（微生物学专业论文）啤酒酵母对重金属cr（Ⅲ）生物转化及生物吸附的研究.pdf

摘要 本研究以啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 作为微量元素铬生物转化 与生物吸附的载体，对重金属c r ( m ) 生物转化机理及生物吸附特点进行研究。 通过对比富铬酵母与普通酵母不同细胞物质中的铬浓度，初步确定了铬在酵 母细胞内的分布情况，酵母细胞中铬的分布是不均匀的，蛋白质结合铬是主要结 合形式，占总铬量的3 3 1 ，盐类和小分子结合铬共占总量的9 3 y o ，d n a 和r n a 结合铬分别占6 7 和5 3 ，多糖和脂类结合量较少，都低于总量的2 。 为研究c r ( i ) 的生物吸附特性，提取普通酵母蛋白质，讨论了吸附时间、 吸附p h 值及初始质量浓度等条件对吸附效果的影响，并通过正交试验获得最大 吸附量：c r ( i i i ) 起始浓度为3 0 0m g l ，p h 为7 0 ，经过2 h 吸附反应，吸附量 可达到3 4 8 6m g g 。 本研究通过光谱学方法得出结论：啤酒酵母对c r ( ) 生物吸附与生物转 化的区别在于金属与细胞之间有无配位键的形成，生物吸附c r ( l i i ) 后，固体 紫外图谱中没有铬特征峰的出现，推测铬与蛋白质之间无配位键的连接，c r ( i ) 仍然以无机离子形式存在，而c r ( 1 1 i ) 经细胞生物转化后，通过与肽链上的羰 基氧发生配位，进而与蛋白质结合，配位键的存在影响了蛋白质肽链的伸展，蛋 白质二级结构发生改变。 关键词：富铬酵母，赋存形式，生物转化，生物吸附 s t u d i e so fc r ( 1 1 1 ) b i o t r a n s f o r m a t i o na n d b i o s o r p t i o nb yb r e w e r sy e a s t a b s t r a c t u s i n gb r e w e r sy e a s ta s t h ev e c t o r , t h ec h a r a c t e r i s t i c so fc r ( i i i ) b i o t r a n s f o r m a t i o na n db i o s o r p t i o nw e r es t u d i e d t h ec o n t e n t so fc h r o m i u mi nd i f f e r e n tc o m p o n e n t sf r o mc h r o m i n m r i c h a n dn o r m a ly e a s tw e r ed e t e r m i n e d i nc h r o m i u m r i c hy e a s t ，t h ep e r c e n t a g eo f p r o t e i n - b i n d i n gf o r m si nt o t a lc e n t e n t sw a sh i 曲e s ta n dr e a c h e dt o3 3 1 ，t h e c o n t e n t so fc h r o m i u mc o m b i n e dw i t hs m a l lm o l e c u l e sa n dt h ei n o r g a n i c c h r o m i u ma c c o u n t e df o r9 3 t h ec o n t e n t so f d n a a n dr n a w e r e6 7 a n d 5 3 ，r e s p e c t i v e l y i na d d i t i o n ，t h ec o n t e n t so fp o l y s a c c h a r i d ea n dl i p i dw e r e l o w t h ey e a s t p r o t e i nw a ss e p a r a t e df o r t h es t u d yo fb i o s o r p t i o n o fc r ( 1 1 1 ) t h ec o m b i n e de f f e c t so ft h ei n i t i a lp h t h ec o n c e n t r a t i o no fc r ( i ) a n dt h eb i o s o r p t i o nt i m ew e r ei n v e s t i g a t e d u s i n ga no r t h o g o n a le x p e r i m e n t a l d e s i g n ，t h eo p t i m u mb i o s o r p t i o nc o n d i t i o n sw e r ed e t e r i m i n e d i nc o n d i t i o no f t h ei n i t i a lp h7 0 ，t h ec r ( m ) c o n c e n t r a t i o n3 0 0 m 比t h eb i