（病理学与病理生理学专业论文）hcp27蛋白在乳腺癌中的表达及其意义.pdf

f 徐州医学院硕士学位论文 缩略词 a c r - b i s a i b c i p b s a d d a b d m s o d t t e d t a e g l a e r m d m 2 m o p s n b t n p m p b s p m s f p n p p 英文全称 缩略词表 a b b r e v i a t i o n 中文全称 a c r y l a m i d e - b i s a c r y l a m i d e 丙烯酰胺一丙烯酰胺双体 凋亡指数 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y lp h o s p h a t e 5 - 溴- 4 - 氯一3 一吲哚基一磷酸盐 b o v i n es e r u ma l b u m i n o p t i c a ld e n s i t y d i a m i n o b e n z i d i n e d i m e t h y ls u l f o x i d e d i t h i o t h r e i t o l e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d e t h y l e n eg l y c o lt e t r a a c e t i ca c i d e s t r o g e nr e c e p t o r m u r i n ed o u b l em i n u t e2 m o r p h o l i n op r o p a n es u l f o n i ca c i d n i t r o t e t r a z o l i u mb l u ec h l o r i d e n u c l e o p h o s m i n p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e 牛血清蛋白 光密度 二氨基联苯胺 二甲基亚砜 二硫苏糖醇 乙二胺四乙酸 乙二醇四乙酸 雌激素受体 小鼠双微体基因 吗啉代丙烷磺酸 氯化硝基四氮唑蓝 核磷蛋白 磷酸盐缓冲液 苯甲基磺酰氟 p - n i t r o p h e n y l p h o s p h a t e d i s o d i u m4 - 硝基苯基磷酸二钠盐 h e x a h y d r a t e p v d f p o l y v i n y l i d e n ed i f l u o r i d e 聚偏氟乙烯 6 2帅058 帅8i-啪y 徐州医学院硕士学位论文 p r r r n a s d s t e m e d 嘶s p r o g e s t e r o n er e c e p t o r孕酮受体 r i b o s o m a lr n a核糖体r n a s o d i u md o d e c y ls u l p h a t e十二烷基硫酸钠 n ，n ，n n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n en n ，n n - 四甲基乙二胺 t r i sh y d r o x y m e t h y la m i n om e t h a n e三羟甲基氨基甲烷 2 乳腺癌细胞的凋亡指数。 结果1 免疫组织化学结果显示，h e p 2 7 蛋白在乳腺癌组织中的表达高于癌 旁乳腺组织( 庐2 1 3 7 9 ，p 0 0 5 ) ；w e s t e r nb l o t 结果也显示乳腺癌组织中的h e p 2 7 蛋白表达高于癌旁乳腺组织( t = 3 7 1 5 8 ，p 0 0 5 ) 。2 乳腺癌组织中h e p 2 7 蛋白的表 达与瞄6 7 蛋白表达呈负相关( 严0 5 7 0 ，p 0 0 5 ) 。3 乳腺癌组织中h e p 2 7 蛋白的 表达与乳腺癌细胞凋亡指数( 灿) 呈正相关( r - - - - 0 5 8 0 ，p 0 0 5 ) 。4 乳腺癌组织中 m d m 2 蛋白的表达较癌旁乳腺组织高( 7 = 1 1 8 6 0 ，p 0 0 5 ) 。5 乳腺癌组织中h e p 2 7 蛋白与m d m 2 蛋白表达呈负相关( 产一0 5 3 1 ，p 0 0 5 ) 。6 乳腺癌组织中h e p 2 7 蛋 f 白的表达与e r 表达呈正相关( 产0 5 5 0 ，p 0 0 5 ) 。 结论1 乳腺癌组织中h e p 2 7 蛋白和m d m 2 蛋白表达均高于癌旁乳腺组织， 提示h e p 2 7 和m d m 2 基因与乳腺癌的发生可能有关。