（分析化学专业论文）分离生物大分子液相色谱填料的合成和评价.pdf

分离生物大分子液相色谱填料的合成和评价 摘要 色谱是分离分析生物大分子类物质的最主要手段，而液相色谱填料是 实现色谱分离的核心材料，因此具有重要的研究意义。本文主要研究以大 孔硅胶为基质的分离生物大分子液相色谱填料，制各了键合型和聚合型两 类色谱固定相，并对填料的色谱性能进行了考察。得到如下结果： 1 牙u 用硅胶表面的键合反应制备了键合眄6 0 色谱固定相，以三甲 基氯硅烷为钝化试剂对键合填料进行封端处理，通过将融 5 6 0 结构中的 环氧结构水解为两个亲水性的醇羟基，制备了亲水性良好的二醇键合色谱 填料。填料装柱后，通过蛋白质分离实验证明该固定相对生物大分子适应 性良好，获得了较好的分离效果，柱子渗透性好，适合生物大分子的高效、 快速分离。 2 制备了两种具有双键结构的键合固定相键合k h 5 7 0 固定相和键合 乙烯基固定相，并在此基础上利用聚合反应，以过氧化苯甲酰( b p 0 ) 为 引发剂，对二乙烯基苯( d ) 为交联剂，甲基丙烯酸2 羟基丙酯为聚 合单体进行聚合反应，制备了硅胶基质聚合物的液相色谱固定相，优化了 反应条件。蛋白质类生物大分子的分离实验证明：填料对生物大分子具有 良好的亲和性和生物适应性，渗透性好，能实现快速、高效的分离，此外 填料在碱性条件下表现出很强的耐受性。 关键词：色谱填料，蛋白质分离，大孔硅胶，高效液相色谱，硅胶固定 相 a b s t r a ( - r p r e p a r a t i o na n dc h r o m a r 0 g r a p h i c c h a r a c t e r i s t i c s0 fh p l cs t a t i o n a r y p h a s ef o rb 1 0 s e p i 气r 栅o n b i o s e p a r a t i o np “) c e s s i sd o m i n a t e db yc h r o 眦t o g r 印h i cs t e p s h p l c s t a t i o n a r yp h a s ei sv e r yu s e f t l li i lh p l cs e p a r a t i o n s oi ti si m p o r t a n tt os t u d y h p l cs t a t i o n a r yp h a s e 1 nm yr e s e a r c him a i n l ys t u d i e dm a c r o p o r o u ss i l i c a g e ls t a t i o n a r yp h a s e 私 s e p a r a t i i l g m e d i af o r s 印a 枷o n o f p r o t e i n s m a c f 莎p o r o l l ss i l i c ag e li sr e a c 刚w i t bs i l a n e sf o rc o l u 娜p a c l 【i n g t w o 哆p e s o fs t a t i o n a r y p h a s e s a r e p r e p a r e d ；1 ) s i l i c a - b o n d e ds t a t i o n a r yp h a s e ；2 ) s i l i b a s e d p o l y m e r b o n d e d s t a t i o n a r yp h a s e c h r o m a t o g r a p h i c c h a r a c t e r i s t i c so fs t a t i o n a r yp h a s e sa 陀a l s os t i l d i e d 1 m a c r 0 - p o r 0 1 l ss i l i c ag e lr e a c t e dw i t hs i l a n e s 西6 0a i l ds i l i c ab o n d e d s t a t i o n a r yp h a s ei sp r e p a r e d 1 ti ss i l i c a - b o n d e ds i l a n e k h 5 6 0s t a t i o n a r yp h a s e t h e nt r i m e t h y l c h l o r o s i l a i l e ( s i ( c h 3 ) 3c 1 ) r e a c t e d 谢t hr e s i d u a ls i 一0 ht om a k e i ti n a c t i v e e p o x yc o m p o u n d si nk h 5 6 0b o n d e ds i l i c ag e ls t a t i o n a r yp h a s ea r e h y d r 0 1 y z e d ( b l u m ni sp a c k e da n da p p l i e dt os 印a r a t i o no fp r o t e i n s i ts h o w s 9 0 0 dr e s u l t s t h i ss t a t i o n a r ) rp h a s ei si n a c t i v ew i t bp r o t e i n sa n dd o e sn o t d e s t f o yt h en a m r eo fp r o t e i n s s oi ti ss u i t a b l ef o rs e p a r a t i o no fp r o t e i n s t h i s c 0 1 姗【l i lh a sa l s og o o dp e r m e a b i l i t y 。