o s o r p t i o nt i m e2 h ，t h eb i o s o r p t i o nq u a n t i t yc a nr e a c ht o3 4 8 6 m g g t h ec h a r a c t e r i s t i c so fp r o t e i ni nc h r o m i u m r i c hy e a s tw e r ea n a l y z e db yu v a n df r l r t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tc a r b o x y l a t eo x y g e na n dc h r o m i u mw e r e b o n d i n gw i n lc o o r d i n a t e db o n d , w h i c hc h a n g e dt h es e c o n d a r yp r o t e i ns t r u c t u r e k e yw o r d s ：c h r o m i u m - r i c hy e a s t ，c o m b i n e df o r m s ，b i o t r a n s f o r m t i o n ，b i o s o r p t i o n 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 虞学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印佬和电子版。本人允许论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 牵进行检索，可以采用影印j 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论支作者签名：则指导教师签名：童! 塾 1 2 0 0 5 年5 月2 0 日2 0 0 5 年5 月2 0 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师王卫卫教授指导下进行的研究工作及 取得豹研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或 证书而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所镀的任何贡献均己在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：尹嘶 2 0 0 5 生1 z5 月2 0 日 第一部分前言 微量元素是生物维持生命和发育所必需的营养物质，它们的重要功能早已被 人们所认识“1 ，随着细胞生物学、分子生物学的发展和检测分析技术的提高，关 于微量元素的研究已经从应用阶段发展到机制探索阶段，主要包括对其生理机制 和分子机制的探索。铬是人体必需的微量元素。1 ，同时也是目前最受争议的微量 元素嘲，铬( ) 化合物具有强致癌性，而铬( i ) 化合物常被作为功能性食品 和保健品，铬的这种复杂的生物无机化学特性引起了各国科学家的广泛关注。 铬在自然界中多以c r ( m ) 和c r ( ) 形式存在，细胞中常为c r ( i i i ) 形 式。1 ，目前国内外对c r ( ) 的研究多集中于应用与开发，对其生物转化机理的 认识存在分歧叫，c r ( ) 生物吸附的研究刚刚起步。本研究以啤酒酵母为载体， 对生物转化重金属c r ( ) 的机理及生物吸附c r ( ) 的特点进行探索。 1 铬的无机化学特点 铬的元素符号为c r ，原子量为5 1 9 9 6 ，英文名称为c h r o m i u m ，铬的原子序 数是2 4 ，处于周期表中的第六副族，原子中的6 个价电子都可以参与成键，从 一2 到+ 6 价都有，但是，最常见的价态是0 、+ 2 、+ 3 和+ 6 。 2 铬( ) 的生物学功能 2 1 铬( ) 生物学功能的发现 1 9 5 7 年美国科学家s c h v a r z 和m e r t z 首次发现从啤酒酵母或猪肾粉的酸性 水解产物中可以提取出一种能够恢复大鼠葡萄糖耐量损伤的因子，他们把这种未 鉴明的因子称为葡萄糖耐量因子( g l u c o s et o l e r a n c ef a c t o r ，g t f ) ，在进一步的 研究中他们发现铬( ) 化合物能够恢复大鼠损伤的糖耐量，认为铬( i ) 是构成 g t f 的重要组成部分叫旧。由此，确认了铬( ) 是人体和动物必需的一种微量元 素。 目前，人们所认识到的铬( ) 的生物功能还十分有限。根据现有的一些研究 结论旧。，可以认为铬主要是胰岛素的协同因子或加强剂，在葡萄糖摄入、葡 萄糖氧化为二氧化碳、葡萄糖转化为脂肪等涉及胰岛素功能的相关方面，均发挥 一定作用，但是铬并不是胰岛索的取代物，根据对胰岛素生物功能的认识，即： 胰岛素首先与靶细胞膜上的受体相结合，然后启动一系列从分子水平到细胞水平 的生物化学变化，最后产生特定的生物效应，m e r t z 等人提出了一种与此过程相 适应的关于铬生物功能的假说，他们认为铬可能是通过其较强的配位能力形成一 个胰岛素一铬一膜受体的三元配合物，推动胰岛索a 链上的硫原子与靶细胞膜上受 体部位的巯基结合形成二硫键，从而改善靶细胞对胰岛素的敏感性，协助胰岛素 有效地发挥其生物功能。 