（基础兽医学专业论文）催乳素释放肽（prrp）在小鼠不同组织中表达规律初探.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 文题目 催乳素释放肽( p r r p ) 在小鼠不同组织的 表达规律初探 学位 级别 导师 姓名 硕士 学生 姓名 学位论文 是否保密 。都军霞i 霉翌l 基础兽医 王艳玲 否 i如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人星交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中特别加以标 注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得河 南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 特此声明。 研究生签名：磊p 啄鬼 日期：砌暑年占月 明 导师签名力荔形 日期：刀岖年否月日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存提交论文的印刷本 和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发 表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离开 河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为 河南农业大学，试验材料、原始数据、 所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解 研究生签名：瘤9 霉铅 同期勿裾年6 月 同 申报的专利等知识产权均归河南农业大学 学院领 同 致谢 夏日炎炎，三年的研究生生活在这个季节即将划上一个句号。回首三年，有 快乐也有艰辛，有收获也有失落。 值此学位论文完成之际： 感谢我的导师王艳玲教授，三年来一直以严谨的治学态度，在学业上给予我 教导、培养和无私的帮助。不仅她那严谨的治学态度、缜密的思维能力深刻地影 响着我，更是她那博大的胸怀和坚强的意志影响着我如何去笑对人生，我将随身 携带着它们，勇敢的踏上新的人生之路。在此，谨向恩师献上我最崇高的敬意! 感谢王星所教授、杨国宇教授的悉心指导和帮助。 感谢导师组成员刘兴友教授、李宏基副教授、肖传斌老师、梁宏德老师、刘 忠虎老师审阅了全稿，并提出了宝贵意见。 感谢王林枫老师、王月影老师、钟凯老师、韩立强老师、郭豫杰老师、鲁维 飞老师、查光明老师以及朱河水老师给予了许多的指导和帮助，在此也表示我深 深的谢意! 感谢同届的乔新安、范沛、林茂旺、王伟杰、冯君、李岩、李卫华、何静卫、 杨亮、李梅芝、王林、刘大波在试验过程中给予我的热情帮助和支持，在此一并 表示衷心的感谢，也把我最美好的祝福送给你们! 感谢0 6 级的贾海丽、李海霞、武宇晓、李平、王静、臧猛、刘涛、台玉磊和 张志强等师弟师妹给予我的支持，谢谢你们! 感谢0 7 级的师弟师妹，给予我的关心! 同窗之情令我难忘。我们共同走过人生中这三年不平凡的道路，给我留下了 值得珍藏的美好记忆。 父母的爱，我始终无法回报。在我近二十年的读书生涯中，他们用自己微薄 的力量保护着我，用自己辛勤地劳动支持着我。他们的爱是无私的，我深深爱着 他们。我将用我今后一生的爱来回报他们的这一份浓厚的亲情! 最后，我还要感谢我的朋友王国栋，感谢他陪我度过了这三年清苦的求学历 程，是他在学习和生活上给予我更多的帮助和照顾。 谨以此文献给所有关心我、爱我的老师、同学和家人! 都军霞 催乳素释放肽( p r r p ) 在小鼠不同组织的表达规律初探 摘要 为了研究p r r p 在小鼠不同组织中的表达规律，本试验以3 6 只昆明小白鼠为研究对象； 分为妊娠早、中、晚期和泌乳早、中、晚期组， 六个时期小鼠的下丘脑、垂体、延髓、甲状腺、 要结果如下： 每组六只。采用半定量r t - p c r 法检测了这 肾上腺和卵巢p r r pm r n a 的表达水平。主 1 、妊娠早期和泌乳早期各组织p r r p m r n a 的表达水平以延髓最高，且显著高于下丘 脑、垂体、甲状腺和肾上腺( p o 0 5 ) ，显著高于垂体、甲状腺和肾上腺( p 0 0 5 ) ， 显著高于其它组织表达水平( p o 0 5 ) 。泌乳晚期p r r pm r n a 在延髓表达量最高，显著高于其 它组织( p 0 0 5 ) 。4 、不同时期小鼠下丘脑、垂体、延髓和甲状腺p r r pm r n a 表达水平变化 不显著。5 、肾上腺p r r pm r n a 水平在妊娠期呈现先降后升趋势；泌乳期处于上升趋势，至 泌乳晚期达到最高水平，且显著高于妊娠期口 o 0 5 ) 。6 、卵巢p r r pm r n a 在妊娠期和泌乳 期呈现先升后降趋势，泌乳晚期达到整个妊娠期和泌乳期的最低水平，但相对于妊娠期差异显 著妒 o 。0 5 ) 。 这些结果提示：小鼠下丘脑、垂体、延髓和甲状腺p r r pm r n a 可能不受周期的影响， 表达比较稳定；肾上腺p r 】r p 可能参与神经内分泌和应激调节过程；卵巢p r r p 可能参与促进 黄体细胞的生成，从而对生殖内分泌起到一定的调节作用。 