2h e p 2 7 蛋白表达强度高的 乳腺癌组织中髓一6 7 蛋白表达低，提示h e p 2 7 可能抑制乳腺癌细胞增殖。3h e p 2 7 蛋白表达强度高的乳腺癌细胞凋亡指数高，提示h e p 2 7 可能促进乳腺癌细胞凋亡。 4h e p 2 7 蛋白表达高的乳腺癌组织中m d m 2 蛋白表达较低，提示h e p 2 7 可能是 三l 徐州医学院硕士学位论文 m d m 2 的负调控因子。5h e p 2 7 蛋白在e r 阳性的乳腺癌组织中表达较高。 关键词h e p 2 7 蛋白；飚一6 7 蛋白；凋亡；m d m 2 蛋白；e r ；p r ；乳腺癌 4 徐州医学院硕士学位论文 t h ee x p r e s s i o no fh e p 2 7i nb r e a s tc a n c e ra n di t ss i g n i f i c a n c e a b s t r a c t o b j e c t i v e t oa n a l y z et h ee x p r e s s i o no fh e p 2 7i nb r e a s tc a n c e r , p a r a c a c i n o m a t i s s u e s ，a n dt h er e l a t i o n s h i po fh e p 2 7 ，c e l lp r o l i f e r a t i o na n da p o p t o s i s ，c o m b i n e d 丽t h t h ee x p r e s s i o no fm d m 2 ，e ra n dp r , t oe x p l o r et h ep o s s i b l er o l eo fh e p 2 7p r o t e i ni n t h eg e n e s i sa n dd e v e l o p m e n to fb r e a s tc a n c e r m e t h o d st h ee x p r e s s i o no fh e p 2 7 ，k i 一6 7 ，e r , p ra n dm d m 2 p r o t e i ni n6 0 c a s e so fb r e a s tc a n c e ra n dp a r a c a c i n o m at i s s u e sw e r ed e t e c t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i c a l p va n de l i v i s i o n t m p l u sm e t h o d ；w e s t e r nb l o tw a su s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no f h e p 2 7i n2 0c a s e so ff r e s hb r e a s tc a n c e ra n dp a r a c a c i n o m at i s s u e s t u n e lw a su s e dt o d e t e c tt h ea p o p t o s i si n d e x ( a i ) i nb r e a s tc a n c e r r e s u l t s1t h ee x p r e s s i o no fh e p 2 7i nb r e a s tc a n c e rw a sf o u n ds i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a ni np a r a c a c i n o m at i s s u e s ( z z = 21 3 7 9 , p 0 0 5 ) ，a n di tw a sp r o v e db yw e s t e r n b l o te i t h e “t = 3 7 15 8 ，p 0 0 5 ) 2t h e r ew a san e g a t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h e e x p r e s s i o no fh e p 2 7a n dk i 一6 7i nb r e a s tc a n c e r ( r = 一0 5 7 0 ，p q 0 5 ) 。