l tc a nb eu s e df o rq u i c ka n dh i 曲e f f i c i e n t s e p a m t i o no fp r o t e i n s 2 t w ot y p e so fs i l i c a b o n d e ds t a t i o n a r ) r p h a s e sh a v i n g 蹦k e n e sa f e p r e p a r e d o n ei s 壬7 0b o n d e ds i l i c ag e l a m o t h e ri sv i n y lb o n d e ds i l i c ag e l 1 1 1 e s e t y p e s o fs i l i c a g e l a r er e a d e dw i t h 1 ，4 - d i v i n y l b e n z e n e a n d 2 - h y d r o x y p r o p y li n e t h a c r y l a t et om a k es i l i c a b a s e d - p o l y m e r b o n d e dp h a s e t t l 北京化t 人学坷! i j 学化葩_ ； ： o p l m u mr e a c t i o n c o n d i t i o n sa r es e l e c t e d i h e nc o l u m nw a sp a c k e da n d a p p l i e d t o s e p a r a t i o no fp r o t e i n s p o l y m e r i z a t i o n h a sn oe f f e c to n m a c f o p o 枷s n i sc o l u 砌h a s g o o dp e 咖e a b i l i t y s i l i c a - b a s e d 。p o l y m e r b o n d e ds t a t i o n a r yp h a s ei sa l s oi i l a c t 主v ew i t hp r o t e i n s 卸dd o e s n o td e s t r o yt h en a t u r co fp r o t e i n 1 tc a nb eu s e df o rq u i c ka n dh i g l le f f i c i e n t s e p a r a t i o no fp r o t e i i l s t h i ss t a t i o n a r yp h a s ei sa l s os t a b l e 面b a s i cs o l v e n t k e yw o r d s ：s t a t i o n a qp h a s e ，p r o t e i i ls e p a r a t i o n ，m a c r o p o r o u ss i l i c ag e i ， h p l c ，s i l i c ag e ls t a t i o n a r yp h a s e i v 北京化工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律后果由本人自己承担。 作者签名： 至生日期：2 咝点旦至旦 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的 规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属于北 京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在卫年解密后适用本授 权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名：至垄 日期：丝塑生组i 鱼 导师签名：魁 日期：塑! 垒壁旦 第一审绪论 1 1 前言 第一章绪论 2 0 世纪7 0 年代，生命科学、信息科学和计算机技术的发展，使分析化学进入了 分析科学的崭新阶段，它不只限于测定物质的组成和含量，而要对物质的状态( 氧化一 还原态、各种结合态、结晶态) 、结构( 一维、二维、三维空间分布) 、微区、薄层和表 面的组成与结构以及化学行为和生物活性等做出瞬时追踪，无损和在线监测等分析及 过程控制，甚至要求直接观察原子和分子的形态与排列【1 1 。