（有机化学专业论文）磁性荧光纳米粒子分离家蝇gaba受体蛋白.pdf

上海师范大学硕士学位论文 摘要 昆虫g a b a 受体是农药的作用靶标，研究昆虫g a b a 受体蛋白的结构对开 发高效低毒的农药具有重要的指导意义。本文应用材料科学的最新研究成果制备 了磁性荧光纳米粒子，利用该粒子分离家蝇的神经细胞和生物体的g a b a 受体 蛋白质，并研究了家蝇神经细胞的形态、家蝇和小鼠g a b a 受体的分子量及其 生物学特征。 我们应用反向微乳法包裹荧光素r b 2 0 0 从而制备了磁性荧光纳米粒子，并 在磁性荧光纳米粒子表面修饰g a b a 配体。利用红外光谱、原子力显微镜、透 射电镜、振动样品磁强计、b e t 比表面分析仪对磁性荧光纳米粒子的理化性质 进行表征。以k 5 6 2 白血病细胞为靶细胞，检测磁性荧光纳米粒子的生物安全性。 结果显示，磁性荧光纳米粒子对k 5 6 2 细胞无毒性作用。 利用磁性荧光纳米粒子上的配体与家蝇神经细胞表面的g a b a 受体蛋白特 异性结合，在外加磁场下分离得到与磁性荧光纳米粒子复合物结合的家蝇的神经 细胞，荧光显微镜下观察到明显的神经细胞的轴突结构并与文献对照，证实其为 神经细胞。神经细胞裂解纯化得到g a b a 受体蛋白，利用s d s 聚丙烯酰胺凝胶 电泳测定其分子量。将家蝇g a b a 受体蛋白质的分子量与小鼠对比，s d s p a g e 结果表明家蝇与小鼠的g a b a 受体都有3 种不同的亚型。 本文的创新点在于利用磁性荧光纳米粒子复合物分离神经细胞和蛋白质。 关键词：磁性荧光纳米粒子，家蝇，g a b a 受体，神经细胞，蛋白质分离 上海师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t i n s e c tg a b ar e c e p t o ri sat a r g e tf o rp e s t i c i d e sa n di ti si n s t r u c t i v et os t u d yt h e s t r u c t u r eo fi n s e r tg a b a r e c e p t o rp r o t e i n st od e v e l o pe f f i c i e n tl o w - t o x i c i t yp e s t i c i d e s i nt h i sp a p e r , a c c o r d i n gt ot h el a t e s tr e s e a r c hi nm a t e r i a ls c i e n c e ，m a g n e t i cf l u o r e s c e l l a n o p a r t i c l e sw e r ep r e p a r e dt os e p a r a t eh o u s e f l yn e u r o nc e l l sa n do r g a n i s mg a b a r e c e p t o rp r o t e i n t h es h a r po fh o u s e f l yn e u r o nc e l l s 、t h ew e i g h to fh o u s e f l ya n d m o u s eg a b a r e c e p t o rp r o t e i na n dt h e i rb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sw e r er e s e a r c h e d m a g n e t i cf l u o r e s c en a n o p a r t i c l e sw e r ep r e p a r e db yr e v e r s em i c r o e m u l s i o na n d l i g a n dg a b aw a sm o d i f i e do nt h em a g n e t i cf l u o r e s c en a n o p a r t i c l e ss u r f a c e p h y s i c a l a n dc h e m i c a l p r o p e r t i e s o f m a g n e t i c f l u o r e s c e n a n o - p a r t i c l e s w e r e c h a r a c t e r i z e d b y i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y , a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y , t r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p y , v i b r a t i n gs a m p l em a g n e t o m e t e ra n db e ts u r f a c ea r e aa n a l y z e r l e u k e m i ak 5 6 2c e l l sa st a r g e