关键词：p r r p ；组织表达：半定量r t p c r ；小鼠 都军霞催乳素释放肽( p r 肿) 在小鼠不同组织的表达规律初探 1 文献综述 催乳素释放肽( p r r p ) 的研究进展 1 1 催乳素释放肽( p r r p ) 的发现 催乳素释放肽( p r o l a c t i nr e l e a s i n gp e p t i d e ，p r r p ) 是新近发现的一种神经肽，最早是- z 1 9 9 8 年由日本学者h i n u m a 等从牛下丘脑提取物中分离出来。h i n u m a 等首先利用p c r 技术从人垂 体中分离出一种g 蛋白偶联的7 次跨膜受体如g r 3 ，因为没有发现其内源性配体，而命名为“孤 儿受体”。而后将h g r 3 受体转染中国仓鼠卵巢细胞后，从牛下丘脑提取物中发现了内源性配 体。这种内源性配体与任何已知的多肽序列均无相似之处，且能特异性促进催乳素( e r l ) 释放， 而对其他垂体激素的释放和分泌没有影响，故命名为催乳素释放肽p r r p ) p 1 。 1 2 结构 p r r p 的前体是前催乳素释放肽原( p r e p r o - p r r p ) ，后者在不同种属中氨基酸长度不同，在 牛、人、大鼠中分别为9 8 、8 7 、8 3 个。前催乳素释放肽原( p l i 印r 0 p r r p ) 有一个氨基末端信号肽 和两个内部剪切位点，经翻译后加工形成两种催乳素释放肽。这两种催乳素释放肽分别含有 3 1 和2 0 个氨基酸，故称为p r r p 3 1 和p r r p 2 0 。其中人p r r p 3 1 和p r r p 2 0 的氨基酸序列分别为 s r a h q h s m 匣i l u p d i n p a 、v y a g r g i r p v g r f - n h 2 和t p d i n p a w y a g r g i r p v g r f - n h 2 u 1 。 后来，a n n a 等眨按照从能够模仿细胞膜结构的水卜二烷基硫酸钠混合物中得到的n m r 波 谱数据构建了p r r p 2 0 的三维模型。其主要结构特征是有一个跨羧基末端含l o + 氨基酸的螺旋 二级结构。a n d e r s o n 等幻1 利用r t - p c r 技术在大鼠下丘脑中克隆了一个由3 4 个氨基酸组成的 p r r p 变异体，这是由于p r 】r p 基因外显子2 内发生了选择性拼接，结果插入了6 4 个碱基，导致密 码子阅读框架的迁移，最终引起终止密码子的提前出现。b o y l e 等研究发现羧基末端氨基酸 序列i r p v g i 谭是该蛋白质发挥生理作用的核心所在。 1 3p r r p 的分布与表达 p 舢是一种神经肽，主要分布在脑部结构中。m a r u y a m a b 首先对p 础的定位作了研究， 细胞免疫化学方法显示，p r 】盱主要分布在下丘脑室旁核、孤束核、视束上核、丘脑带旁核、 底外侧杏仁核和终纹床核。同时神经垂体也有少量分布，然而在正中隆起的外部区域，即释 放经典下丘脑激素的部位，并没有p r r p 分布。同年，y a m a k a w a 6 1 也得到相似的结论。 后来的研究发现，p r r p 在延髓中有大量表达，且表达量高于下丘脑。m o r a l e s 等 1 采用 组织化学法检测了p r r p 在大鼠脑中的分布，结果显示p r r p 主要分布于孤束核尾部和延髓腹 外侧尾部，仅小部分分布在下丘脑非神经内分泌区。c u r l e w i s 等噶1 扩增了羊的p r r p 全长基 因，其序列与牛的同源性达到9 5 6 ，通过n o r t h e r nb l o t 和r t p c r 对p r r p 进行半定量分析， 结果和大鼠的一样，p r r p 在脑干里表达量多于下丘脑，但是，在羊的下丘脑中，p r r p 表达部 位分布比火鼠的广泛，在内侧基底+ 卜丘脑的头部和尾部都有表达。k a t a o k a 等采川原位杂 交法检测了p r r p 在人鼠脑中的表达。结果表明p r r p 在孤束核表达餐最高，占脑中总p r r p m r n a 的7 0 。 2 都军霞 催乳素释放肽( p r g r ) 在, b g 不同组织的表达规律初探 另外，p r r p 的表达还有性别和发育时期差异。k a t a o k a 等9 1 采用原位杂交法检测了p r r p m r n a 在正常性周期雌鼠和雄鼠中的表达，发现雌鼠在动情前期的表达量最多。a n d e r s o n a 等3 采用实时定量r t - p c r 定量分析了p r r pm r n a 在大鼠发情周期不同阶段和泌乳时期的脑部的 表达，获得与k a t a o k a 相似的结果，p r r p i i l 】心l a 在延髓孤束核和腹外侧网状核的表达量显著高 于下丘脑的任何区域。在下丘脑区域，表达量最高的部位局限于腹内侧下丘脑的背内侧，其 它部位表达量甚低，包括背内侧下丘脑的喙部和尾部。除此，在漏斗核、室间情期旁核、内 侧视交叉前核和腹内侧下丘脑的腹外侧部位有少量表达。