分析化学成为一门仪器装 置和测量的科学，在推进人们弄清环境和生命有关的化学问题中起着关键作用。分析 化学致力于探索并建立新的分离、分析测试理论与表征分析技术，为材料科学和生命 科学的发展提供技术支持，为人口与健康、国家安全等领域提供强大的技术保障。 生命科学、药物科学、环境科学和材料科学的迅猛发展，为新世纪分析化学提出 了新的挑战。高效液相色谱呷p l c ) 是目前使用最广泛的分析方法之一，从二十世纪七 十年代现代液相色谱出现距今在短短的几十年的时自j 里得到了迅速发展和广泛应用。 这种技术不仅满足了不同组分混合物的分离和制各，而且提供了同时定性和定量分 析，性能优良的液相色谱柱能够在p h1 1 3 条件下使用，可用于中性、酸性化合物， 尤其适于碱性及含碱性基团化合物的分离，如分离蛋白、多欣、生物碱、中西药物等。 囡此高效液相色谱在分离检测大分子特别是生物大分子如蛋白质、核酸等物质中具有 其不可替代的优点。根据m a i o 瑙统计，在药物学、生物医学、生物化学和环境分析中 大约8 0 的分离可以通过这种技术实现。近年来生命科学、药物科学、环境科学和材 料科学发展迅速对色谱分离检测提出了更高的要求，也推动了高效液相色谱的迅猛发 展，目前液相色谱在全世界年销售额约为3 7 亿元之多，而且预计每年以7 9 的速度 增长。 据统计，生命、环境和材料科学领域中的分离、分析任务大部分可以单独或联用 液相色谱技术来完成：另一方面，在制药和精细化工的生产中制备色谱已成为主要分 离手段，与其它分离操作相比液相色谱分离效能无以伦比。 本研究课题的研究方向硅胶基质色谱填料广泛的用于液相色谱中，色谱填料是 液相色谱实现组分分离的关键部件，直接影响到色谱的分离效率和检测数据的准确 性。已知现代工业制备色谱柱直径己达8 0 c m l 2 l 。但是广泛使用的硅胶基质柱填料由于 自身化学稳定性不够以及表面酸性等缺陷，使之不能完全满足需要，或者使用寿命很 北京化t 人学瑚f + 学位论史 短【3 l ，因此柱填料的化学稳定性已成为制约液相色谱技术的瓶颈，开发和研制优良化 学稳定性的柱填料具有广阔应用前景。因此跟踪国际研究形势，研制我们自己的液相 色谱固定相是十分有意义的，特别是在大孔硅胶载体上键合并交联包覆有机聚合物固 定相，能达到快速分离生物大分子的目的。且成本低，不仅适应了色谱学科本身的发 展，而且同生命科学等的发展也有密切联系，它蕴藏着极大的市场需求和社会经济效 益，对国内和国际相关领域都具有重要的科学价值和实用意义。 1 2 色谱分离技术 色谱是根据混合物中溶质在互不相容的两相间分配行为的差别，从而引起迁移速 度的不同而进行分离的方法1 4 l 。1 9 0 6 年俄国生物学家t s w e e t 利用吸附剂分离叶绿素 时1 5 l ，色谱一词才被正式采用。二十世纪四十年代以后，色谱技术才在各个领域逐步 被广大科研人员所接受。根据流动相的不同，色谱分为气相色谱和液相色谱。从现代 分离科学理论计算得出，色谱和电泳是目前所知最好的两种分离方法，其塔板数可达 百万数量级。但是，因受到电压、发热等因素的限制【”，电泳法目前很少用于规模化 的生物大分子的分离与纯化，而液相色谱法一般是在常温下进行的，因而不会造成对 温度耐受性差的样品的分解，在温和溶剂条件下也不会造成生物样品的构型改变和生 物活性的破坏，此外液相色谱具有较高的柱容量，具有发展成为工业规模分离的巨大 潜力，因此液相色谱技术在常规样品分析及生物大分子分离分析领域应用前景十分广 阔，这也是是人们把分离和纯化蛋白质、酶、核酸、多糖等生物大分子物质的研究重 点放在色谱分离上的原因i “。 色谱技术从原理上看，采用液体流动相的分离主要基于五种原理1 8 l ：( i ) 离子 交换；( i i ) 体积排阻；( i i i ) 亲和作用；( ) 分配作用：( v ) 吸附作用。 下表概述了目前已经有应用并对分离机理有较深入了解的几种生物大分子液相色 谱分离技术。以下从不同的分离机理出发，对生物大分子分离的主要技术进行简要的 介绍。 2 第一章绪论 表1 1 生物大分子色谱分离的技术 t a b i cl 1b i o 】吲c a lm a c m o l e c u 】髂鸵p e r a t j 如b ye h r o m a t o g r a 曲yt e c h n 0 1 0 醪 1 2 1 离子交换色谱 离子交换色谱( i 咖强c h a n g cc h r o m a t o g f a p h y c ) 是应用最为广泛的色谱技术， 蛋白质的离子交换色谱分离至今仍是很受欢迎的一种分离方法1 9 l l 叭。所谓离子交换色 谱即是以离子交换剂为固定相，利用适宜的溶剂为流动相，根据流动相中的带电溶质 与离子交换剂之问静电作用力的差异来实现分离溶质的洗脱色谱法i n l 。现在，离子交 换色谱技术被广泛的应用在生物化工、制药、环保以及食品等领域中。离子交换色谱 已经发展成分离和纯化蛋白质、核酸和其它带电生物分子的主要手段。 离子交换色谱分离生物物质的原理：在水溶液中，离子交换剂骨架上的功能基所 带的可交换离子会发生解离，解离出的离子在离子交换剂网状结构内可进行较大范围 的自由迁移，并与溶液中其它同种类型的离子间发生等当量的离子交换。