tc e l l s ，t h eb i o l o g i c a ls a f e t yo fm a g n e t i cf l u o r e s c e n a n o - p a r t i c l e sw e r ed e t e c t e d ，t h er e s u l to fw h i c hs h o w e dt h a tm a g n e t i cf l u o r e s c e n a n o p a r t i c l e sw e r en ot o x i c i t yo nk 5 6 2c e l l s t h el i g a n do fm a g n e t i cf l u o r e s c en a n o p a r t i c l e sw e r eu s e dt os p e c i f i cc o u p l e d 、i t l lh o u s e f l yg a b a r e c e p t o rw h i c hw a so nt h es u r f a c eo fh o u s e f l yn e u r o nc e l l s ， h o u s e f l y n e u r o nc e l l sw h i c hw a sl a b e l e db ym a g n e t i cf l u o r e s c en a n o - p a r t i c l e c o m p l e x e sw e r es e p a r a t e du n d e rt h em a g n e t i cf i e l d ，t h ea x o ns t r u c t u r eo fn e u r o nc e l l s c a nb eo b s e r v e dc l e a r l yu n d e rt h ef l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ，w h i c hw a si d e n t i f i e da s n e u r o nc e l l sb yc o l l a t e dt h el i t e r a t u r e g a b ar e c e p t o rp r o t e i n sw e r eg a i n e da f t e r i s o l a t e dn e u r o nc e l l sa n dp u r i f i c a t i o na n dt h em o l e c u l a rw e i g h to fw h i c hw a s d e t e r m i n e db ys d s p a g e h o u s e f l yg a b a r e c e p t o rp r o t e i n ，c o m p a r e dw i t hm o u s e ， t h er e s u l t so fs d s p a g es h o w e dt h a tt h eh o u s e f l ya n dm o u s eg a b ar e c e p t o rb o t h h a v et h r e ek i n d so fd i f f e r e n ts u b u n i t s t h ei n n o v a t i o no ft h i sp a p e ri su s i n gm a g n e t i cf l u o r e s c en a n o p a r t i c l ec o m p l e x t os e p a r a t en e u r o nc e l la n dp r o t e i n k e yw o r d s ：m a g n e t i cf l u o r e s c en a n o p a r t i c l e s ，h o u s e f l y ( m u s c ad o m e s t i c a ) ，g a b a r e c e p t o r , n e u r o nc e l l s ，p r o t e i ns e p a r a t i o n 上海师范人学硕士学位论文 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：l 虱i 盈日期：洲。j d 7 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作一：i 司便新躲孑匀嘶眦节 上海师范人学硕士学位论文 第一章综述 一g a b a 与g a b a 受体 1 1g a b a 与g a b a 受体简介 丫氨基丁酸( g a b a ) 是一种主要的抑制性神经传递物质，广泛分布于动植物体 内。植物如豆属、参属、中草药等的种子、根、茎和组织液中都含有g a b a 。在 动物体内，g a b a 存在于脊椎动物的中枢神经系统( c n s ) 和昆虫的周缘神经系 统中，它由神经细胞末突触前膜释放，与突触后部存在的g a b a 受体结合后通过 开放氯离子通向细胞的通道，参与多种代谢活动，产生抑制性神经活动【l 】。 