3t h ee x p r e s s i o no f h e p 2 7w a sp o s i t i v ec o r r e l a t e d 谢廿la p o p t o s i si n d e xi nb r e a s tc a n c e r ( 产0 5 8 0 ，p 0 0 5 ) 4t h ee x p r e s s i o no fm d m 2w a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e r i n b r e a s tc a n c e rt h a ni n p a r a c a c i n o m at i s s u e s = 11 8 6 0 ，p o 0 5 ) 5t h e r ew a s an e g a t i v ec o r r e l a t i o n b e t w e e nt h ee x p r e s s i o no fh e p 2 7a n dm d m 2i nb r e a s tc a n o e r ( 产- 0 5 31 ，尸 0 0 5 ) 6 t h ee x p r e s s i o no fh e p 2 7w a sp o s i t i v ec o r r e l a t e dw i t he ri nb r e a s tc a n c e r ( r = 0 5 5 0 ， p o 0 5 ) ，b u tn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew a sf o u n db e t w e e nt h ee x p r e s s i o no fh e p 2 7a n d p ri nb r e a s tc a n c e r ( r - - - 0 2 4 4 ，胗0 0 5 ) c o n c l u s i o nit h eo v e r e x p r e s s i o no fh e p 2 7a n dm d m 2i nb r e a s tc a n c e rs u g g e s t t h a tt h eh e p 2 7a n dm d m 2m a yp l a yar o l ei nt h eg e n e s i sa n dd e v e l o p m e n to fb r e a s t c a n c e r 2t h en e g a t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ee x p r e s s i o no fh e p 2 7a n dk i 一6 7i nb r e a s t c a n c e rm a ys u g g e s tt h a th e p 2 7c a l li n h i b i tt h ec e l lp r o l i f e r a t i o n 3i nb r e a s tc a n c e r ，t h e h i g h e rh e p 2 7p r o t e i ne x p r e s s e d ，t h eh i g h e rt h ea p o p t o s i si n d e xw a s ，w h i c hm i g h tt e l lu s t h a th e p 2 7c a np r o m o t et h ec e l la p o p t o s i s 4i nb r e a s tc a n c e r ，t h en e g a t i v ec o r r e l a t i o n b e t w e e nt h ee x p r e s s i o no fh e p 2 7a n dm d m 2m a ys u g g e s tt h a th e p 2 7i san e g a t i v e 5 6 乳腺癌发生于乳腺终末导管小叶单元上皮，它的发生发展与细胞的增殖和凋 亡失衡密切相关，是一个多基因、多阶段的变化过程，涉及了多种原癌基因的激 活和抑癌基因的失活。因而，研究乳腺癌发生发展过程中相关基因的表达改变， 有利于寻求乳腺癌检测诊断指标及治疗靶点，为乳腺癌的诊断和治疗提供新的方 向，因此有重要的理论和实际意义。 h e p 2 7 基因是近年发现的一种基因，位于人类染色体1 4 q ll 上【6 1 ，可以编码与 细胞周期分裂相关的线粒体h e p 2 7 蛋白，该蛋白是一种n a d h n a d p h 依赖的氧 化还原酶，是短链脱氢还原酶( s h o r t - c h a i na l c o h o ld e h y d r o g e n a s e r e d u c t a s e ，s d r ) 家 族的一个成员【7 1 。