上述交换过 程为可逆过程，经过一段时间后可达到平衡，整个过程中离子交换剂和溶液始终保持 电中性。通过这种可逆的交换作用以及功能基与不同离子问静电作用力的差异，可以 达到对水溶液中的带电溶质如蛋白质、多肽、核酸、聚核苷酸和其它带电生物分子等 进行分离、置换和浓缩的目的1 1 2 l 。按照可交换离子的带电情况，离子交换剂可分为阴 离子交换齐u 和阳离子交换剂i l m 。 i e c 由于价廉和纯化后的生物分子多保持原有活性，是生物大分子分离和纯优中 应用广泛的通用型色谱技术。离子交换色谱作为一种分离技术，是利用电荷之间的选 择性相互作用力，其应用于蛋白质的分离又有一些新的特点。依据p h 值和盐浓度的 变化与使用固定相的种类，可用p h 、盐浓度梯度或等度洗脱，除蛋白的活性部位处 于可解离型基团上，用i e c 分离时可能失活外，在绝大多数情况下，以i e c 法进行分 3 北京他t 人学倒! i “学位论文 离和纯化的蛋白均保持原有的活性“。 i e c 自从上世纪五十年代开始应用于生物物质的分离以来，已经逐渐发展成为分 离纯化带电生物大分子的主要手段。以蛋白质为例，在所有公开发表的纯化方案中， 有7 5 使用了离子交换剂1 1 5 l 。这一分离方法的主要优点为【1 3 l ：( 1 ) 料液处理量大，具 有浓缩作用，可在较高流速下操作；( 2 ) 应用范围广，选择性较高；( 3 ) 产品收率高；( 4 ) 商品化介质种类多，选择余地大，价格也相对便宜。 1 2 2 体积排阻色谱 体积排阻色谱( s i z ec x c l u s i o c h 舢a t o 留a p h y ，s e c ) 是一种纯粹按照溶质分子 在流动相溶剂中的体积大小分离的色谱法。其分离原理如下：凝胶过滤介质具有一定 孔径分布，当含有不同尺寸的溶质分子的料液通过色谱柱时，分子量很大的分子无法 进入凝胶内部，其相应的床层空隙最小，因此最先被洗脱下来；分子量相对较小的分 子能够进入到部分凝胶微孔中，床层空隙较大，洗脱体积也相应增加；分子量很小的 分子则能够进入到凝胶的所有微孔中，因而其洗脱体积接近柱体积；根据洗脱体积的 不同，可实现各组分之问的分离。随所用填料的孔径太小不同，s e c 能分离的分子量 范围在1 万到2 0 0 万之间。对于分析分离或实验室小规模制各，平均粒度在3 - 1 3 微米 的规格较适用，有良好的柱效率和分离能力1 1 6 。但对大规模的制备分离和纯化，因要 考虑成本和渗透性，可以采用较粗的粒度。体积排阻色谱一般用作原料液的初步分离， 获取几个分子量级分，供进步分离纯化使用。 g f c 的优点是分离机理简单、操作参数少、介质价格相对低廉、过程易于放大。 但是，该方法也具有选择性低、料液处理量小等缺点。在工业上，g f c 主要用于产品 的精制及脱盐。 1 2 - 3 亲和色谱 亲和色谱( a f f i n i t yc b m m a t o g r a p h y ，a c ) 是一种基于生物活性物质与其它分子 之间可逆的特异性相互作用的色谱分离技术旧。目前关于亲和作用的机理尚不十分清 楚。一般认为，蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和结合的部位，这些结合部位呈 凹陷或凸起的结构，能与该蛋白质发生亲和作用的分子恰好可以进入到此结构中，就 象钥匙和锁孔的关系一样，即“锁钥学说”。除了分子结构相互匹配之外，亲和作用 还需要在静电作用、氢键、疏水性相互作用、配位键和弱共价键等作用力中的一种或 4 第一章绪论 几种的辅助下才能实现。 利用a c 法纯化蛋白质的报导最早见于1 9 1 0 年。但是由于亲和吸附介质制备困 难，阻碍了亲和技术的发展。从上世纪七十年代开始，这项技术开始在研究领域中得 到了应用，目前已经发展成为分离各种类型生物大分子的一种快速、有效的手段。随 着吸附剂制备技术的不断进步，以往严重困扰亲和色谱技术的配基流失问题已得到了 很大程度的改善，从而为a c 技术在工业上的大规模应用扫清了障碍。 1 2 4 疏水作用色谱 疏水作用色谱( h y d m p h o b i ci n t e m c t i o nc h r o m a l o 掣a p h y ，h l c ) 是指采用含有疏 水性配基的分离介质应用于生物分离的色谱过程f 1 8 】，它以表面偶联弱疏水性基团的疏 水性吸附剂为固定相，盐浓度较高的水溶液为流动相，根据生物大分子特别是蛋白质 与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行分离纯化。在h l c 分离过程中， 疏水配基的类型、组成和链长决定了蛋白质在分离介质中的保留行为和色谱柱对蛋白 质的选择性。由于随着水相盐浓度的降低，疏水性相互作用减弱，因此可采用降低水 相中的离子强度的方式对吸附的蛋白质进行洗脱。目前，h l c 已作为一种分离和纯化 蛋白质的有效手段而被广泛应用于大规模的工业生产中i 例。由于其分离机理及操作条 件与压c 互补，因此经常与腰c 耦合使用。 