但是雌鼠在动性前期。动情期和间 情期，p r 】r pm r n a 的表达量变化无统计学意义。而且，泌乳期和非泌乳期的p r r p m r n a 的表 达量也没有什么变化，引起这种差异的原因还不清楚。f u j i w a r a 等u ? 1 研究t p r r p 神经元奄分 娩后大鼠最后区的分布。免疫组织化学和原位杂交法显示，在a p 区暂时性分布有产生p r r p 的 细胞，而在正常的成年大鼠a p 区却不存在产生p r r p 的细胞。a p 区产生p r r p 细胞在p 1 4 和p 1 7 ( 胚胎癌细胞系) 能检测到，但在p 1 9 检测不到。提示p r r p 可能在分娩后大鼠a p ( 最后区) 起着重要的作用。 p r r p 除在中枢神经系统表达，还在外周组织中表达。如鼠肠粘膜的固有层、鼠肾上腺， 人胰腺中有表达1 1 也1 。另外y a s u i 等m 1 发现p r r p 在人胎盘和蜕膜中有表达，妊娠中期表达 量有所增加，但蜕膜上无p r 】r p 受体m r n a 表达。f e m a n d o 等u 4 1 采用免疫组织化学发现入 蜕膜的上皮细胞和间质细胞也有p r r p 的表达，与y u m i k o 不同的是，蜕膜上有p r r p 受体m r n a 表达。 1 4p r r p 的功能 催乳素释放肽是一种神经肽，它通过与其g 蛋白偶联受体的相互作用发挥生理功能，最 先因其能特异性促进催乳素( p r l ) 释放，而对其他垂体激素的释放和分泌没有影响，故命名为 催乳素释放肽( p r r p ) n 1 。但随着对催乳素释放肽研究的深入，对其这一特异性功能产生了许 多争议。后来的研究表明，p r r p 的在脑中分布广泛，与其他神经元存在着类似突触的联系。 因此p r r p 的作用也不仅限于促进垂体催乳素的释放，对体内其它激素的释放也有一定的作 用，同时影响着动物的摄食、能量平衡、应激、睡眠等相关生理活动。正因为p r r p 在体内的 确切生理作用还不太明确，所以成为目前国内外信号肽研究方面的热点之一。 1 4 ，1 对催乳素的调节作用 p r l 家族在生殖过程中起着重要的作用，是一种用于维持泌乳的肽类激素，p r l 的分泌 及其调节受很多因素影响。催乳素( p r l ) 主要来源予垂体( p p r l ) 和子宫蜕膜( d p r i ) 腺。腺垂 体分泌的p p r l 受p r i 抑制因子( p i d 和p r l 释放因子的影响，p i f 主要有多巴胺、丫一氨基丁酸 r g a 3 a ) 等，p r l 释放因子包括促甲状腺激素释放激素f f r r o 、血管活性肠肽( v i p ) 、血管紧张 素i i 等。多巴胺是主要的生理性p r l 抑制剂，凡影响多巴胺分泌的原因均可使p r l 升高，除 了圣体分泌p r l 外，人子宫组织，包括子富内膜、蜕膜、子宫肌层、肿瘤细胞等均能分泌与 之相同生物活性和免疫特性的垂体外催乳素。子宫内膜和蜕膜分泌p r l 不依赖丁聂体而受人 3 都军霞 催乳素释放肽( p r r p ) 在, i 、鼠不同组织的表达规律初探 胎盘组织条件培养液中含量丰富的孕激素、白介素、干扰素a 、表皮生长因子、内皮素等多种 因子的调节。虽然p r l 分泌受这么多的因子调控，但它们均为非特异性释放因子，直到后来 发现了催乳素释放肽。最初因其能特异性促进p r i 释放而命名为p r r p 。大鼠合成p r r p 的细 胞位于下丘脑背中线核尾侧及脑干的孤立核尾侧、腹外侧中间网状区域。p r r p - r 是一种孤立 地结合g 蛋白的受体( 人类为h g r 3 g p r l 0 。大鼠为u h r 一1 ) ，主要分布于中枢神经系统， 以垂体前叶最多。p r r p 与其受体结合后可诱发g h 3 大鼠垂体瘤细胞三磷脂酰肌醇激酶一蛋白 激酶b ( p 1 3 k - - p k b ) a k t 的级联激活，通过 c a m p 应答元件结合蛋白( c r e b ) 依赖机制诱发 p r l 启动子活性，诱导p r l 释放u 。 自p r r p 发现以来，其促激素释放作用就一直存在争议。h i n u m a 最初的研究显示它明显地 促进垂体前叶催乳索的释放而对其他激素分泌无影响，功效与t r h 相当，且较其它一些物质 的催乳素释放活性强，如p 、催产素、p 物质等。m a t s u m o t o 等1 酊通过静脉注射给药发现不 同生殖周期的雌性大鼠血浆中催乳素浓度明显增加，增大药物剂量后雄鼠血催乳素浓度也增 加，故认为p r r p 能特异促进垂体前叶催乳素的释放，且这种作用与体内雌激素水平有关。后 来有些研究也证实了这一点。 研究发现对卵巢切除的大鼠经雌激素处理后，静脉内注射p r 】盱( 1a n d1 0 z g r a t ，i v ) 能刺 激p r l 分泌，其作用与t r h 一样。经多巴胺d 2 受体拮抗剂硫苯酰胺( 1 9 9 r a ti v ) 预处理后， p r 】r p 和t r h 对p r l 仍然具有潜在的促进作用t 1 7 1 。