n e p 2 7 蛋白可以从线粒体进入胞浆，从而发挥调节代谢的中间过 程和信号分子通路的功斛酊。 d e i s e n r o t h 等【9 1 最近研究发现h e p 2 7 可能是m d m 2e 3 连接酶的抑制因子，它 与m d m 2 结合可以阻断m d m 2 的e 3 连接酶活性，减少由m d m 2 介导的p 5 3 降 解，从而稳定并活化p 5 3 。也有研究发现h e p 2 7 基因在细胞周期调控中起重要作用， 该基因的过表达可以抑制细胞的增殖，使细胞处于静止期。 目前国内尚未见到h e p 2 7 蛋白的相关研究文献，而国外相关的研究主要在肿 瘤细胞系和动物实验中进行，在人类肿瘤组织中表达的研究报道很少，并且其在 肿瘤发生发展中的作用及机制尚不清楚。 本研究采用免疫组织化学和w e s t e r nb l o t 方法，检测人乳腺癌、癌旁乳腺组织 7 8 i 毫 鼠抗人m d m 2 单克隆抗体( m a b 0 1 1 6 ) 鼠抗人飚6 7 单克隆抗体( m 0 3 5 0 ) 鼠抗人e r 单克隆抗体( m 0 2 4 1 ) 鼠抗人p r 单克隆抗体( m 0 4 4 8 ) 免疫组织化学p v 6 0 0 1 试剂盒 免疫组织化学p v 6 0 0 2 试剂盒 免疫组织化学e l i v i s i o n t m p l u s 试剂盒 碱性磷酸酶标记的马抗小鼠i g g 碱性磷酸酶标记的羊抗兔i g g 多聚赖氨酸( a r 0 0 0 3 ) d a b 显色剂 i i ls i t uc e l ld e a t hd e t e c t i o ni 3 分者为阳性。 2 2 免疫组织化学染色( e l i v i s i o n 刑p l u s 法) 2 2 1实验步骤 参照试剂盒说明书，主要步骤如下： ( 1 ) 切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡水化； ( 2 ) 双蒸水冲洗，5 m i n x 3 次； ( 3 ) 高温高压修复，预先将柠檬酸缓冲液加热至9 5 ，把组织切片放入柠檬酸 缓冲液内，待压力阀弹起后开始计时2 m i n ；自然冷却至室温； ( 4 ) p b s 冲洗，5 m i n x 3 次； ( 5 ) 3 h 2 0 2 ，3 7 孵育1 0 m i r a ( 6 ) 双蒸水冲洗，5 m i n x 3 次； ( 7 ) 滴加稀释的一抗，4 。c 过夜；鼠抗人m d m 2 抗体的稀释度为1 ：7 5 ； ( 8 ) 第二天取出复温半小时，p b s 冲洗，5 m i n x 3 次； ( 9 ) 滴加增敏剂，室温孵育2 0 m i n ； ( 1 0 ) p b s 冲洗，3 m i n x 3 次； ( 1 1 ) 滴a n - 抗，室温孵育3 0 m i n ； ( 1 2 ) p b s 冲洗，3 m i n x 3 次； ( 1 3 ) d a b 显色，显微镜下观察控制显色结果； ( 1 4 ) 自来水冲洗； ( 1 5 ) 苏木素复染，盐酸分化，碳酸锂返蓝； ( 1 6 ) 梯度乙醇脱水： 徐州医学院硕士学位论文 ( 1 7 ) 二甲苯透明； ( 1 8 ) 中性树脂封片； ( 1 9 ) 光镜下观察。 p b s 代替一抗作阴性对照，已知阳性乳腺癌切片做阳性对照。 2 2 2 结果判断 m d m 2 蛋白免疫组织化学结果的评定标准：m d m 2 蛋白以细胞浆或细胞核中 出现棕黄色或棕褐色染色为阳性。判断标准同免疫组织化学p v 法。 2 3t u n e l 法检测乳腺癌细胞的凋亡指数 2 3 1 实验步骤 乳腺癌组织石蜡切片采用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的d u t p 缺口末端标 记技术( t e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s e m e d i a t e dd u t pn i c ke n dl a b e l i n g ， n 烈e l ) 检测乳腺癌细胞凋亡指数。标记性溶液代替t u n e l 反应混合液作阴性 对照。