1 2 5 分配色谱 分配色谱( d i s t r i b u t i o nc h r o m a t o 野印h y ，d c ) 的流动相与固定相都是液体，因而 又称为液液色谱，其原理是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数的不同而分 离。根据分配原理进行色谱分离操作的方法有两种：一种是柱( 纸或板) 色谱分离法， 其固定相是将与流动相互不相溶的液体涂渍到载体上形成的：另一种是逆流分离法， 其固定相( 重相) 和流动相( 轻相) 都放在一组特别的分配管中，用来完成这种操作 的仪嚣称为逆流分配仅1 2 0 j 。根据固定相和流动相的极性与非极性的差别，分配色谱又 可分为正相色谱和反相色谱。反相色谱( r 州e r s c d - p h a s ec h m m a t 9 9 r a p h y ，r p c ) 是利 用非极性的介质为固定相，极性有机溶剂或其水溶液为流动相，根据溶质极性( 疏水 佳) 的差别进行溶质分离纯化的洗脱色谱法1 2 1 l 。与前述h i c 同样，r p c 中溶质也通 过疏水性相互作用分配于固定相表面。但是r p c 固定相表面完全被非极性基团所覆 盖，表现强烈的疏水性。因此，必须采用极性有机溶剂( 如甲醇、乙腈等) 或其水溶 北京化t 人学倾l j 学位论史 液进行溶质的洗脱分离。反相介质性能稳定，分离效率高，可分离蛋白质、多肽和氨 基酸等含有非极性基团的各种物质。作为定量分析手段，r p c 被广泛应用于科学研究、 临床诊断、工业检测和环境保护等行业。在肽谱的测定中。r p c 是酋选的方法。 1 2 6 共价色谱 共价色谱( c o v a l e mc h r o m a t o g r a p h y ) 的基本原理为利用生物大分子中的功能基 团与吸附剂上的互补结构形成的共价键来实现分离操作田l 。比较典型的共价色谱介质 为带有二硫键的琼脂糖颗粒，可以与带巯基的蛋白质发生可逆的共价结合。洗脱时可 采用l 半胱氨酸、巯基乙醇以及还原型谷胱甘肽等分子巯基化合物为洗脱剂。共价色 谱法可用于纯化牛乳巯基氧化酶、从大肠杆菌培养液中提取青霉素酰化酶、以及从大 分予量蛋白质中分离含硫的多肽。这种色谱有人用它从e - o o l i 发酵液中纯化生长因子 e f t u 和e f g ，也有人利用它来纯化质粒d n a 【列。 1 3 色谱介质 色谱填料是液相色谱实现组分分离的关键材料，直接影响到色谱的分离效率和检 测数据的准确性，是色谱分析的核心。色谱填料是各种分离模式赖以建立和发展的基 础，因此高效液相色谱柱填料的研究一直是色谱研究中最丰富、晟有活力、最富创造 性的部分。 根据色谱理论分析和应用实践，色谱工作者对理想色谱填料1 2 4 l 做了如下的总结； ( 1 ) 填料基质为球型结构，粒度分布均匀； ( 2 ) 具有合适的物理化学参数，有较高的比表面积，孔径分布范围窄，孔结构 理想，孔体积适宜； ( 3 ) 填料基质有良好的机械强度，高压下不变形； ( 4 ) 化学稳定性好，在酸、碱性流动相、盐等作用下不溶解，不溶胀，不收缩， 不发生化学变化； ( 5 ) 表面能量分布均匀，与溶质不发生非特异性吸附，传质速率快； ( 6 ) 表面通过键合、吸附、涂敷等方法进行表面修饰，引入各种官能团以满足 各种选择性的需要。 色谱填料根据其基质材料可以分为三大类：无机基质填料、有机基质填料和复合 材料。 6 第一章绪论 1 3 1 无机基质材料 硅胶是应用最广泛的色谱填料，已有多种粒度和孔径( 5 4 0 0 枷) 的产品。最常用 的硅胶颗粒是由硅酸缩合后经热处理而制得。孔径在1 0 0 0 啪以上的大孔硅胶通过增 大间隙孔氧化硅的孔径，并在有机盐存在的条件下进行煅烧而制得f 叫。近来，已合成 出平均孔径大约为2 0 0 0 咖的连续硅胶柱，但这种材料还没有用于生物大分子纯化。 尽管硅胶以不同形式存在，常用于色谱的是球型硅胶。硅胶颗粒在压力下稳定，并易 于被衍生化以引入官能团。纯硅胶颗粒是无定形的，主要成分是( s i 0 2 h 2 0 k 。表面硅 氧键可以是硅氧烷键( s i 0 s i ) 、孤立硅醇基( s i o h ) 或通过氢键缔合的硅醇基 ( s i o h o s i ) 。 硅胶在温和碱性条件下不稳定，在p h 8 时彻底溶解。此外，在p h ( 4 时去质子 硅醇基( p 磁为6 8 ) 与生物分子的碱性部分发生非特异反应。可通过减少硅醇基活性 而限制这些缺陷。常用的办法是提高硅胶的纯度和采用内部键合或缔合硅醇基比例 较大的硅胶。缔合硅醇基酸性比自由硅醇基弱瞄l ，也可以通过用单体或聚合硅烷对硅 醇基进行化学修饰而使表面活性降至最低。然而，在低p h 值条件下，硅烷键如不用 大基团进行立体保护将水解，易引起色谱性能改变。 由于硅胶的化学不稳定性，合成既具有高机械强度又具有良好化学稳定性的新 型色谱介质受到关注。其它金属氧化物，如：氧化铝( a 1 2 0 3 ) 、氧化钛( t i 0 2 ) 、氧化锆 ( z r 0 21 等受到重视。 金属氧化物以多种非晶形和结晶形式存在，它们的化学稳定性比硅胶高。氧化铝 的抗化学侵蚀性比氧化硅好，只在p h ，1 2 和p h 1 0 时迅速水解成聚丙烯酸。为改善其性能，已通过改变 其化学组成和单体与交联剂的浓度进行了许多研究。