但是中枢给药法注射p r r p ( 0 1 1 ，0 0 0n g r a t ， i c v ) 1 5m i n 能刺激结节漏斗部的多巴胺能神经作用，但并不刺激黑质纹状体的多巴胺能神经 作用，然而血清p r l 水平没有明显的改变；中枢给药法注射t r h ( 1 0n g r a t ，i c v ) 3 0r a i n 后能 刺激结节漏斗部多巴胺神经作用，但抑制血清p r l 分泌。提示，p r 】r p 可能在中枢和外周调 控p r l 的分泌方面起着重要作用。另外，p r r p 促进p r l 的效果还受受性别和发情周期的影 响，表明p r r p 敏感性受机体内内源性激素水平的影响，特别雌激素水平的影响。雌性大鼠， 尤其是发情前期的雌性大鼠比雄性大鼠对p r r p 更敏感。静脉注射p r r p 3 1 能提高大鼠血浆中 p r l 的水平，呈剂量依赖性关系。静脉注射p r r p 3 1 ( 5 0n m o l k g ) 后2 5 分钟内发情前期、发情 期、发情后期雌性大鼠血浆中p r l 的水平都显著提高( p 0 0 5 ) 。但对于雄性大鼠，只有p r r p 3 1 的注射浓度达到5 0 0n m o l k g 时，才能促进血浆中p r l 的显著提高。而p r r p 3 1 并不影响其他 垂体激素的分泌，表现出了专一促进p r l 分泌的特性t 1 6 。 在p r r p 对离体培养的垂体细胞p r l 分泌的影响方面，p r r p 和n m 一样能促进离体培养的 雌性大鼠垂体细胞p r l 的分泌，并且p r r p 的作用比较专一。同时，难体细胞培养条件对p r r p 对垂体细胞的作用影响很大。k a w a m a t a 【i 阳经试验发现，较长时间的培养期限( 4 d ) 可以使 p r r p 对腺垂体细胞产生更有效的作用。在此培养条件下，p r r p 对催乳素分泌的促进作用可与 t r h 相比较，且p r r p 对促进催乳素分泌的作用具有很强的专一性。对丁雌性人鼠来说，腺罨 体细胞对p r r p 的敏感性会随着细胞再生过程而改变：与妊娠时期和其它时期的人鼠的垂体细 胞相比，泌乳时期的人鼠的罨体细胞对p r r p 的敏感性最强。由 - p r r p 受体m r n a 住圣体前叫。 4 都军霞催乳素释放肽口r r p ) 在小鼠不同组织的表达规律初探 的表达量随着生殖过程的变化而变化，因此推断，腺垂体细胞对p r r p 的敏感性可以反映不同 时期垂体前叶细胞的变化，包括p r r p 受体的表达变化。另外，对于在体实验，雄性大鼠经过 雌激素处理能够增强培养的腺垂体细胞的敏感性。这些结果提示，大鼠腺垂体细胞对p r 】r p 的 敏感性可能是通过生理学机制调控的。s w i n n e n 等1 9 发现p r 】r p 对雄性大鼠垂体细胞培养物 p r l 的分泌表现出复杂的效应。1 0 - 1 0 0 r i m 剂量的p r r p 可以促进成年雄性大鼠垂体细胞培养物 p r l 的分泌，并呈剂量依赖性关系，但其效果小于n m 的促进效果。而0 1 和1 r i m 剂量的p r 】r j p 则抑$ 1 j p r l 的分泌。p r r p 促进或抑制垂体细胞分泌的效果受其他激素及培养时间的影响。地， 塞米松能降低促进效应中的峰值，雌激素和t 3 既强烈地降低其抑制效应，也能抑制其促进效 应。同时即使l n m 的p r r p 也能抵消多巴胺抑制p r 埠放的效应。 c a r l o s 等啪研究了p r 】r p 和t r h 对离体培养的大鼠垂体细胞催乳素释放的影响。结果显 示，尽管p r r p 的作用比t r h 低很多倍，p r r p 本身也能促进催乳素的释放，p r r p 以一种不典型 的累积方式维持催乳素的增加。另一方面，在体内和体外，p r r p 明显地增加t r h 对催乳素分 泌的促进作用。 除此，p r r p 也可能参与人催乳素的分泌调节。p r r p 在人蜕膜中也表达，且促进p r l 的 分泌。f e m a n d o 等1 4 1 采用免疫组织化学探测了人蜕膜p 沁及其受体的表达结果显示，p r r p 分布于蜕膜腺的上皮细胞和间质细胞。在原代培养的蜕膜间质细胞中，通过r t - p c r 都能检 测到p r r p 和p r r p 受体基因。合成的p r r p 与人蜕膜间质细胞在体外培养一段时间之后，p r r p 能促进蜕膜细胞p r l 分泌，且p r l 的生成量有明显的增加。因此，p r r p 和p r r p 受体在人 蜕膜细胞的表达以及p r r p 诱导p r l 的分泌作用提示p r r p 可能是种新奇的蜕膜p r l 分泌 的局部调节剂。r u b i n e k 等2 报道人p r r p 3 1 能促进人胎儿( 妊娠2 0 2 7 周) 初级垂体培养 物p r l 的分泌，并呈剂量依赖关系。当与1 0 n m 的p r r p 孵育时，p r l 的分泌增加到最大值 3 5 。雌激素孵育能增强其促进p r l 释放的效果。另外p r r p 虽然不能促进p r l 腺瘤细胞分 泌p r l ，但能促进g h 细胞腺瘤分泌p r l 。 