这种假说具有一定的合理性，但它没能说明胰岛素一铬一膜受体三元配合物中 铬剩余的两个配位点的配位情况此外，该假说在生命体系种种十分复杂的调控 机制的映衬下，显得似乎有点理想化和过于简单。 s u ny ( 2 0 0 0 ) 。1 报道铬的主要功能可能是通过与蛋白质结合形成生物活性 形式，激活胰岛素受体一酪氨酸激酶的活性。 随着相关研究的进一步发展，关于铬( ) 生物功能的认识会更深入、更精确。 2 2 铬( m ) 参与的人体代谢 人体内铬含量甚微，一般成人体内三价铬的总量仅为5 l o m g ，它广泛分布 于体内的各个组织器官中，并且是唯一的随着年龄增长而体内含量下降的必需元 素，因此老年人缺铬问题尤为严重。 铬的生物功能主要是胰岛素的加强剂，胰岛素作为糖代谢的核心物质，发挥 其生理作用必需有铬参加。动物实验和临床试验均表明补铬( i ) 能改善糖尿病人 的糖耐量，降低高血糖。a n d e r s o n 等( 1 9 9 7 ) o ”报道了1 8 0 例我国型糖尿病人 补充吡啶酸铬的研究，随机双盲将病人分成安慰组、2 0 0 j lgc r d 和1 0 0 0 p gc r d 组，补铬两月时2 0 0 ugc r d 和1 0 0 0 l lgc r d 组血糖、血胰岛素、糖化血红蛋白 和血胆固醇下降显著，补铬四月时上述指标持续下降，且i 0 0 0pgc r d 补铬组的 效果好于2 0 0ugc r d 组。该报道引起了国际上的广泛关注，目前市场上已有用 于防治i i 型糖尿病的有机铬产品上市。同时，铬( ) 还能增加胆固醇的分解和排 泄，缺铬可使脂肪代谢紊乱，出现高血脂症，特别是高胆固醇血症，因而容易诱发 动脉粥样硬化，而动脉粥样硬化是产生冠心病、高血压、脑血管疾病的根源，因 此有人认为缺铬是冠心病的易感因素和危险因素，也是冠心病的预测指标。 2 3 铬的生理需要量 和其它微量元素不同，铬( ) 的代谢、体内分布以及其生物功能的体现都强 烈地依赖于铬( ) 化合物的具体化学形态，因此并非所有形态的铬( ) 化合物都 2 具有生物活性。无机铬吸收率较低，只有0 4 3 ，而有机铬配合物则较易吸收， 吸收率为i 0 2 5 “1 ，此外，只有某种或某几种特定形态的铬( i i i ) 化合物才具有 生物活性，吸收到体内的其它形态的铬只有转化为生物活性铬后才能发挥其生物 功能。 尽管人们已经认识到了铬所具有的重要生理意义，然而关于铬的生理需要量 尚无明确的结论。这是因为人们对其生物功能产生机制的还不够了解，无法从理 论上进行预测；同时，铬生物功能的体现有赖于铬化合物的具体化学形态，体内 生物活性铬的含量还无法测定，因此铬的生理需要量仍未被确定。不过，到i + t 前 为止也有一些关于铬摄入推荐量数据的报道“o “，美国医学会( a m e r i c a n m e d i c a la s s o c i a t i o n ，a m a ) 根据临床全静脉营养的需要，召集有关的专家论证 推荐成人经静脉摄入的元素铬应为1 0 1 5us d ，美国的饮食推荐量 ( r e c o m m e n d e dd i e t a r ya l l o w a n c e s ，r d a ) 则建议铬的膳食安全适宜摄入量为： 成人5 0 2 0 0 ug d 。 然而，尽管铬的需要量如此之少，但是缺铬问题仍然存在，这主要是由于精 加工食品造成的。一方面，食品在精加工的过程中会有大量的铬丧失，减少了铬 的摄入量；此外，这些精加工食品还会促进体内贮存铬的大量排泄。因此，许多 人从饮食中摄入的铬量不能满足饮食推荐量的要求，比如美国“”曾按照典型美国 膳食对l o 名成年男子和2 2 名成年女子进行了铬摄入量的研究，发现受试者7 天内平均摄入铬量男子为3 3 士3ug d ( 范围2 2 4 8 1 1g d ) ，女子为2 5 士1i l g d ( 范围1 3 3 6ug d ) ，均低于膳食推荐摄入量的最低水平。 2 4 铬的毒理学性质 所有铬化合物浓度过高时都有毒性，但各种铬化合物毒性的强弱不同饼。金 属铬很不活泼，二价铬化合物一般认为是无毒的，三价铬的毒性远低于六价铬。 铬酸盐毒性大，由于溶解度大且易被迅速吸收，对生物组织有刺激性和毒性。 2 4 i 铬的毒性 海洋水生生物对铬有强大的富集能力，高志达等“”指出，水体中铬浓度为 5 m g l 时，鱼类就会出现中毒现象，铬浓度达到2 0 m g l 时，就会使鱼类死亡。 正常p h 的天然水体中，三价铬和六价铬之间可以相互转化，因此无论三价或六 价，对水生生物都能产生毒害作用。当土壤中存在过量的铬时“，将抑制水稻、 3 玉米、棉花等作物的生长，而发生不同程度的减产，铬对植物吸收和代谢产生影 响的原因主要为：引起过氧化物氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶等酶活性的显著改 变，增加作物对锰、镁离子的吸收，同时抑制对铁、锌离子的吸收，植物体对金 属离子的吸收平衡被破坏，促进了植物衰老。