通过在色谱柱中直接进行单体聚 合如：甲基丙烯酰胺和哌嗪双丙烯酰胺获得连续床，流动性明显改善，流速可高达 2 0 0 0 c l h 而反压却很低。 3 、聚丙烯酸酯 在二十年前就已由甲基丙烯酸羟乙酯和二甲基丙烯酸亚乙酯悬浮共聚制得球型 聚甲基丙烯酸羟乙酯( 艇m a ) 吸附剂。当使用大量交联单体时，颗粒的刚性大，可在 高压下使用( 可达2 0 0 p a ) 。这些h e m a 颗粒表现出很强的耐水解性( p h 稳定范围为 2 1 2 ) 。在水和有机溶剂中膨胀度低，表面羟基密度高。由于其温和的疏水性能， 玎j m a 微球可直接用于蛋白质体积排除色谱和疏水交互作用色谱，而不需进一步修饰。 4 、聚乙烯高聚物 大多数聚乙烯高聚物是苯乙烯二乙烯基苯共聚物( p s d v b ) 。据聚合反应新进展， 已能制备高度交联，耐3 0 0 p a 压力的刚性聚合物微球。很明显，压力极限在很大程度 上取决于孔结构。单分布大孔p s d v b 颗粒主要通过品种聚合及其相关步骤制得。近 来用p s d v b 介质已生产出连续大孔棒状体和渗透填料嘲。在这两种情况下，流动相 都是从材科中流过而不是绕过，分子质量迁移提高了与硅胶相比，剐性聚苯乙烯基 体表现出离子自由和在整个p h 范围内稳定的优点。然而，p s d v b 基体的疏水特性 严重限制了将其直接用于生物色谱。除用于反相色谱外，必须对其进行表面修饰以增 加极性。 近来，通过4 ( 叔丁氧羰氧基) 苯乙烯聚合后除去禾叔丁氧羰基得到了聚乙烯苯 酚颗粒。与p s d v b 微球相比，它们虽然仍表现出憎水性，但极性更强，在有机溶剂 ( 如：四氢呋喃) 中的膨胀可忽略不计。 1 3 3 复合材料 由于基体材料往往造成蛋白质的非特异性吸附，且一些材料化学不稳定或在特定 操作条件下表现出很差的色谱性能，人们开始对复合材料进行深入研究。复合设计的 主要方法就是将刚性载体与作为固定相具有生物相容性和化学稳定性的另一组分结 合，并从材科结构特征方面改善色谱性能。复合填料可分为三类，包括表面键合固定 相，多孔基复合材料和复合载体。 l 、表面键合固定相 理想情况下键合相应均一且足够致密以防止蛋白质与载体表面闯相互作用。根据 起始材料和所作用途，应对涂层过程进行优化以得到足够薄能保留初始材料的多孔结 9 北京化r 人学颂f j 学位论文 构或能将柔性臂伸人溶液中的键合层。如不考虑化学组成，则固定相的结构与构象对 色谱性能起重要作用，其中一些性能如：与基体颗粒接触点数目、聚合物载量、吸附 层均一性、交联度和孔填充情况还直接与固定化过程有关。 化学修饰：可通过将官能团直接连于表面来实现化学修饰。将预聚物共价接枝或 用适当单体接枝聚台，得到的聚合物层可产生最有效的表面屏蔽。这类聚合物修饰材 料常被称作“核壳接枝”。“薄膜”类包括核壳交联或与核心表面形成多重键合的吸附剂。 “触须”最先用来描述在固态核心上接枝连上了单端线性聚合物链的离子交换材料。由 于改善了不可逆吸附位点可接近性，蛋白质变性率低，其中一些触须载体较传统离子 交换剂具有更高的传质性、选择性和结合能力。在氧化硅和其它金属氧化物上的大部 分接枝反应都能用到有机硅烷与表面羟基的反应中。据s c h i n d l c r 和s c h m i d b a u r 报道， m e o s i 的键稳定性顺序是：s o - s i z r o s i t i d s i m o s i 。在过去，大部分用作 体积排阻或交互作用色谱的氧化硅填料是通过在其天然或经衍生化表面接枝含硅烷 官能团的聚合物而制得。近年来，新引入了出聚苯乙烯c o - 乙烯基硅烷) ，丁基、戊 基和十八烷基，或( 抽、c 烷基链例接枝的氧化硅基填料。可通过组合借助于键 合相的立体屏蔽、与键合层多价连接和交联来改善水解稳定性和避免与蛋白质发生静 电相互作用。近来只引入了少数用共价键合聚合物层修饰的有机聚合物基填料。 由 于聚苯乙烯不含反应性官能团，必须预先进行活化，且绝大多数都采用f h e d e 】c m f t 反应。尽管人们己对增加p s d v b 微球反应性的较新方法，如：将二乙烯基苯与反应 性更高的苯乙烯单体共聚进行了研究，但修饰聚苯乙烯最简单的方法仍是聚合物物理 吸附。 近来报道了一些具有特殊色谱性能的聚合物固定相。h o s o y a 等研究了用于分离蛋 白质和疏水性药物混合物的带有聚甲基丙烯酸甘油酯亲水外层的疏水大孔苯乙烯微 球1 3 l l 。在p s d v b 颗粒最后聚合步骤中引入外部水层，已证明能防止蛋白质吸附， 且保留聚苯乙烯对弱疏水溶质的选择性。 聚合物物理吸附层可通过预先吸附在表面的单体聚合或沉积预聚物而制得。由于 不需要表面衍生化步骤和不受表面化学限制。聚合物物理吸附法比表面化学修饰法简 单。但是，如果吸附聚合物在流动相中可溶，为增加涂层稳定性就需在聚合物链间或 聚合物与表面问对其进一步交联。如前述定义，这些材料绝大多数属于“薄膜“范畴。 另需考虑的重要一点是聚合物相对于基体颗粒孔径的大小和在吸附溶剂中聚合物对 表面的亲和性。高亲和性将促使聚合物更好的粘附在表面，且多数情况下形成的涂层 也越均匀。另一方面，取决于固定聚合物的方法，在经修饰表面上聚合物的分布也不 同。 