然而，p r r p 对催乳素的作用并不是在所有的研究中都表现出促进作用，也有些研究报道 p r r p 并不特异性促进催乳素的分泌。 s a m s o n 等忱认为对于雄性大鼠、非哺乳雌性大鼠来说，p r r p 可能不是一个调节p r l 的 神经内分泌因子。p r r p 2 0 或者p r r p 一3 1 及其类似物p r r p 1 不能显著影响雄性大鼠垂体培养细 胞内p r l 的分泌。对于雌性大鼠垂体培养细胞来说，只有0 1 和1 0 m m i l ：1 i 量的p r r p - 2 0 和p 脚- 3 1 能显著促进p r l 的分泌。而t r h 能显著促进垂体培养细胞p r l 的释放，并和剂量有关。t r h 的 最小有效剂量在1 1 0 r i m 之间。培养细胞与l m m 齐u 置的t r h 孵育1 5 m i n 后，p r l 分泌开始提高； 而与p r r p 2 0 和p r r p 3 1 孵育1 或2 h 后，p r l 分泌才开始提高。l m mp r r p 所诱导的p r l 峰值显 著小于l m mt r h 诱导的峰值。 后米，h u b e r t u s 等1 以雄性和泌乳期人鼠为动物模型，研究了p r r p 对催乳素释放的作 川。结果显示，促甲状腺激素释放激素能有效地刺激催乳素和i 促甲状腺激素的释放，而p r r p 5 都军霞 催乳素释放肽( p r r p ) 在小鼠不同组织的表达规律初探 在两种动物模型中既不刺激催乳素的释放，也不影响其他垂体激素的释放。静脉注射1 0 或者 5 0 n m o l 的p r r p ，脑室内注射1 0 或者5 0 n m l o 的p r r p 都不能显著改变绵羊血浆中催乳素的浓度和 i m 的分泌。而静脉注射t r h1 0 i 】胁o l 则显著提高绵羊血浆中催乳素的浓度口 0 0 1 ) ，达到7 倍多 n l 。在p r r p 对牛垂体前叶培养细胞中p r l 的释放影响方面的研究表明静脉注射p r r - p3 5 9 m u g k g b w ，不能促进牛p r l 的分泌，血浆中p r l 的变化不大，而注射t r h 、牛垂体后叶提取 物或者多巴胺受体阻断剂( 蛐i p i d d 0 后血浆中p 眦即升高刎。离体培养实验中，、m l l i sk 2 5 1 等探测了p r r p 3 1 及其同系物圈t p 1 对培养的腺垂体细胞分泌催乳素p r l 的作用。结果显示这 两种肽并不明显促进培养的垂体细胞分泌p r l 和a a h 。另一方面：对经抗c l m 血清处理过的 有意识的雄性大鼠脑室内注射3 0n m o r h 1 能明显促进p r l 的释放，但p r r p - 3 1 并没有表现 出此作用。 在非哺乳动物催乳素调控方面的研究中，对鱼的研究比较多，研究结果显示，p r r p 对于 鱼类来说，可能是一个催乳素的促进剂。s a k a m o t ot 等嗡1 通过在大马哈鱼背主动脉内注射 p r 】r p ( 4 0n m o lk g - 1 ) ，发现在注射p 沁后2m i na n d3 0m i n 后，血浆催乳素水平快速增长，8 小时后垂体中催乳素m r n a 水平增加。相反，s o m a t o l a c t i n ( - - 种新垂体蛋白，属于生长激素，催 乳素家族) 的血浆浓度减少，生长激素和s o m a t o l a c t i nm r n a 量没有明显变化。因此，对于鳟 鱼来说。p r r p 可能是一个潜在的催乳素促泌素，同时也是一个催乳素转录诱导剂。f u j i m o t om 等2 7 1 通过对淡水中的金鱼给药p r r p 或抗p r r p 血清，分析了p r r p 对催乳素的调控。结果， 给药p r r p 组，垂体催乳素m r n a 表达量增加：而抗p r r p 血清组，垂体催乳素m r n a 的表 达量减少。可知，p r r p 促进催乳素的分泌。k e l l ys p 等嘲1 腹膜内注射p r r p 也得到相似的结 果，都能明显增加垂体p r lm r n a 量，提示p r i 心参与调控泌乳细胞的分泌活动。 p 然而，对蛙类的研究结果却和鱼类的不一致。已鉴定的哺乳动物p 肿氨基酸序列有9 0 的相似性，而硬骨鱼类的保守性则更高，达到1 0 0 。但在两类动物中p r r p 氨基酸的序列有很 大的差异，同时功能上也有不同。s a k a m o t ot 等哟! 克隆了非洲爪蛙p r r p 的序列，并探测了p r r p 对蛙类的作用。结果显示，蛙类x c n o p u sl a e v i s 的p 时c d n a 的编码区序列和硬骨鱼有很多的 相似性。p r r p 2 0 的氨基酸序列与硬骨鱼p r r p 2 0 相比只有一个碱基之差，而和哺乳类p r 仞有 7 0 相同。x e n o p u sp r r p s 作用于培养的林蛙垂体细胞，使其催乳素浓度提高至u 1 3 0 1 6 0 。但 t r h 可使其催乳素的浓度提高到3 4 倍。在发育过程中，x e n o p u s 脑中的p r 】r j p m r n a t j ( 平在变 态前早期达到最高，与催乳素水平不一致。