也可完全抑制丝核菌的 侵染。a s h r a f m s 等( 2 0 0 5 ) 在温室中，用印楝仔、蓖麻仔、向日葵、黑芥子油饼( 1 5 9 k g 土) 及淡紫拟青霉( 1 9 菌丝及孢子k g 土) 防治肾形线虫时发现，各处理都非常有效 的控制线虫虫口数量及线虫对黄秋葵的侵染，其中同时施用蓖麻仔油饼和淡紫拟青霉 对促进作物生长和减少线虫数量效果最好。s h a r m ajl 等( 2 0 0 4 ) 认为，动物的粪便 可以提高淡紫拟青霉对根结线虫的防治效果，以鸡粪效果最好。王东昌等( 2 0 0 1 年) 研究认为铜和镁可能会降低淡紫拟青霉防治线虫的效果，c u 2 + 和m 矿均会在一定 程度上抑制淡紫拟青霉，c u 2 + 1x 1 0 - 3 m o l l 以上抑制作用非常明显，m 9 2 + 0 4 m o l l 以 上的抑制作用明显，而0 0 5m o ul 以下对淡紫拟青霉的抑制作用不明显。因此适时施 用和与无机肥料或有机肥料合理混用是保证淡紫拟青霉防效的关键。 2 5 淡紫拟青霉的发酵技术 2 5 1固体发酵 固体发酵技术是淡紫拟青霉研究的重点之一。陈品三等( 1 9 8 9 ) ，用稻米培养基 在2 5 恒温箱下培养1 4 天可产大量的孢子。1 9 9 8 张虹等( 1 9 9 8 ) ，对淡紫拟青霉固 体菌种6 种扩大培养基研究中表明，在温度为2 5 c 条件下培养l5 天，其产孢量，玉米 麦粒 麦麸 至石 草炭 稻草。而1 9 9 9 年，潘沧桑等研究用食品废弃物来培养淡紫 拟青霉，表明剩饭和西瓜皮、菠萝皮、香蕉皮等多种果皮制成的培养基，淡紫拟青霉 都能在其上生长，其中以西瓜皮最佳；以玉米粉、米糠、干土( 比例为1 ：1 ：1 ) 作为 固体培养基进行扩大培养，产孢量可达1 0 9 g 。b a n dd e b o m 等( 2 0 0 4 ) 以甘蔗渣为 载体，咖啡壳、木薯渣、大豆饼等为营养物质进行固体发酵，经盆栽防治线虫试验表 明，以大豆饼为营养物质最好，其固体发酵产物对南方根结线虫的防效非常高，几乎 达到1 0 0 ；其次是咖啡壳，防效8 0 左右，木薯的效果比较差，防效在6 0 左右。 n a g e s hm 等( 2 0 0 1 ) 研究在不同固体介质在不同温度条件下贮存对淡紫拟青霉孢子 存活能力的影响时认为，温度是影响孢子存活能力的主要因子之一。贮藏1 5 0 d ，对 照处理的温度为一2 0 ，其孢子萌发率 9 8 ；在o 下，各处理孢子萌发率均 8 0 9 6 ： 但在2 7 下，各处理孢子萌发率下降到6 0 。 2 5 2 液体发酵 肖炎农等( 1 9 9 9 ) 用p s b ( - b 铃薯蔗糖培养基) 、玉米粉培养液等进行发酵，几 天后的孢子浓度分别为4 0 5 x 1 0 9 个m l 和2 5 x 1 0 旧个m l ；潘沧桑等( 1 9 9 9 ) 用淘米 水振荡培养样品的孢子均都达到1 0 9 个m l 。夏振远等( 2 0 0 2 ) 对淡紫拟青霉液体培养 基和发酵条件研究表明，蔗糖加黄豆粉加肌醇及适量的微量元素为最佳培养基，发酵 温度为2 9 ，初始p h 值为5 - 6 和适量的通气量易产大量孢子。 8 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 2 5 3 发酵工艺 毛成利等( 2 0 0 4 ) 研究的液固两相法生产工艺流程如下： ( 1 ) 菌种培养 淡紫拟青霉菌种用p d a 或c m a 培养基常规保存和繁殖。培养时间为5 d 。 ( 2 ) 液体发酵 种子罐发酵：培养温度控制2 8 士1 ，罐压0 0 5 0 0 1 m p a ，转速2 0 0 2 5 0 r m i n i ， 通风量1 ：0 5 ，培养2 4 - 4 8 h 左右。发酵罐发酵：培养条件与种子相同，时间6 2 7 2 h ， 残糖过低，不消耗，指标在0 5 m g r 心1 。取样时间：每隔6 h 取样一次；转罐及下 罐条件：根据镜检无杂菌，菌丝大面积连网，生物量1 2 以下。 ( 3 ) 固体发酵 培养温度为2 8 士2 ，湿度为7 0 - 8 0 。但从第4 d 起，湿度为正常室内温 度，温度不变。1 2 d ( 培养基结块) 后翻盘一次，3 - 4 d 可喷洒灭过菌的2 0 葡萄 糖溶液一次。发酵7 d 后，孢子成熟，固体发酵结束。淡紫拟青霉素固体发酵的控制 指标为：温度2 8 圭1 ；湿度7 0 8 0 ( 前3 d ) ，后4 d 自然湿度；培养时间为7 d 。 3 其它产孢真菌固体发酵 苏辉煌等( 1 9 9 5 ) 认为，固体发酵法与液体发酵相比的优点为： ( 1 ) 原料价格低廉。用的固体原料多为农副产品，价廉、无需复杂加工； ( 2 ) 设备简单、耗能少。通过简单的气体扩散或强制通气就可满足微生物生长的氧 气需要； ( 3 ) 符合微生物自然生长环境，有利微生存活； ( 4 ) 产物加工方便。发酵产物经烘干粉碎即为产品； ( 5 ) 环保节能。无需处理大量的废水及废弃物。 真菌常用的固体发酵基质主要是农作物废料如米糠、秸秆、稻草等加上营养物质比 较丰富的农产品如大豆饼、玉米粉等。固体发酵的关键技术主要是温度控制、无菌条 件、通气量及水分或湿度等。但固体发酵生长周期长，如果操作过于繁琐或不规范则 易受杂菌污染。在我国目前最成熟的生防真菌固体发酵是白僵菌( 蔡国贵等，2 0 0 1 ) ， 其工艺流程如下： 困嚼巨固 巫困 o 目一 三困 9 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 4 固体发酵设备的研究 固体发酵设备随着固体发酵技术研究的发展而不断发展，主要表现在：由传统的 敞口式发酵设备逐渐较变为封闭式通风的发酵设备，解决了大规模生产散热难、易污 染、杂菌多的难题；从浅层发酵到机械罐发酵，解决了堆料厚度不利散热和气体流通 的难题：从堆积发酵到流化床发酵，解决了物质流行的难题；从经验发酵到可控发酵； 压力脉动固态发酵反应器的出现和改进并得到广泛的应用，最大的生产规模可到达 7 0 m 3 。目前已在工业上应用的有盘式、转鼓式及搅拌式反应器( 吴其飞等，2 0 0 3 ) 。 5 研究目的和意义 植物线虫病是植物四大病害之一，植物寄生线虫每年造成世界农业生产的损失约 1 0 0 0 亿美元，全球农业上最重要的线虫是根结线虫( m e l o i d o g y n es p p ) 和胞囊线虫 ( h e t e r o d e r aa n dg l o b o d e r a ) ( 杨新玲等，2 0 0 1 ) 。植物寄生线虫的防治通常靠化学杀线虫 剂、栽培技术和培育抗性品种。但是由于潜在的环境问题，涉及人类和动物健康，杀 线虫剂的使用受到很大的限制。生物防治剂由于安全、环保越来越受到人们的重视， 植物寄生线虫生防菌的研究和开发在这几年来有很大的发展，其中淡紫拟青霉 ( p a e c i l o m y c e sl i l a c i n u s ) 在国外已进行登记和推广使用，在国内也已进行中试和小面积 推广应用。