第一种涂层方法包括将聚合物或单体沉积在颗粒表面，接着进行溶剂挥发和交 联。据h 卸s o n 等报道，由齐聚丁二烯在多孔氧化硅上聚合而制得的p b d 涂层不是均 匀薄膜而是不均匀的孔填充剂1 3 2 1 。用反相方法可将蛋白质从p b d s i 柱上洗脱，但蛋 1 0 第一章绪论 白质却不可逆的吸附在p b d z r 0 2 柱上。在氧化锆表面所有的k w i s 酸位点都未被完 全封锁，能与蛋白质的羧基产生强烈的相互作用。这一缺点可通过使用含磷酸和置换 盐的有机溶剂而克服。在由磺化聚( n ，n 二甲基丙烯酰胺c o 丙烯酸缩水甘油酯) 覆 盖氧化硅而制得的阳离子交换剂中，也可以发现残余硅醇基参与碱性蛋白的保留机 制。 第二种制备键合相的方法包括三步：( d 从溶液中吸附聚合物和或单体，( i i ) 通过 过滤除去未吸附的聚合物，( ) 交联吸附层。该技术用到了可与核心表面通过氢键、 离子或疏水作用发生强烈反应的聚合物上这一技术已广泛用于表面亲水化，聚合物 衍生化后为体积排除和亲和色谱提供有用的材料。聚合物层的构象取决于聚合物与基 体材料间接触点的数目和聚合物的溶剂化作用。据v a m d y 等提出的定义，如果长疏 水片断位于两个吸附单元之间，向溶液中扩展成圈状或列状，并具有极性单丝的高度 柔韧性，这种材料应放认为是“毛边状的”【3 3 l 。 2 、多孔基复合材料 多孔基复合材料能将软凝胶的高度选择性和刚性基体的压力稳定性相结合。在这 类材料中，用软且多孔的聚合物网络填充大孔刚性聚合物的孔隙( 孔径为2 0 0 6 0 锄_ l n ) 。功能化后。结合配基具有良好可接近性，部分原因是由于聚合网络的柔韧性。 这些材料即使在线性速度很高时通常仍具有很高的结合量。近来报道了多孔基复合材 料的多种应用：通过在刚性聚苯乙烯氧化硅骨架的孔中注入离子交换水凝胶而制得用 于离子交换色谱的h y p e rd 载体i 川。孔隙中的葡聚糖网络通过化学结合至孔表面或化 学交联而稳定化。葡聚糖含量、交联剂与葡聚糖的摩尔比必须调整至与孔隙率和选择 性相匹配。然而，能穿过葡聚糖网络的小蛋白质仍能与内部孔表面发生非特异性吸附。 3 、复合载体 第一类复合载体包括均匀聚合物网络。它们是由两种互穿聚合组分在粒问均匀分 布而形成的。第一例是u l t 雠e la ca ，由聚丙烯酰胺和琼脂糖组成。琼脂糖基体使颗 粒具有机械强度，而聚丙烯酰胺使体积排阻色谱具有高分辨率。在过去的几年，用混 合聚合网络分离蛋白质逐渐减少。这些材料正逐步被共聚物网络、表面键合固定相和 多孔基复合材料所取代。 第二类复合载体以表面多孔微球为代表。这种介质的典型制备方法是用喷射干燥 法或千压共混法使亚微颗粒( 壳颗粒) 覆盖微球( 核心颗粒，平均孔径5 一l 陬m ) 。这主要 是为了开发比微薄膜( 无孔) 颗粒具有更大表面积、更高结合能力和比完全多孔微球具 有更优传质性能( 短扩散路径) 的微粒。这一概念主要用于制备分离有机和无机分子的 离子色谱吸附剂，包括通过静电或疏水作用将聚苯乙烯核心覆盖上带电胶乳1 3 5 l 。 其它还有用羟基磷灰石【3 6 】或氧化硅1 3 7 l 覆盖的聚乙烯( p e ) 基材料。通过改变氧化硅 和p e 颗粒大小调节氧化硅p e 复合材料的性质。根据反相机制，经适当修饰后，这 些材料用于蛋白质分离是很有用的。用线性磷酸盐梯度也可在p e 羟基磷灰石上分离 1 l 北康化t 人学坝1 学位论文 蛋白质，但在此例中观察到了蛋白质与暴露的p e 表面的不可逆非特异性吸附，直至 达到饱和。 随着新基体材料的引入、颗粒结构特征的改善和有机聚合物种类的增多，人们 为设计具有更好物理一化学稳定性、选择性和效率的复合介质已采取了更合理的步 骤，未来表面设计的发展趋势也许是制备具有特定用途的裁剪材料，这些新兴材料的 引入将广泛的应用于蛋白质等生物大分子的分离。此外，应迅速发展具有特殊性质的 聚合物，如：在特定p h 值、离子强度或温度条件下可促进与蛋白质的特异性相互作 用。 1 4 分离生物大分子的填料研究现状 1 4 1 国内外研究现状及分析 液相色谱的填料主要为硅胶及其键合硅胶。硅胶的主要优点是柱效高，机械强度 高，物理性质如孔结构、孔径、比表面积和孔径易于控制，通过表面改性可获得多种 功能固定相在高效液相色谱的发展的过程中曾使用过大颗粒全多孑l 硅胶、表面多孔的 颗粒、小颗粒全多孔硅胶。现代高效液相色谱填料绝大多数用键合的方法将活性基团 接枝到基质上，全多孔硅胶是使用最为普遍的基质1 3 8 l 。但硅胶基质存在如下缺点：( 1 ) 硅胶填料p h 稳定范围较窄，硅胶在温和碱性条件下不稳定，在p h 8 时彻底溶解。( 2 ) 碱性化合物在固定相上拖尾比较严重，甚至产生不可逆吸附；( 3 ) 在p h 4 时，硅胶 的去质子硅醇基( p k 为6 - 8 ) 与生物分子的碱性部分发生非特异反应。因此，硅胶不 能满足部分化合物尤其是生物物质和碱性药物的分离的要求。针对上述问题，可通过 减少改进基质性能而限制这些缺陷，常用的办法是提高氧化硅纯度或对硅胶表面进行 些预处理，也可以通过用单体或聚合硅烷对硅醇基进行化学修饰而使表面活性降至 最低。然而，在低p h 值条件下，硅烷键会逐渐水解，引起色谱性能改变i 飘。