因此p r q p 对于成年蛙来说可能不象哺乳类动物那样 起着催乳素释放因子的作用。 1 4 2 对下丘脑一垂体一肾上腺轴的调节 脑室内注射p r r p 引起下丘脑室旁核c 1 0 s 的表达，c - f o s 蛋白急剧增加且聚积在室旁核 c r h 阳性小细胞性的神经分泌细胞核，推断这是p r r p 作用位点。同时，血浆a c t h 水平有 所增加，提示，p r r p 影响下丘脑垂体肾上腺轴跚1 。l e i g h t o njs e a l 等b 采用脑室内注射 法和直接在室旁核内注射p r r p 来探测p r r p 作用位点。脑室内注射p r r pl o m i n 后血浆a c t h 6 都军霞催乳素释放肽( p f 呲小鼠不同组织的表达规律初探 开始增加：室旁核内注射p r r p5 r a i n 后a c t h 开始增加。这种作用持续到注射p r r p 后4 0 r a i n 。 但是在体外，p r r p 并不影响分散的腺垂体细胞释放a c t h 。 w i l l i sk 等探测了p r r p - 3 1 及其同系物r f r p 一1 对培养的腺垂体细胞分泌a c t h 的作用， 结果显示这两种肽并不明显促进培养的垂体细胞分泌a c r h 。这一结果与l e i g h t o njs e a l 的结 果一致。但中枢给药法注射1 0 和3 0n m o lp r r p 3 1 及更高剂量的r f r p 一1 都能明显提高有意 识的雄性大鼠的血清皮质固醇的水平。然而，经抗c r h 血清处理过的动物脑室内注射p r r p - 3 1 后，明显降低了p r r p - 3 1 对下丘脑垂体肾上腺轴的作用1 2 5 1 。 1 4 3 对下丘脑一垂体一性腺轴的调节 在体外，p r r p 并不能刺激分散的雄性垂体细胞分泌l h ，f s h ，t s h ，g h 和p r l 。但是，脑 室内5n m o l 注射p r 】r p1 0m i l l 后，血浆l h 开始增加眈。p r 】陴免疫阳性纤维位于终纹床核 一促性腺激素释放激素( 一r h ) 神经元集中的区域，提示p r r p 可能与生殖功能有关。h a j i m e w a t a n o b e 等3 3 采用推挽灌流试验发现，卵巢切除大鼠用雌二醇和孕酮预处理后，内侧视前 区g n r h 的释放增加早于黄体生成素( i a - d 高峰的出现，p r r p 的释放增加早于g n r h 。这些 结果提示p r r p 可能通过激活内侧视前区g n r h 神经元作用于由甾类物质诱导的黄体生成素峰 的形成。 还有研究发现卵巢切除大鼠用雌二醇和孕酮预处理后，侧脑室注入抗大鼠p r r p 3 1 肽血清 导致血浆l h 和p r 乙水平显著下降，在给予p r r p 3 1 肽后，l h 和p r i 冰平升高吼1 。这些结果表 明p r r p 可能通过激活内侧视前区的g n r h 神经元来调节性激素诱导的l h 高峰。另外，p r r p ( 1 0 0 n m o l u 还能促进体外培养的下丘脑组织块释放g n r h ，同时，一些参与调控垂体激素释放的 下丘脑神经肽如血管活性肠肽c v a p ) 、促生长激素神经肽( g a l a n i n ) 的水平也升高。v i p 、g a l a n i n 能刺激l h 的释放，因此，p r r p 通过直接途径( o n g h ) 和问接途径w i p 、g a l a n i n ) 来促进l h 的释 放。 同样，p r r p 的分泌也受性激素水平的影响。k a t a o k a 等侈1 发现雌性大鼠p r r pm r n a 的表 达随性周期的变化而变化，在动情前期达到最高水平。孤束核中p r r pm r n a 的含量在妊娠期 升高并在妊娠中期( 第1 4 天) 达到高峰。同时，血浆孕酮也在增加。给去卵巢大鼠皮下注射雌二 醇或孕酮能提高大脑孤束核中p r r pm r n a 的水平。免疫细胞化学双标结果显示，在孤柬核 p r r p 神经元中，p r r p 与雌激素受体a 共存，这提示p r r p 基因表达可能受体内性激素水平的调控。 另外，p r r p 促p r 埠放的作用也受雌激素水平的调节。 1 4 4 对生长激素的作用 研究发现下丘脑的室旁核p r r p 免疫阳性神经纤维和末梢位于释放抑制素的神经元附近。 脑室灌流p r r p 可迅速使抑制素能神经元中n g f i a 基因的转录。双层标记原位杂交技术显 示s o m a t o s t a t i n ( s o m ) 能神经元能表达p r r p 受体m r n a ，提示室旁核中部分s o m 能神经 元受p r r p 的盲接控制。脑室灌流p r r p 可引起血浆中g h 水平的卜降，但当s o m 被耗竭或 者中和后，其降低作用消久。其机理可能是p r r p 旁分泌的形式作用ts o m 能神经元，使其 7 都军霞 催乳紊释放肽( p r r e ) 在4 , 鼠不同组织的表达规律初探 释放s o m 到垂体门脉中，从而抑制垂体前叶g h 的释放瞄1 。 