铬对人的毒害作用主要是偶尔吸入 极限量的铬酸或铬酸盐后，可引起肾脏、肝脏、神经系统和血液的广泛病变，导 致死亡“”。 2 4 2 铬的致癌性 铬的致癌性似乎取决于铬的价态及其化合物的溶解性“”，水溶性较低的铬化 合物活性较高，它能长期沉淀在肺部，不断地向细胞渗透，这一点也解释了为什 么铬致癌的易发部位在肺部。三价铬是人体和动物必需微量元素，六价铬为强氧 化荆、强致癌物，并且具有穿透生物膜的能力，但进入体内易与有机物反应还原 为三价铬。聚集在细胞核内的三价铬与染色体结合，对d n a 复制产生影响。三价 铬和六价铬在致癌作用中的相互影响、相互关系、反应和剂量关系等问题有待进 一步研究。 2 5 有机铬化合物的研究开发 目前，国内外对铬化合物的研究主要包括有机铬化合物和无机铬化合物两种 形式，有机铬化合物包括富铬酵母和螯合铬( 如烟酸铬、毗啶羧酸铬) 等，无机铬 化合物有c r c l 。6 h 2 0 ，c r ：( s o , ) 。等。铬主要经肠道吸收，有机铬化合物的吸收率 为i 0 2 5 ，远高于无机铬化合物( o 4 3 ) 。3 ，因此，有机铬化会物的研究更 有价值。在饲料原料中含铬最丰富的是啤酒酵母，此外，禾谷类、坚果、豆类、 植物油、肉类、奶制品、动物肝脏、胡萝h 、螃蟹等也是天然有机铬的来源。铬 ( ) 生物功能的体现强烈地依赖于铬( ) 化合物的具体化学形态，并非所有有机 铬化合物都具有生物活性，因此选择适当的铬载体是一个非常关键的问题。最理 想的生物活性铬是葡萄糖耐量因子g t f ，但是目前，g t f 的分离提纯工作还没有 取绳实质性突破，g t f 的组成和结构还不清楚，所以人工合成工作无法进行。国 内外已经报道了多种其它形式的有机铬化合物。李新生等( 2 0 0 1 ) “”报道了吡啶 羧酸铬的合成。汪成等( 2 0 0 1 ) “”报道了葡萄糖酸铬的合成及其活性。李敏等 ( 1 9 9 9 ) m 1 专门阐述t , l t 啶羧酸铬的活性。( 氨基酸铬、吡啶羧酸铬、烟酸铬的结 构如图1 、2 、3 所示) 。 4 州，；h ，壤 d 蚤 q 静 口 现在使用最普遍、效果最好的有机铬体系为富铬酵母，酵母细胞被作为铬的 优良载体之一。 2 6 铬的检测 近几十年来，关于铬的研究在生物化学、生理学、营养学等方面取得了较大 的进展，这在一定程度上要归功于铬分析测试方法的不断改进。国内外生物样品 中铬的测定方法有许多种，包括分光光度法、原予吸收光谱法、x - 射线荧光光谱 法以及反应堆中子活化法等，现对各检测方法分别作一简要介绍。 ( i )原子吸收光谱法 该方法具有灵敏度高、准确度好、分析速度快、设备及操作简单等优点、已 广泛应用于生物化学、人体组织学、食品及农产品、环境试样分析。 检测原理是将试样喷入空气一乙炔富燃火源( 黄色火焰) 中，使铬的化合物原 子化，于波长3 5 7 9 n m ( 或9 5 9 3 n n l ) 处检测，该法灵敏度较高，检出限一般为0 5 ug l ，试样测定液的浓度范围为0 3 0ug l ，样品处理视铬的含量称取0 1 0 5 9 ，用灰化法处理。 丁文军等( 1 9 9 7 ) 。“通过石墨炉原子吸收光谱法对人血清和尿液中的微量铬 进行测定，为降低基体干扰，改进了样品预处理方法，使用浓硝酸沉淀样品中的 蛋白质，提高了检出限，解决了生物样品( 血清等) 铬含量波动值过大的问题， 得到了满意的结果。刘波静( 2 0 0 0 ) 嗌1 以t r i t o n x 1 0 0 一氯化锑作基体改进剂， 提高实验灵敏度，消除了大量铁和其它共存元素的干扰，检出限达到0 0 2 7u g i g 。目前，凭借快速、简便、准确性高的特点，原子吸收光谱法已被广泛用于 饲料工业中3 。 ( 2 )分光光度法 传统的分光光度法常应用二苯碳酰二肼比色法测定样品中铬，国外广泛应用 5 q l o 的还有黄酮分光光度法“”，国内有人对这两种检测方法进行了比较啪1 ，统计学结 果显示两者无显著性差异，都适用于生物样品中铬的测定。 ( 3 )中子活化法 反应堆中子活化分析( r e n a a ) 是核分析技术的一个分支。它是利用反应堆中 子轰击待分析的样品，使其中的多种元素( 每种元素的至少一种同位素) 生成放射 性核素，根据这些核素发射的特征射线种种性质和强度，进行相应元素定性定量 测定的一种分析方法。r e n a a 方法能测定7 3 个无机元素，该方法灵敏度高，取样 量少，样品不需要前处理，测定铬的探测极限( l d ) 是1 5 1 0 。1 0 9 。刘静等( 2 0 0 3 ) 。7 1 利用中予活化分析法测定富铬酵母中的铬含量，探索富铬酵母的培养条件。 ( 4 )等离子发射光谱分析与x 一射线荧光广谱法 王静等( 2 0 0 1 ) 嘞1 利用微分脉冲催化极谱法和等离子发射光谱法测定奶粉中 铬含量，得出结论，两种方法各有特点，采用等离子发射光谱法测定铬含量，样 品前处理简单，仪器使用的线性范围较宽，但只能测定总铬含量，采用微分脉冲 催化极谱法测定铬含量，样品前处理繁杂、费时，仪器稳定性差且使用的线性范 围窄，但可同时测定总铬和六价铬，通过计算可获得三价铬浓度，可用于不同形 态铬的铡定，两种方法在应用中可灵活选择。 