其它线虫生防菌如厚壁轮枝菌( v e r t i c i l l i u mc h l a m y d o s p o r i u m ) 、穿刺巴氏秆 菌 p a s t e u r i a p e n e t r a n s ( t h o r n e ) s a y r e & s t a r r 等( 周春娜等，2 0 0 4 ) 也在研究中。 淡紫拟青霉防治线虫效果好，耐药性和耐盐性较强和具有防治土传病害的潜力 ( r u m b o sci 等，2 0 0 3 ；j a c o b sh e l e n 等，2 0 0 3 ) ；使用方法简单，可以拌种、穴 施、沟施等；促进作物生长，提高作物产量。因此，本课题通过淡紫拟青霉固体发 酵技术研究及其产物应用，以便能最大限度地降低淡紫拟青霉制剂的生产成本，获得 合理、简单、规范的生产流程，有利于推动淡紫拟青霉的大规模生产应用。 6 研究内容 6 1淡紫拟青霉固体发酵配方初步筛选 通过玉米、小麦、稻谷及其它廉价材料如米糠、玉米秆、棉子壳等基质组合成不 同配方进行比较，找出淡紫拟青霉固体发酵的基本配方。 6 2淡紫拟青霉菌种配方的优化和确定 以发酵产物易分散、不易污染、产孢含量和产孢产量等为指标，筛出淡紫拟青霉 固体发酵的基本配方，并进行优化，进而确定菌种配方。 6 。3淡紫拟青霉生产配方的优化和确定 淡紫拟青霉3 6 1 固体发酵规模化生产配方是以成本、产孢含量、产孢产量等为 指标，筛出生产基本配方，并对生产基本进行优化，进而确定最佳生产配方。 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 6 4 淡紫拟青霉固体发酵工艺研究 通过不同的接种量，筛选出最适合的接种量；在最适的接种量下，观察不同发酵 时间对发酵产孢及孢子萌发率的影响，确定淡紫拟青霉的发酵周期；室温条件下保存 不同时间孢子的萌发率测定，为发酵产物的加工和应用作准备。 6 5 淡紫拟青霉耐药性测定 通过对淡紫拟青霉3 6 - 1 对常用杀线虫剂和杀菌剂的耐药性测定，了解它对各药 剂的耐药情况，为推广应用及改进提供科学依据。 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 第二章淡紫拟青霉固体发酵配方初步筛选 生物农药虽然有广阔的前景，但防治成本比较高是生物农药推广应用的一个瓶 颈。对于产孢真菌来说，固体发酵产生的孢子易于加工和保存，因而倍受研究工作者 和生产者青睐。淡紫拟青霉固体发酵基质比较丰富，如用麦麸、小麦、稻谷等固体基 质发酵均可产生大量孢子。我国玉米种植面积很大，玉米秸秆来源丰富，首次以玉米 秸秆为基料组分之一进行淡紫拟青霉固体发酵，既可降低生产成本，又可减少因焚烧 秸秆带来的不利影响，为规模化生产提供基础。 1 材料及方法 1 1供试菌株 研究中所用菌株为野生型淡紫拟青霉( p a e c i l o m y c e sl i l a c i n u s ) 3 6 1 菌株和源于 3 6 1 菌株的诱变菌株d 2 l 。这些菌株由华中农业大学线虫研究室提供( 以下实验均同) 。 1 2 培养基制备 玉米粉、小麦粉、稻谷粉均在本试验室自行制备，细度直径1 0 m m 左右。米糠 从市场上购买，细度直径1 0 m m 左右( 下同) 。玉米秆采自华中农业大学试验田，晒 干后粉碎成直径5 0 m m 备用( 下同) 。 琼脂培养基：将玉米粉、小麦粉、稻谷粉制成玉米粉琼脂培养基、小麦粉琼脂培 养基、稻谷粉琼脂培养基( 玉米粉、小麦粉、稻谷粉各2 0 9 ，琼脂8 9 ，水5 0 0 m l ) ， 2 0 m l n n ( 培养皿直径9 c m ，下同) ，每处理5 次重复。 