由于硅胶的化 学不稳定性，有机聚合物固定相机械强度不高，在流动相中会溶胀f 卅，微生物存在时 易分解，耐高温性能较差，色谱柱效比较低，难以进行梯度洗脱，因而其应用受到 一定的限制。 由于硅胶基质存在缺点，因此对硅胶基质进行改性对表面进行化学修饰来改善基 质的性能，提高柱效和适应性很有必要。不同的键合基团对基质的性能有不同的影响， 目前研究较多的是聚合物填料包括酰胺型、甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯等i 卸1 。 箱一章绪论 1 4 2 颗粒填料用于生物大分子分离的发展 ( 1 ) 大孔填料 用于生物大分子分离的填料，首先是要有较大的孔径，蛋白质、酶和核酸等生物 大分子，分子量一般在1 1 0 0 万之间。按照色谱动力学理论，当粒径和孔径之比大于o 2 时，溶质分子的扩散便受到限制，使得溶质分子不能完全到达固定相内孔表面；当孔 径足够大时，只要在孔的两边有一定的压差，溶质分子在孔内的传质就可以由对流传 递替代分子扩散，加快生物大分子在孔内的传质过程，进而改善色谱峰形并使分析分 离速度提高【4 。因此，用于分离纯化生物大分子的填料大部分采用孔径为3 0 姗或更 大的大孔颗粒。但这些大孔颗粒的机械强度一般较差，而且由于生物大分子的相对分 子质量部比较大：在液相中的扩散系数比小分子低1 2 个数量级，溶质分子在孔内停滞 流动相中的传质阻力成为制约分离效率的一个主要因素 4 2 1 ，高流速下的影响尤为显 著，使得分离生物分子的所需的时间延长，容易引起产品的降解，并且消耗大量的溶 剂 ( 2 ) 无孔填辩 生物大分子的分子体积一般较大且形状不规则，采用色谱柱进行分析分离时首 先要解决的问题是其在填料空隙内非常缓慢的扩散传质制约。第一种办法是2 0 世纪8 0 年代中期出现的无孔小粒径填料l 删，由于配体位于颗粒的外表面而不是孔内，分子在 孔内的低扩散速率不再是一个限制因素，从而达到快速传质的目的，通过使用无孔填料 的生物大分子的分离时间从1 5 m i n 以上下降到几分钟m 。无孔填料在快速分离方面具 有巨大的优势，使其在质量控制及在线分析等领域发挥着巨大的作用，同时生物大分 子的质量回收率和活性回收率也得到很大提高。无7 l 填料的最大缺点是其柱负载量较 小，其比表面积仅为3 0 l l m 大孔硅胶的1 ，3 0 1 ，4 0 ，配体数量也少。表面积小的另一个缺 点是，强保留成分很快会使颗粒问的空隙堵塞。另外由于硅胶的粒径一般为1 2 微米， 使色谱柱的背压非常高，因此只能采用3 5 锄的短色谱柱。此外，无孔填料填充柱还 需要特殊的h p l c 仪器以减小其柱外效应。 ( 3 ) 灌注填料 灌注色谱是分离生物分子的色谱介质的另个进步灌注色谱介质存在两种孔结 构：一种是7 l 径在6 0 & 8 0 0 l l m 范围内的特大孔，称为通孔( t h m u 曲p o r c ) ；另一种是孔径 在8 0 - 1 5 0 i l m 范围内连接特大孔的较小的孑l ，称为扩散孔( d i m l s i v ep o r e ) 。这种填料的 一个突出特点是溶质分子在孔内停滞流动相中的传质阻力小。这是因为颗粒内的传质 过程主要依赖于6 0 0 - 8 0 0 n m 的通孔中的对流传质，生物大分子溶质能随流动相的迅速 到达孔内的活性基团上脚l 。虽然对流孔间存在若干8 0 1 5 0 f i m 的扩散孔，但是这种孔 的孔深一般不超过1 u m ，扩散程很短，不会造成明显的传质阻力，整个传质速度非常 北京化t 人学坝l 一学位论文 快，使柱效提高。由于灌注色谱填料颗粒的结构特点，它的背压很低，而且具有在高 流速下柱效和柱容量都能保持基本不变的优点，可以在高流速下进行分离分析，缩短 分离分析时间，同时提高生物大分子质量和活性回收率。扩散孔的存在可以提供大的 表面积，所以灌注色谱填料比无孔填料的柱容量大得多。灌注色谱基质是一种理想的 分离生物大分子分离色谱基质，但灌注色谱填料的机械强度较低，而且价格昂贵，一 根2 0 o 2 i l l n l 的分析柱价格也在1 0 0 0 美元以上。 1 4 3 硅胶键合固定相填料的研究进展 近二十年来，国内外硅胶键合固定相的研究越来越深入，硅胶键合固定相的种类 繁多。这些硅胶键合固定相除了对常见化合物地分离、分析外，主要集中在药物和生 物样品的分析。在药物领域的应用包括天然药物、合成药物及生化药品主成分的含量 测定，各种杂质及分解产物的鉴别和分析，还包括药物代谢产物的分析，鉴定以及临 床治疗药物的检测和体内物质的分析等。在生物领域的应用主要是对微量生物大分子 物质( 比如对蛋白质、多肽、核苷酸以及酶) 的分离、纯化和分析。近年来国内外硅胶 键合固定相的进展如下： 国内对硅胶键合固定相的研究始于八十年代，要比国外晚十多年。但国内硅胶键 合固定相的合成及其性能研究亦非常活跃，近二十年来，为拓宽其在h p 【c 的应用范 围，尤其是在生物样品的分析分离与制备分离中得到更广泛的应用等方面做了大量的 研究工作。旷昌渝、达世禄等【4 6 ，4 7 】制各了一系列杯芳烃、冠醚和富勒烯等特殊结构功 能团的新型键合硅胶h p l c 固定相，对某些对映异构体以及氨基酸结构异构体等具有 良好的选择