3 啤酒酵母对铬a 叮) 的生物转化 3 1 铬( ) 的优良载体一啤酒酵母 富铬酵母的铬载体一般是啤酒酵母( 又称酿酒酵母，s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a 0 ，是一类典型的椭圆状真核单细胞微生物。细胞的宽度为2 5 - 1 0u i l l ，长度为4 5 2 11 1m ，在光学显微镜下即可模糊地看到其中的种种结构分化。 啤酒酵母具有完接的细胞核、细胞膜和细胞壁结构，芽殖为主要的无性繁殖方式， 也可通过产生子囊孢予进行有性繁殖。啤酒酵母在固体培养基表面形成的菌落具 有湿润、较光滑、容易挑起、质地均匀等特点，为乳白色，正反面和边缘、中央 部位的颜色都很均一，还会散发一股悦人的酒香味。 以啤酒酵母作为铬的有机载体具有诸多优势，应用意义十分显著。 首先，啤酒酵母发酵制品的安全性好。啤酒酵母是一种不产生内毒素且遗传 背景较清楚的微生物。据国家规定汹1 ，微生物中除了啤酒酵母、脆壁酵母和枯草 杆菌等5 种作为食用无须做毒性实验外，其它微生物都必须通过两年以上的毒性 6 实验。因此，以啤酒酵母作为食用菌种安全性高。 其次，啤酒酵母发酵制品易于生产。啤酒酵母是人类最早驯化利用的微生物 菌种，也是现代发酵工业中历史最悠久、使用最频繁的微生物菌种，它的发酵工 艺成熟，生产周期短，便于生产，成本低廉。 再次，啤酒酵母还具有富集多种微量元素的优良性能，是目前作为微量元素 载体可能性最大的菌种。除了本论文所涉及的富集铬元素外，关于富集铁”、锌 。“和硒0 2 1 等元素的有关研究也是当前的一些热点课题。啤酒酵母的这种性能有利 于进一步开发富食多种微量元素的酵母制品。 此外，啤酒酵母还富含全面而丰富的其它营养成分。酵母菌是生产单细胞蛋 白( s i n g l ec e l lp r o t e i n ，s c p ) 最常见生物体之一，其蛋白质含量大大高于传统 的禾谷类食品。因此，用它来制备富铬酵母，除具有补铬的功效外，还可以同时 补充氨基酸等营养物质。 表1 啤酒酵母细胞物质的大致含量 t a b l e1c o n c e n t r a t i o n so fd i f f e r e n tf o r m si nb r e w e r sy e a s t 细胞物质 占细胞干重 蛋白质 d n a r n a 多糖 脂类 4 0 马 尾藻 茶叶 鼠尾藻。f o u r e s t 和v 0 1 e s k y 还将藻酸对二价离子的结合顺序作了 总结：p b c u b a s r c a c o n i z n m n m g 。 ( 4 ) 细菌b e v e r i d g e 1 和其合作者已经建立了一套实验为研究细菌对金属 1 0 的结合。许多研究表明细菌和其生物产物对溶解态的金属离子有很强的络合能力， 这主要归因于其特定的分子构型和化学组成。细胞壁带有负电荷而使整个细菌表 面呈现阴离子特性，通过细菌细胞中均聚物或杂聚物上的羰基或磷酰基等阴离子 作用可以增加金属离子的吸附呻“1 。b e v e r i d g e 和h o y l e 。2 3 研究b s u b t i l t s 细胞 壁上肽聚糖层证明其可以从水溶液中结合大量金属离子，特别是大多数过渡金属， 第一副族金属可以富集大于i n m o l m g ( 相对于肽聚糖层干重) 。研究进一步指出 e c o l i 细胞肽聚糖层上的磷酸基对二价金属离子的结合能力要强于羰基，是螯 合金属的特定区域。 ( 5 ) 非活性生物李志勇等( 2 0 0 0 ) “”研究表明，相同条件下，螺旋藻千粉比 新鲜藻能富集更多的c ，。目前，研究发现死亡的真菌细胞对不同金属都有很强 的螯合能力，这是一个不依靠代谢的被动吸附过程嘲。生物吸附是一系列被动的 重金属累积过程的集合，微生物能够积累金属是因为细胞表面上有一c o o h 、一0 h 、 磷酸基和其它一些带负电性的位点，它们不依赖微生物的生理代谢活动。活性生 物在吸附方面良好的前景，但它们的应用受许多条件的限制，例如需要营养物质 的添加，金属的毒性与环境中不适宜的p h 值都会影响吸附效果，而非活性物质 作为吸附剂可以克服这些不足。 4 1 2 生物吸附法的机理 生物吸附是指生物体从溶液中吸附金属离子、非金属化合物和固体颗粒的过 程，是一个吸附一解吸的可逆的过程，被吸附的离子可以被其它离子，螯合剂或 酸解吸下来，其机理主要为络合与离子交换。 ( 1 ) 络合机理络合是由金属离子与生物配位体中带负电的官能团结合而 形成。氨基酸中带负电的残基与一些金属离子可产生络合。羧基具有较强的络合 能力。此外，硫酸根、氨基、羟基与金属离子也存在络合现象。 ( 2 ) 离子交换机理酵母在吸附金属离子的同时经常会伴随其他离子的释 放一释放出的c a ”、h + 等离子的总电荷大致等于被吸附的电荷数。因而吸附的过 程可以被看作是一个离子交换过程。 4 1 3 生物吸附法的影响因素 由于含重金属离子废水的多样性，影响生物吸附法处理效果的因素很多。 ( 1 ) p h 值溶液的p h 值是吸附过程中一个非常重要的影响因素。一般而言， 1 1 吸附量随p h 的升高而增大，但两者之间绝非简单的线性关系。溶液的p h 值会影 响生物体表面金属吸附位点，同时决定金属离子的化学状态。