在离体试验方面，r u b i n e k 等2 1 1 报道了p 删人离体垂体细胞的直接影响，发现p r r p 能刺激几种生长激素细胞分泌g h ，可能参与人生长激素的分泌调节。在雌激素存在的情况下， 人p r r p 一3 1 能促进入胎儿( 妊娠2 0 一2 7 周) 初级垂体培养物o h 的分泌。p r r p 能提高几种分泌 。g l l 的腺瘤细胞g h 的释放，增加2 5 - 2 7 ，同时促进g h 、p r l 混合肿瘤细胞g l l 的分泌。本实验我 们验证了p d r p 在p c - 1 2 的免疫反应及外源的p r r p 刺激a c 芽舌性的能力。s a m s o nw k 等3 们发现， 外源性的p r r p 能刺激p c 1 2 细胞的生长，再者内源的p r r p 对p c 1 2 细胞的生长可能也有一定的 作用。 1 4 5 对摄食及体温方面的作用 除了对激素分泌有影响外，p r r p 还有其他生物活性，p r r p 能减少鼠类摄食、降低体重、 影响体温，在能量平衡方面发挥作用。l a w r e n c e 等b 发现在泌乳期和禁食条件下p r r p 的表 达量降低，推测p 时能影响摄食和体重。e l l a c o t t 等d 跗的研究也得到相似的结论，能减少大 鼠食物摄人和减轻体重。p r r p 是一种新的减食欲剂，同其他减食欲剂一样，雌性大鼠在泌乳 和禁食等能量负平衡的条件下，p r r pm r n a 的表达l 量降低。研究表明，侧脑室内注入4n m o l 的p r 】r p 和1m g 瘦素，能减少夜间食物摄人和体重，并能增加体温。原位杂交表明，禁食的雄 性大鼠的p r r pm r n a 表达量下降。免疫组化显示9 0 的p r r p 神经元与瘦素受体共表达。这 提示p r r p 可能受瘦素调控并参与摄食和能量平衡的调节。而且，p r r p 对摄食的影响表现出剂 量依赖性。禁食和自由喂养的大鼠在每天一次8n m o l 脑室内注射p r r p 3 1 的情况下，并没有影 响大鼠的摄食。但是，连续每天两次脑室内注射p r r p 3 18n m o l 能够明显减少摄食和体重3 。 然而，p r r p 并不是在任何情况下都能影响摄食。b e c kb 等啪1 研究了p r r p 对肥胖症大鼠， z u c k e r 大鼠的摄食行为作用的研究。肥胖症大鼠的血浆p r r p 量比l e a n 大鼠的血浆p r r p 量低 3 5 。腹腔注射p r r p 1 3 ( 1 0m g k g ) 能刺激l e a n 大鼠摄食，但对肥胖症大鼠，z u c k e r 大鼠没有影 响。大脑内注射p r r p 1 3 对这两种大鼠也都没有影响。提示，对于饮食过量和肥胖症大鼠来说， p r r p 并不影响它们的摄食行为。 p r r p 是哺乳动物摄食调控的一个抑制因子，然而，对于禽类来说，情况却有所不同。 t a c b i b a n at 等h 通过在小鸡脑室内注射p r 】r p 来观察对其影响。首先发现脑室内注射p r r p 能够明显增加小鸡的摄食量，这与哺乳动物的情况完全不同。但是在等摩尔的条件下，p r r p 的促进食欲的作用明显不如神经肽y ( n p y ) 。神经肽y 是一个潜在的促进食欲的神经肽，与 p r r p 同时注射，它的促进食欲作用会进一步加强。这些结果表明，小鸡脑中存在一种新奇的 促进食欲的作用机制，这可能与n p y 的调控途径不一样。除此，脑室内注射p r r p 能明显降 低肛温，但是其作用明显弱于n p y ，提示在小鸡中p r r p 可能抑制能量消耗。因此，推断在 禽类中，p r r p 可能既参与摄食行为的调节，有参与能量代谢的调控。 然而，在金鱼方面的研究结果却和禽类不一样，p r r p 对于金鱼米说是一个抑制因子。 p r r p 在金鱼人脑中的个别区域里有表达，尤其是卜丘脑。腹膜内或脑室内注射p r r p 能抑制 8 都军霞 催乳素释放肽( p r r p ) 在小鼠不同组织的表达规律初探 金鱼摄食，且呈剂量依赖性。在喂养七天后和食物剥夺七天后，下丘脑p r r pm r n a 的表达量 都有明显增加。但是七天食物剥夺后重新喂养金鱼，p r r pm r n a 的表达量并未增加。这些结 果提示，p r 】r p 在特定的喂养时间里短期内起到抑制摄食的作用，过长时期内并没有这种作用。 训练金鱼适于弱离子环境后，能降低血清渗克分子浓度，同时增加p r r p 和p r lm r n a 的 表达量。这些结果可以推测p r r p 通过其作用于泌乳细胞来参与氢离子平衡的调控。另外，适 应弱离子水环境能降低p r r p 对金鱼的抑制摄食作用，提示p r r p 对金鱼的这种作用是通过交 替的全身需要达到抗衡。通过喂养盐量高的食物，使得p r r p 对适应弱离子水环境的金鱼的摄 食抑制作用返回原状，这就进一步证明了p r r p 对金鱼的这种作用是通过不断的全身需达到抗 衡这一结论嘲1 。综上这些研究可以表明p r r p 参与金鱼的摄食和氢离子平衡，。且这种功能根 据外界环境变化引起的机体需求而改变。 1 4 。6 对睡眠的作用 p r 】r p 可能还参与睡眠的调节。