米糠玉米粉固体培养基：米糠和玉米粉比例( 重量比下同) 设1 ：4 ，1 ：2 ，1 ：1 ， 2 ：1 ，4 ：1 五个配比，干料( 玉米粉和米糠不同配比的混合物) 比清水为o 5 ：o 5 ， 1 5 9 干料皿，每处理4 次重复。 玉米秆玉米粉固体培养基：玉米秆和玉米粉设1 ：4 ，1 ：2 ，l ：l ，2 ：1 ，4 ：1 五个配比，干料( 玉米粉和玉米秆不同配比的混合物) 比清水为o 4 ：o 6 ，l o g 干料 皿，每处理4 次重复。 玉米粉固体培养基：玉米粉比清水为o 5 ：o 5 ，1 5 9 干料l m ，每处理4 次重复。 玉米秆固体培养基：玉米秆比清水为0 2 5 ：o 7 5 ，l o g 干料i l l ，每处理4 次重复。 米糠固体培养基：米糠比清水为0 4 ：o 6 ，2 0 9 干料i 1 1 ，每处理4 次重复。 各种物料在1 2 1 下湿热灭菌2 5 m i n 冷却待用。 1 3 菌种的制备及用量 菌丝块：淡紫拟青霉3 6 1 菌株在p d a 培养基平板上于2 5 恒温下培养7 d 后待 用，接种菌块的直径大小为8 0 n m 。 固体发酵菌种：淡紫拟青霉d 2 l 菌株在玉米河砂固体培养基上于2 5 。c 恒温下培养 1 2 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 5 天后待用，菌种的用量与干料的比例( 重量比) 为4 - 1 0 0 。 1 4 培养条件 接种后在2 5 恒温下培养。 1 5 菌落扩展测定 培养6 d 后，用十字交叉法测各菌落的直径。 菌落扩展直径= t t t “t t ：测量时的菌落直径；t o ：接种的菌块直径) 1 6 孢子含量测定 将发酵好基质混匀，每个样品中取m ( 曲，用蒸馏水( 含o 2 9 6 吐温) 洗3 次，收 集孢子悬浮液并定容v ( m l ) 。将其稀释到适宜的浓度后用血球计数板测定孢子悬浮液 的浓度n ( 个m l ) 。 孢子含量( d g 湿重) = v n m ( 注：孢子含量是指发酵结束后，直接测得的孢子含量) 1 7 数据统计分析 采用d u c a n s 新复极差测验进行方差分析。方差分析中不同大写字母表示有极显 著差异( p o 0 1 ) ，不同小写字母表示显著差异( p 0 0 5 ) 。 2 结果与分析 2 1不同琼脂培养基对3 6 - 1 菌株生长的影响 3 6 一l 菌株在玉米粉琼脂培养基、小麦粉琼脂培养基和稻谷粉琼脂培养基培养6 d 后平均菌落直径分别为3 3 1 ，3 4 0 和2 9 1 m m ，分差分析见图2 1 。 玉米粉小麦 稻谷 图2 - 1不同琼脂培养基对3 6 1 菌株生长的影响 ( 注：图中的不同大写字母表示p 麦麸 至石 草炭 稻草。因此淡紫拟青霉固体发酵基质应以玉米 粉为主要营养物质，以来源广、成本低的作物秸秆及农产品加工废料如米糠为辅料进 行组合，找出想理的固体基质配方。从本次试验得的结果来看，玉米粉和米糠配比为 1 ：1 及玉米粉和玉米秆配比为l ：1 是比较理想的淡紫拟青霉固体发酵基本配方。 1 6 一 。_j。_i。，。ll o 0 o o o o 0 o o o o o 0 o 2 0 8 6 4 2 o 德嚣瑚，翟v嘲邻营器静 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 第三章淡紫拟青霉菌种配方的优化和确定 作为菌种固体发酵培养基，除能在较短的时间内产生大量的孢子外