p h 值较低时，金 属吸附位点被h s o + 占据，在静电斥力的作用下金属阳离子无法接近细胞表面的吸 附位点，吸附作用不能顺利进行。同理，当p h 值较大时，溶液中h + 浓度减小， 大量的吸附位点暴露出来，有利于金属离子的接近并吸附在生物表面。但p h 过 高时，大量金属离子以氢氧化物微粒的形式存在，也不利于吸附进行。 不同生物、不同金属离予有不同适宜的p h 值范围，最佳p h 值下吸附量最大。 朱一民等( 2 0 0 4 ) 睢6 3 报道啤酒酵母吸附h 9 2 + 的最佳p h 值是6 0 。刘恒等( 2 0 0 2 ) ”1 对p b ”的p h 范围是4 o 7 0 。啤酒酵母生物吸附的p h 范围一般在3 0 7 0 之间。 ( 2 ) 温度对活性生物而言，吸附温度主要通过影响生物吸附剂的生理代谢 活动、基团吸附热动力学和吸附热容等因素，进而影响吸附效果。对酵母菌而言， 温度对吸附的影响不大，一般选择2 5 3 5 。 ( 3 ) 吸附时间般而言，生物吸附荆需要2 h 或更长的时间才会达到较理想 的去除效果。酵母菌的吸附时间通常控制在2 h 之内，据以有报道，多数菌株在 l h 内吸附量可达总量的9 0 以上“叫。 ( 4 ) 共存离子由于污水的多样性，其所含的金属离子往往不是种，这些 共存离子会与目标离子竞争生物体表面的活性位点，从而抑制目标离子的吸附。 共存离子对日标离子的吸附所产生的影响十分复杂，其机理尚不完全清楚。一般 情况下共存离子会使吸附量下降，下降的程度由阴离子和金属离子间的结合力决 定。但也有例外：刘宁等( 2 0 0 2 ) 报道“7 1 即使a u ”、a g + 浓度高于。a i n 浓度2 0 0 0 多 倍时，对啤酒酵母吸附。a n i 也无明显影响。 ( 5 ) 代谢底物对活性生物体来说，适当的加入代谢底物，有利于吸附剂生理 代谢活动的增强，有利于增加细胞活力和输送金属离子的能力，从而有利于对重 金属离子的吸附富集。 ( 6 ) 其他因素其它诸如吸附剂对重金属离子的选择性，活性菌体的菌龄， 代谢抑制因子，是否进行过预处理等对吸附过程也有一定的影响。韩润平等 ( 2 0 0 0 ) 删研究了化学修饰一酯化前后啤酒酵母对p b ”的生物吸附作用，酵母菌能 结合p b 2 + , 用盐酸一甲醇酯化，其吸附能力下降3 5 ，而在强酸性条件下( p h = 2 ) ，甲 醇酯化对酵母菌吸附金属离子无影响。 4 1 4 生物吸附平衡模式 成功的数学模式对预测吸附行为、优化吸附过程是十分重要的，因此，建立 适配的吸附平衡模式是开展生物吸附研究的一个重要分支。 常见的吸附模型有l a n g m u i r 和f r e u n d l i c h 等温吸附模型。l a n g m u i r 型( ( l 型) 吸附模式是常用的描述吸附体系中金属离子吸附量与溶液中金属离子平衡浓 度之间关系的平衡模式。而f r e u n d l i c h 型( ( f 型) 吸附等温式是基于吸附质在多 相表面上的吸附建立的经验吸附平衡模式，对于包含主动运输的活性生物测定不 再适用。e n e i d a 等研究马尾藻类海草对c ，的吸附，采用l 型和f 型吸附模式拟 合，实验结果与预测结果的误差分别为3 和3 4 。由于实际体系的复杂性，经 典f 和t 型吸附模式已经不能满足要求，尤其是对多组分吸附体系，各离子之间 存在竞争吸附现象。因此，b u t l e r 和o c k r e n t 在经典l 型吸附模式的基础上， 发展了竞争吸附模式，又称为扩展l 型吸附模式，并将扩展f 型吸附模式应用多 组分吸附体系。a k s u 等应用扩展l 型和f 型吸附等温式描述了c u ”和c r “在藻 类c h l o r e l l av u l g a r i 上的吸附特性，并比较了这两种模式对实验数据的拟合效 果。结果表明在所研究的浓度范围内，扩展f 型吸附模式均能较好地模拟吸附实 验数据，而扩展l 型吸附模式数据与实验值出现较大的偏差。研究人员提出了基 于溶液中配位反应平衡理论的表面络合模式、离子交换模式和双位吸附模型，更 好地解释了多离子及酸度效应。 4 2 生物材料吸附无机铬的研究 目前，生物材料对铬( ) 的吸附研究已有报道，尹华等”从重金属污染的地 点采样，通过微生物培养、分离与筛选，获得一株对铬具有很强还原与吸附性能的 掷孢酵母，并对该菌株进行了吸附性能的研究。唐兰模等”1 对壳聚糖( c h t ) 吸附 溶液中微量铬( ) 的条件进行了研究，并通过紫外和红外光谱分析得出结论，壳 聚糖与c r z o 产的吸附作用主要是以氢键形式存在的静电引力。 但相对于铬( ) 的生物吸附研究而言，铬( ) 的研究较少，只有壳聚糖作为 吸附剂的报道，邢巍巍等呻1 发现壳聚糖对铬( ) 离子确实存在较强的化学吸附， 探索了通过i r 、u v 、s e m 等检测手段证实了铬( ) 离子与壳聚糖之间发生了配位 作用。 5 本课题的研究意义 近年来，微量元素与人体健康的关系越来越引起人们的重视，通常将日需要 量占人体重的0 0 1 的金属元素称为常量元素，低于此值的金属元素称为微量元 素，目前被世界卫生组织( w h o ) 确定的微量元素有1 4 种，包括铜、铁、铬、锌 等。随着医药、保健市场对微量元素需求的提高，各国对微量元素生物富集的研 究越来越加以重视。