具体方法如下： ( 1 ) 切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡水化； ( 2 ) 双蒸水冲洗，5 m i n x 3 次； ( 3 ) 2 0 0 m lo 1 mp h6 0 柠檬酸缓冲液高火微波2 m i n ，然后加入8 0 m l 双蒸水， 再将切片移至p b s 中； ( 4 ) 滴加t r i s h c l 缓冲液0 1 mp h 7 5 ( 3 b s a + 2 0 胎牛血清) 3 0 m i n ； ( 5 ) p b s 冲洗，5 m i n x 2 次； ( 6 ) t u n e ld i l u t i o nb u f f e r 以1 ：5 稀释t d t ； ( 7 ) 滴加t u n e l 反应混合液，3 7 c ，避光孵育6 0 m i r a ( 8 ) p b s 冲洗，5 m i n x 3 次； ( 9 ) 荧光显微镜观察。 2 3 2 结果判断 荧光显微镜下观察：细胞核发亮绿色荧光的为阳性细胞。每张切片在高倍视 1 8 徐州医学院硕士学位论文 野下取阳性细胞最多的5 个视野拍照，每个视野计算1 0 0 个肿瘤细胞中的阳性细胞 数，以百分数表示，取5 个视野的均值记为凋亡指数( a p o p t o s i si n d e x ，a i ) 。 2 4w e s t e r nb l o t 检测蛋白 2 4 1 实验步骤 ( 1 ) 新鲜组织总蛋白提取 从液氮中取出组织，冰上将组织剪碎后移入匀浆试管中，加入含多种蛋白酶 抑制剂的匀浆液i m l ( 组织重量g ：匀浆液m l = 1 ：1 0 ) ，电动匀浆8 0 r m i n ，上下移 动转子匀浆1 2 1 5 次，冰浴中操作，待完全匀浆后倒入相应标号的e p 管中，4 c ， 1 0 0 0 9 ，离心1 5m i n ，吸取上清，放入相应标号的e p 管中。 ( 2 ) f o r l i n 酚试剂法测蛋白 分别取l o p , l 样品到新e p 管中，加入2 3 9 m l 双蒸水，同时按梯度浓度o l d 、2 0 1 d 、 4 0 1 t l 、6 0 1 m 、8 0 i t l 设置b s a ( 牛血清白蛋白) 标准蛋白，双蒸水补至终体积为2 4 m l ； 向上述每个试管中加入f o f l i n 甲2 m l ，振荡器迅速混匀后，3 0 水浴1 5 m i n ；然后 每管加入f o r l i n 乙0 2 m l 显色，立即混匀( 速度要快) ，3 0 水浴3 0 m i n ；用酶标 仪在d 5 0 0 姗波长处测b s a 组及样品组d 值，按公式计算分装体积v ： 分装体积v = 4 0 0i l g c 样品 c 样品= d 样品1 0 b 2 0 x d e o + 4 0 x d 4 0 + 6 0 x d 6 0 + 8 0 x d 8 0 b = 2 0 2 + 4 0 2 + 6 0 2 + 8 0 2 注：d 2 0 、1 9 4 0 、d 6 0 、d 8 0 分别为b s a 的2 0 t t l 、4 0 1 x l 、6 0 t d 、8 0 “l 管的d 值。 按上述计算的样品分装体积将各蛋白提取液分装，用匀浆液( 加蛋白酶) 补 至每管1 2 0 肛1 ，加入4 0 1 x l 上样缓冲液，混匀，加热煮沸5r a i n ( 液体呈均质蓝色) ， 电泳加样或2 0 c 保存。 ( 3 ) s d s 聚丙烯酰胺凝胶制备、上样及蛋白电泳 按说明书安装凝胶板后，灌注1 5 的分离胶，其上加入一层双蒸水覆盖，置 1 9 徐州医学院硕士学位论文 于室温至聚合完全，去掉上层封水，同法加入浓缩胶，迅速插梳，避免气泡形成， 待凝胶完全聚合后拔梳。按说明书将凝胶板放于电泳槽内，每孔均加入5 0 1 x g 的样 品，将电泳装置与电源相接，先恒压1 0 0 v 至溴酚蓝到达浓缩胶与分离胶的分界处， 再恒压2 0 0 v 至溴酚蓝到达胶板底部，关闭电源，根据目的蛋白位置裁胶。 ( 4 ) 转膜 转膜槽下面石墨板是正极，上面金属板是负极，从下到上放置顺序为：滤纸 p v d f 膜一且交一滤纸； 根据转膜面积( c m 2 ) 计算转膜电流( i l a ) ，电流= 膜的面积2 5 转膜张数； 电压不超过2 5 v ( 一般为2 4 v ) ； 根据分子量计算转膜时间： 小于6 0 k d 的蛋白，转膜时间= 分子量+ 1 0 ( m i l l ) ； 大于6 0 k d 的蛋白，转膜时间= 分子量( m i n ) ； 所以，h e p 2 7 蛋白转膜时间为3 7 r a i n ，f l - a c t i n ( 内参) 转膜时间为5 3 m i n 。 设定好仪器后进行转印，将蛋白转移至p v d f 膜上。 ( 5 ) 抗体结合及显色 将p v d f 膜胶面朝上放入w a s h i n gb u f f e r 缓冲液中洗膜，弃去洗液，加入浓度 为5 的脱脂奶粉封闭液，室温封闭2 h ，加入一抗，兔抗人h e p 2 7 抗体的稀释浓 度为l ：5 0 0 ，兔抗人1 3 - a c t i n 抗体的稀释浓度为1 ：5 0 0 ，4 。