侧脑室内注入0 1 n m o l 的p r r p 能促进快眼动相睡眠o 也m ) ， 注入1 0 n m o l 的p r 】r p 能同时促进r e m 和非r e m 。而注入1 0 0 n m o l 的p r r p 只能促进非r e m ，并 伴有发热反应棚。l i n 等“3 1 向处于慢波睡眠时相的雄性s d 大鼠侧脑室内注射p r r p ( 1 1 0 n m 0 1 ) 能明显抑制睡眠波动。同时能延长觉醒时间。在遗传性的癫痫发作动物模型s t r a s b o u r g 鼠中， 高剂量的p r r p ( 1 0 - - - 1 0 0 n m 0 1 ) 同样地可以抑制棘波放电。提示，p r r p 调节网状丘脑核功能来 改善睡眠和控制癫痫小发作。 1 4 7 对应激的作用 催乳素释放肽最初被认为是参与调控腺垂体催乳素的分泌，但是它在髓状去甲肾上腺能 神经元中表达亮很高，这更与内感应性功能或身体感觉信息传导功能相一致。为了更好地鉴 定催乳素释放肽的这种功能，t m o r a l c s ba n dp e s a w c h c n k o a 采用免疫组织化学和杂交组 织化学法探测p r r p 神经元对泌乳、吮吸、急性f o o t s h o c k 或低压出血所表现出的反应能力。 结果，泌乳组髓质部分p r r p m r n a 信号相对于雄性和雌性动情间期组有所减少，其中，孤束 核n t s 和延髓腹外侧的阳性杂交细胞数分别减少4 2 和4 3 。而在突发的9 0 分钟吮吸后被 杀的母鼠的髓状p r r p 神经元未表现出任何表达，尽管反应神经元在n t s 尾部其他部位能够 检测到。相应地，低血压者急性照射组或f o o t s h o c k 组髓状神经元都有p r r pm r n a 表达。大 部分髓状p r r p 对f o o t s h o c k 的敏感强于出血组。这些结果表明髓状p r r p 神经元在泌乳期起负 调控作用，且并不会因为吮吸刺激而有所回收。这些表明对不同急性应激物所表现出的差别 感受性。因此，p r r p 可能参与神经内分泌和应激调节过程。m e r at 等4 5 舶采用原位杂交组 织化学法探究了抑制应激、伤害性刺激和急性炎症应激对下丘脑背侧核、孤束核和延髓腹外 侧区的p r r pm r n a 表达的影响。结果显示，抑制应激和急性炎症应激正调控孤束核和延髓腹 外侧区p r r pm r n a 的表达：伤害性刺激止调控延髓腹外侧区p r r pm r n a 的表达。提示，p r r p 是一个潜在的应激反应介导剂。 1 4 8 环境方面 9 都军霞催乳素释放肽) 在小鼠不同组织的表达规律初探 s a k a m o t o 4 7 1 研究了p r r p 在广盐性泥鳅中的表达。结果表明，p r r p 不仅在脑和下丘脑 表达，还在外周器官有表达。在肝，肠和卵巢中大量表达，在皮肤和肾中少量表达，而p r l m r n a 的分布与n r pm r n a 的一致，在这些器官也有检测到。为适应环境的变化，p r r p 的 表达量会随着环境的变化而改变，且p r r p 的变化与p r l 的变化一致，脑中的f r r em r n a 和 下丘脑的p r l m r n a 在淡水和陆栖环境中表达量增加，但是淡水中的鱼肠道中的表达量比咸 水中的要高，但是在肝中无明显变化。因此，p r r p - p r l 轴可能在适应环境变化方面起着器官 特异性的作用。， m o r i y a m a 等啪1 在海洋八目鳗和海七鳃鲠中鉴定了几种r f a m i d e 肽，它们是硬骨鱼p r r p 的同系物，且具有体外促进垂体激素释放的作用采用c 1 8 填充柱、抗大马哈鱼p r r p 血清亲 合色谱法和十八( 烷) 基硅烷( o d s 1 2 0 t ) 反相高压液相层析从海洋八目鳗脑中包括下丘脑的 酸抽提物中分离得到两种r f a m i d e 肽a 和b ( r f a - a 和鼬a b ) 。氨基酸序列和大量光谱测 定分析显示r f a - a 和r f a b 分别是由2 5 和2 0 个氨基酸组成，且羧基端氨基酸序列的相似性 达到7 5 。克隆了编码为1 4 2 个氨基酸的前激素原的r f a bc d n a ，在4 8 6 7 位置的被诱导的 氨基酸序列为r f a b 。然而前激素原并不诱导与r f a a 相似的氨基酸序列。抗大马哈鱼p r r p 血清免疫反应的细胞体位于漏斗核室周、下丘脑的腹侧部，免疫反应的纤维在从下丘脑到脑 部之间有大量分布。在垂体喙的远侧部的背半部检测到很少的免疫反应纤维，接近于 g h - p r o d u c i n gc e l l s 。除此，在垂体中间体能观察到抗大马哈鱼p r r p 免疫反应，对应于促黑激 素细胞。同样，r f a - bm r n a 在脑部和垂体中间部也能检测到。合成的r f a - a 和r f a - b 在体 外剂量依赖性地抑制生长激素m r n a 的表达，这与硬骨鱼p r r p 对生长激素的抑制作用是一 致的。r f a - a 和r f a b 也能抑制促黑激素原m r n a 的表达，但是并不影响阿片皮质素原和绒 促性