通过生物细胞对金属元素进行富集的途径包括表面沉积、生 物吸附、生物转化、被动扩散等，其中生物转化与生物吸附是主要途径，本研 究以啤酒酵母作为铬( m ) 生物转化与生物吸附的载体，探索酵母细胞生物转化的 机理及生物吸附的特点。 1 4 第二部分实验方法 1 实验材料 菌种为啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，普通酵母菌株t y 0 和富铬 酵母菌株t y - 3 由青岛啤酒厂宝鸡有限公司提供。将酵母菌株接种于麦芽汁培养 基中，2 8 振荡培养2 天，培养物经离心、洗涤、干燥，得酵母干粉。 2 实验方法 2 1 酵母的酶解破壁 称取一定量酵母干粉，无菌水洗涤两次，柠檬酸一磷酸缓冲液( c p b ) 洗涤一 次，用e d t a 和b 一巯基乙醇2 8 下预处理3 0 m i n ，4 0 0 0 r m i n 离心l o m i n ，沉淀 中加入1 蜗牛酶液适量，3 0 c 下振荡1 h 左右，镜检破碎情况，当有9 0 以上 菌体破裂，4 0 0 0 r m i n 离心l o m i n ，收集沉淀，进行下一步分离实验。 2 2 富铬酵母组分分离 2 2 1 富铬酵母r n a 的分离及纯度、含量测定 4 9 破碎细胞中加入l o m ls d s 缓冲液，混匀，倒入磨口具塞锥形瓶中，加入 等体积9 0 苯酚溶液，室温下剧烈振荡l o m i n ，冰浴中分层，4 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ， 吸出上清液，加入等体积氯仿一异戊醇( 2 4 ：1 ) ，剧烈振荡l o m i n ，4 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，吸出上清液，此操作重复多次，直至无中间层，加入2 倍体积9 5 冰乙醇，边加边搅拌，冰浴中放置过夜，4 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，沉淀用少许7 5 乙醇，9 5 乙醇，无水乙醇各洗一次，同上法离心，空气中干燥，得酵母r n a 啉1 。 r n a 纯度用紫外分光法测定，r n a 含量用地衣酚显色测定邮1 。 2 2 2 富铬酵母d n a 的分离及纯度、含量测定 0 5 9 破碎细胞放入i m l c t a b ( 6 5 c ) 中，加入2 0 ul b 巯基乙醇，摇匀后， 6 5 c 水浴中保温2 h ，冷却，加入等体积氯仿一异戊醇( 2 4 ：1 ) ，轻轻颠倒混匀， l o ，0 0 0 r m i n 离心l o m i n ，上清液转至另一离心管中，加入2 3 体积异戊醇，轻 轻颠倒，静置l o m i n ，l o ，0 0 0 r m i n 离心l o m i n ，将沉淀用7 0 乙醇洗涤2 次，得 酵母d n a 州。 d n a 纯度用紫外分光法测定，d n a 含量用二苯胺显色法测定。 2 2 3 富铬酵母蛋白质的分离及含量测定 2 9 破碎细胞中加入0 ，1 4 m o l ln a c l o 1 5 m o l le d t a 溶液5 m l ，4 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，重复一次，沉淀中加入0 1 4 m o l ln a c l o 1 5 m o l le d t a 溶液 2 5 m l ，再滴加2 5 s d s 溶液0 2 5 m l ，边加边搅拌，6 0 。c 保温l h ( 不停搅拌) ，加 入6 m o l ln a c l 溶液2 m e ，搅拌l o m i n ，加入等体积氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，剧 烈振荡2 0 r a i n ，4 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，取中间层依次用少量7 0 乙醇、9 5 乙醇、 无水乙醇，乙醚各洗一次，4 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，得酵母蛋白质呻1 。 蛋白质含量用考马斯亮兰染色法测定。 2 2 4 富铬酵母小分子、脂类、多糖的分离 5 9 破碎细胞在0 4 下，在l o 三氯乙酸中浸提过夜，5 0 0 0 9 离心l o m i n ， 取出上清液。得小分子样品，将沉淀用甲醇一乙醚( 1 ：1 ) 抽提4 h ，抽提液为 酵母脂类样品，将抽提残渣在3 7 c 下，用0 5 m o l l n a o h 浸提4 0 m i n ，冷却后加 冷三氯乙酸l o m l ，残渣在8 0 下，再用5 三氯乙酸抽提3 0 m i n ，取残渣加入9 0 苯酚，振荡2 0 m i n ，4 0 0 0 r m i n 离心l o m i n ，收集水相为酵母多糖。 2 2 5 普通酵母样品的分离和测定 普通酵母各样品的分离和测定方法同富铬酵母。 