c 过夜； 第二天复温3 0 m i n 后，w a s h i n gb u f f e r 缓冲液中漂洗5 m i n x 3 次，加入碱性磷 酸酶标记的二抗( 1 ：5 0 0 ) ，置于摇床上，室温结合2 h ，w a s h i n gb u f f e r 缓冲液中漂 洗3 m i n x 4 次，再用双蒸水漂洗3 m i n ； 将p v d f 膜浸入b c i p n b t 显色液中，随时观察，蛋白条带显示清楚后，倒 掉显色液，加入双蒸水中止反应。 ( 6 ) 取出条带晾干，照相。 2 4 2结果判断 2 0 徐州医学院硕士学位论文 采用i m a g e j 显微图象分析系统对w e s t e r nb l o t 印迹结果进行分析，以m a r k e r 作为分子量标准，以i b - a c t i n 作为内参，计算各组h e p 2 7 蛋白d 值与f l - a c t i nd 值的 比值。 3 数据分析 采用s p s s l 6 0 软件对数据进行统计学分析，计量资料采用均数4 - 标准差 ( x s ) 表示，两两比较采用，检验( i n d e p e n d e n ts a m p l e s tt e s t ) ：计数资料采 用7 检验；指标间的相关性检验采用s p e a r m a n 相关分析，相关系数用，表示。以 a = 0 0 5 作为检验水准，p 0 0 5 为差异有统计学意义。 2 l 表lh e p 2 7 蛋白在乳腺癌及癌旁乳腺组织中的表达 1 2w e s t e mb l o t 检测结果 乳腺癌组织中h e p 2 7 蛋白的表达较癌旁乳腺组织高，差异有统计学意义 ( p 0 0 5 ) ( 见图2 ，表2 ) 。 表2 h e p 2 7 蛋白在乳腺癌及癌旁乳腺组织中的表达( i s ) 2 乳腺癌组织中h e p 2 7 蛋白与癌细胞增殖的关系 徐州医学院硕士学位论文 免疫组织化学染色显示：飚6 7 蛋白阳性表达的细胞其细胞核呈棕黄色或棕褐 色染色( 见图3 ) 。 经s p e a r m a n 相关分析，乳腺癌组织q a h e p 2 7 蛋白的表达与鼬- 6 7 蛋白的表达呈 显著负相关( p o 0 5 ) ，h e p 2 7 蛋白表达高的乳腺癌组织慰- 6 7 蛋白的表达低，h e p 2 7 蛋白表达低的乳腺癌组织飚6 7 蛋白的表达高( 见表3 ) 。 表3 乳腺癌中h e p 2 7 蛋白与鼬6 7 蛋白表达之间的关系 3 乳腺癌组织中h e p 2 7 蛋白的表达与癌细胞凋亡的关系 t u n e l 结果：6 0 例乳腺癌组织细胞凋亡指数平均为( 3 4 2 3 4 - 0 7 9 2 ) 。 经s p e a r m a n 相关分析，乳腺癌组织q b h e p 2 7 蛋白的表达与凋亡指数呈正相关 ( p o 0 5 ) ，h e p 2 7 蛋白表达强度高的乳腺癌组织细胞凋亡指数高，h e p 2 7 蛋白表 达强度低的乳腺癌组织细胞凋亡指数低( 见图4 ，表4 ) 。 表4 乳腺癌组织中h e p 2 7 蛋白表达和癌细胞a i 的关系 4m d m 2 蛋白在乳腺癌及癌旁乳腺组织中的表达 免疫组织化学染色显示：m d m 2 蛋白阳性的细胞其细胞浆或细胞核中呈棕黄 徐州医学院硕士学位论文 色或棕褐色染色，在6 0 例乳腺癌和癌旁乳腺组织q a m d m 2 蛋白表达的阳性率分别 为7 1 6 7 ( 4 3 6 0 ) 和3 3 3 3 ( 2 0 6 0 ) ，m d m 2 蛋白在乳腺癌组织中的表达高于癌 旁乳腺组织，差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 。( 见图5 ，表5 ) 表5m d m 2 蛋白在乳腺癌及癌旁乳腺组织中的表达 5 在乳腺癌中h e p 2 7 蛋白与m d m 2 蛋白表达的关系 经s p e a r m a n 相关分析，乳腺癌组织q 丁h e p 2 7 蛋白与m d m 2 蛋白的表达呈负相关 ( 氏0 0 5 ) 。( 见表6 ) 表6 乳腺癌中h e p 2 7 蛋白与m d m 2 蛋白表达之间的关系 6 乳腺癌组织中h e p 2 7 蛋白与e r 、p r 表达之间的关系 免疫组织化学染色显示：e r 、p r 阳性表达的细胞其细胞核呈棕黄色或棕褐色 染色( 图6 、7 ) 。 经s p e a r m a n 相关分析，乳腺癌组织q a h e p 2 7 蛋白的表达与e r 的表达呈显著正 相关( p 0 0 5 ) ，且1 h e p 2 7 蛋白的表达高的乳腺癌组织中e r 表达也高，反之则较低。 徐州医学院硕士学位论文 h e p 2 7 蛋白的表达与p r 的表达无相关性( 胗o 0 5 )( 见表7 ) 。 表7 乳腺癌中h e p 2 7 蛋白与e r 、p r 表达的关系 徐州医学院硕士学位论文 讨论 h e p 2 7 基因是在肝母细胞瘤h e p g 2 细胞中发现的一种基因，该基因位于人类 染色体1 4 q 1 1 2 上【6 】。h e p 2 7 基因可以编码线粒体h e p 2 7 蛋白，该蛋白是一种 n a d h n a d p h 依赖的氧化还原酶，属于短链脱氢还原酶家族的一员【刀。 h e p 2 7 蛋白是含有2 5 0 3 5 0 个残基片段的低聚物酶类，它有一段s d r 家族特 有的序列片段，这段序列片段包含了保守的核苷酸辅助因子和活性残基位点以及 保守的a p 片段折叠。h e p 2 7 蛋白的c 末端有一段三肽片段( t h r - a r g l e u ) 【8 】，由 于h e p 2 7 蛋白的m 肽不能识别过氧化酶信号通路1 【1 2 1 ，而h e p 2 7 蛋白只有在进 入细胞核并与相应受体结合后才能调节代谢的中间过程和信号分子通路。因此， 有研究发现该蛋白是通过线粒体小囊泡( m i t o c h o n d r i o nd e r i v e dv e s i c l e s ，m d v ) 从 线粒体进入胞核从而发挥作用的【1 3 - t 6 。 在正常组织中，h e p 2 7 蛋白在肝脏、肾脏表达较高，而在乳腺、骨和内皮组织 仅有少量表达，在主动脉、前列腺、脑、子宫内膜、食道、胃、结肠、肾、肺、 胰、肾上腺、脾和甲状腺等几乎没有h e p 2 7 蛋白的表达。p e l l e g r i n i t l l l 等发现在一 些肿瘤组织中，如鼻咽癌、恶性间皮瘤、胃肠道肿瘤、肺转移癌等有h e p 2 7 蛋白 的表达，并且发现伴有h e p 2 7 基因的高频杂和丢失现象，提示该基因可能与肿瘤 的发生有关。我们用免疫组织化学法检测h e p 2 7 蛋白在6 0 例乳腺癌和癌旁乳腺组 织中的表达发现，乳腺癌组织中h e p 2 7 蛋白表达增高，阳性率为4 8 3 3 ( 2 9 6 0 ) ， 而在癌旁乳腺组织中h e p 2 7 蛋白无表达或者低表达，阳性率为2 5 0 0 ( 1 5 6 0 ) ， 结果分析显示，乳腺癌组织中h e p 2 7 蛋白的表达较癌旁乳腺组织高。同时我们用 w e s t e r nb l o t 检测了h e p 2 7 蛋白在2 0 例新鲜乳腺癌和癌旁乳腺组织中的表达，也 显示同样结果，提示h e p 2 7 在乳腺癌的发生发展过程中可能也起重要作用。 细胞的增殖失调是肿瘤发生的基础【1 8 】，肿瘤细胞的代谢和d n a 的合成状态在 一定程度上反映了肿瘤细胞的增殖程度【1 9 洲。丁酸盐能可逆的抑制细胞内d n a 的 徐州医学院硕士学位论文 合成和表达，h e i n zs 等【1 刀细胞实验研究发现用丁酸盐处理h e p g 2 细胞后，h e p 2 7 蛋白在h e p g 2 细胞的细胞核中大量积聚，而过表达的h e p 2 7 蛋白可以抑制细胞生 长，并使细胞处于静止期，也表明h e p 2 7 基因的表达和细胞增殖有关，那么在肿 瘤组织中h e p 2 7 蛋白的表达与细胞的增殖之间存在什么关系呢? 硒6 7 抗原是1 9 8 3 年g e r d e s 等发现的在增殖细胞中表达的一种核抗原，它位 于1 0 q 2 5 染色体上，分子量为3 4 50 0 0 b p t 2 1 1 ，是目前较为肯定的核增殖标记物【2 2 2 3 1 。 硒6 7 基因编码飚6 7 蛋白，该蛋白是一种非组蛋白核蛋白讲，2 5 1 ，研究表明i ( i 6 7 蛋白的表达能可靠而迅速的反映恶性肿瘤细胞的增殖率，与多种恶性肿瘤的发展、 转移及预后有关1 2 6 2 7 1 。k i 6 7 的功能与染色质相连，与细胞的有丝分裂有关，由于 其半衰期短，故成为检测肿瘤细胞增殖活性的最可靠的指标口8 。o 】，有研究发现对 硒6 7 的检测可作为判断乳腺癌生物学行为及预后的一个指标【3 1 1 ，我们通过检测 6 0 例乳腺癌组织中鼬6 7 蛋白的表达，并分析h e p 2 7 蛋白与瞄6 7 之间的关系， 观察到h e p 2 7 蛋白与瓦6 7 蛋白的表达之间呈负相关( 严0 5 7 0 ，p 0 0 5 ) ，说明该 基因的表达对细胞增殖有抑制作用，可以使细胞处于静止期【3 2 j 3 1 ，提示h e p 2 7 基 因在乳腺癌的发生发展过程中可能有抑制作用。 细胞凋亡是指为维持内环境的稳定，由基因控制的细胞主动的有