2 3 铬( ) 浓度的澜定 标准曲线的制作：精密称取一定量重铬酸钾，溶于重蒸水中，配成c r ( ) 浓 度为1 o g l 的标准铬母液，测定时将母液进行稀释，得到c r ( v i ) 浓度分别为 1 o m g l 、2 ( ) g 几至6 o 埘g l 的梯度溶液，进行铬浓度测定，制作标准曲线。 称量适量样品，置于5 0 m l 烧杯中，加入2 0 m l 5 0 h n 0 3 ，置电炉上缓慢加热 ( 2 0 0 3 0 0 1 3 ) ，消化至清亮，冷却后，定容至2 5 m l ，通过原子吸收分光光度计 进行铬浓度测定，同时作空白对照。测试条件：波长( ) 为3 5 7 9 r i m ，光谱带 宽为0 4 n m ，燃气流量为2 5 0 0 m l m i n ，灯电流为3 o m a ，负高压为3 4 4 5 0 v 。 2 4 铬( ) 的赋存形式测定 应用紫外一可见光谱仪在室温下对样品进行固体紫外光谱测试，扫描范围为 2 0 0 8 0 0 n ；应用傅里叶变抉红外光谱仪，在室温下采用k b r 压片进行红外测试， 扫描范围为5 0 0 3 5 0 0 c m - 1 。 2 5 生物吸附剂对铬( ) 的吸附 2 5 1 生物吸附剂的制各 1 6 向破碎啤酒酵母细胞中加入0 1 4 m o l ln a c l o 1 5 m o l le d t a 溶液5 m l ， 4 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，重复一次，沉淀中加入0 1 4 m o l hn a c l 一o 1 5 m o l le d t a 溶液2 5 m l ，再滴加2 5 $ d s 溶液0 2 5 m l ，边加边搅拌，6 0 保温l h ( 不停搅拌) ， 加入5 m o l ln a c i 溶液2 m l ，搅拌1 0 m i n ，加入等体积氯仿一异戊醇( 2 4 ：1 ) ，剧 烈振荡2 0 m i n ，4 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，取中间层依次用少量7 0 乙醇、9 5 乙醇、 无水乙醇，乙醚各洗一次，4 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，得酵母蛋白质，8 0 c 烘干、 粉碎，。过8 0 目筛，作为吸附剂。 2 5 2 吸附操作 准确称取一定量的生物吸附剂，进行不同吸附时间、不同溶液p h 值、不同 起始铬液浓度的吸附实验及正交吸附实验。 2 5 3 吸附量的计算 用原子吸收分光光度计分别测定吸附前后铬离子浓度，计算吸附量”“。 2 5 4 生物吸附特性测定 采用固体紫外光谱法洲，扫描范围为2 0 0 8 0 0 n m 。 3 仪器装置及试剂 红外光谱仪( e q u i n o x 5 5 ) ；原子吸收分光光度计( t a s 一9 8 6 ) ：紫外一可见光 谱仪( p e r k i n e l m e rl a m b d a1 7 ) ；冷冻离心机( h i m a cc r 2 2 g ) ；p h h i o o b 酸度 计；小型水浴箱：显微镜等，k b r ( 分析纯) 。 第三部分实验结果 1 铬( ) 在酵母细胞中的的分布 1 1 酵母的d n a 、r n a 和蛋白质提取率 由上述方法分离得到富铬酵母和普通酵母d n a 、r n a 和蛋白质，提取率= ( 分 离的酵母细胞d n a 、r n a 和蛋白质重量所用酵母的重量) 1 0 0 ，提取率结果见 表2 。 表2 富铬酵母和普通酵母的d n a ，r n a 和蛋白质提取率 t a b l e2e x t r a c t i n gr a t e so fd n a ，r n aa n dp r o t e i ni nc r r i c ha n d n o r m a lb r e w e r sy e a s t 从表2 结果可见，该分离方法适用于酵母的d n a 、r n a 和蛋白质的分离。两 种酵母的d n a 、r n a 和蛋白质提取率无明显差异。 1 2 酵母的d n a ，r n a 纯度 用紫外吸收法对提取的富铬酵母d n a ，r n a 进行纯度检测，用测得的九。 。、 。 ：。来判断样品的纯度。结果见表3 。 表3 富铬酵母d n a ，r n a 的纯度鉴定 t a b l e3i d e n t i f i c a t i o no fp u r i t yf o rd n aa n dr n ai nc r r i c hy e a s t 吸光度( a )富铬酵母普通酵母 a b s o r p t i o n c r - r i c hb r e w e r sy e a s t n o r m a lb r e w e r sy e a s t d mr n ad n a跳 2 嘶1 2 7 81 7 0 01 1 4 80 6 2 0 2 s o n m0 6 4 60 9 8 2 0 6 0 60 3 7 1 2 栅0 6 9 60 9 1 5 0 5 7 00 3 4 4 a m n m n m 1 9 8 1 7 31 8 9i 6 7 从d n a 和r n a 的 _ 。值显示，提取的核酸样品纯度较高，较少存在 蛋白质、酚类等杂物， 。 ：。小于2 0 ，说