g a b a 有很强的生理活性，主要表现在以下几方面：( 1 ) 镇静神经、抗 焦虑。医学家已经证明g a b a 是中枢神经系统的抑制性传递物质，是脑组 织中最重要的神经递质之一。其作用是降低神经元活性，防止神经细胞过热， g a b a 能结合抗焦虑的脑受体并使之激活，然后与另外一些物质协同作用， 阻止与焦虑相关的信息抵达脑指示中枢；( 2 ) 降低血压。g a b a 能作用于脊 髓的血管运动中枢，有效促进血管扩张，达到降低血压的目的。( 3 ) 治疗疾 病。1 9 9 7 年，大熊诚太郎的研究表明g a b a 与某些疾病的形成有关，帕金 森病人脊髓中g a b a 的浓度较低，癫痫病患者脊髓液中的g a b a 浓度也低 于正常水平。日本大阪大学医学院的研究显示g a b a 对k u p p e r m a n 综合症 具有显著的改善效果。另外，神经组织中g a b a 的降低也与h u n t i n g t o n 疾 病、老年痴呆等神经衰败症的形成有关。( 4 ) 降低血氨。我国的临床医学和 日本的研究者认为，g a b a 能抑制谷氨酸的脱羧反应，使血氨降低。更多的 谷氨酸与氨结合生成尿素排出体外，以解除氨毒，从而增进肝机能。( 5 ) 提 高脑活力。g a b a 能进入脑内三羧酸循环，促进脑细胞代谢，同时还能提高 葡萄糖代谢时葡萄糖磷酸酯酶的活性，增加乙酰胆碱的生成，扩张血管增加 血流量，并降低血氨，促进大脑的新陈代谢，恢复脑细胞功能。 g a b a 的传递作用由g a b a 受体介导。g a b a 受体不仅是农药林丹，硫丹， 阿维菌素和氟虫腈等杀虫剂的靶标【2 司，还是人类治疗癫痫、精神分裂症、帕金森 氏症和酒精中毒等疾病的药物作用靶标【4 捌，因此，g a b a 受体的研究受到了全世 界广大研究人员的高度关注。 上海师范大学硕士学位论文 1 2 哺乳动物g a b a 受体的分类与结构 近年来，通过大量科学家的努力，人们对哺乳动物g a b a 受体的研究已经比 较详细了。哺乳动物的g a b a 受体可分为离子型g a b a 受体( g a b a a 受体和 g a b a c 受体) 和代谢型g a b a 受体( g a b a b 受体) 1 6 1 0 而与药物作用相关的受 体是g a b a 受体。g a b a a 受体广泛分布于c n s 和脊髓叶1 ，并与一个内在的氧 离子通道相耦联。哺乳动物g a b a 一受体是由不同亚基结合形成的跨膜五聚体糖 蛋白。它由分子量为5 0 - 6 0 k d a 的五个不同的亚基组成，每个亚基在n 端由一个 外部二半胱氨酸环和4 个跨膜螺旋( m 1 一m 4 ) 组成( 图l - 1 ) l 。i ：1 前已鉴定了 哺乳动物大脑中g a b a a 类受体亚基共有1 8 种：包括v 1 6 、8 1 4 、7 1 4 、6 、0 、 。多种亚基组合原则上可以建立无数个功能受体。通过比较其氨基酸序列可知各 亚基之间有3 5 一4 2 的同源性，而各亚型之间的同源性则高达7 2 l 。g a b a c 受体也是一种类同的受体氯离子通道载体复合物，它是由p 亚基组成的同源多聚 体，主要存在于脊椎动物的视网膜中9 。1 “。而g a b a 。受体通过1 3 蛋白与第二信 使相连，负责调控体内c a m p 的产生。 图1 - lg a b a n 受体模型示意圈 f i g i ls c h e m a t i c i l l u s t r a t i o n o f g a b a ar e c e p t o r g a b a 受体和g a b a c 受体同属于配体一门控离于通道超家族，这类受体还 包括烟碱型乙酰胆碱受体，5 一羟色胺受体和甘氨酸受体1 2 - 1 3 。这一家族成员的 上海师范大学硕士学位论文 结构极为相似，是典型的配体门控离子通道受体。它们由五个蛋白质亚基形成一 个封闭的通道，每个亚基实际上是一个缠绕细胞膜4 圈的氨基酸链。在细胞外的 长链术端是n 端，用于调节g a b a 与通道间的相互作用，链的中部是一个大的 细胞内氨基酸环，有4 个可以磷酸化的位点【1 4 j 。 g a b a a 受体和g a b a c 受体在生化、药理和生理上的性质都存在差异。 g a b a a 受体可选择性的与荷苞牡丹碱结合产生抑制性的超极化作用，使神经细 胞膜的氯离子导通能力增强。同时，g a b a a 受体的作用还可以被苯二氮卓类，巴 比妥酸类或者神经活性甾醇类调节【l5 1 。相反，g a b a c 受体不被荷苞牡丹碱所阻 塞，对苯二氮卓类、巴比妥酸类或者神经活性甾醇类不敏感，对4 氨基巴豆酸敏 感。g a b a c 受体的活性受二价阳离子( 如z n 2 + ) 、多巴胺和细胞内的第二信号系 统调控【1 6 。1 3 1 。 g a b a b 受体通过g 蛋白于第二信使相连，负责调控体内c a m p 的产生。此 外，分子克隆技术表明g a b a b 受体具有7 个跨膜结构域【1 9 1 ( 如图1 2 所示) 。已 经有3 个主要的g a b a b 受体亚型被克隆出来，g a b a b r g a b a b r l b 和 g a b a b r 2 ，这些受体比大多数g 蛋白偶联受体都大，每个受体由8 5 0 9 6 0 个残基 组成【2 0 1 。g a b a b 受体在前突触和后突触被表达出来，像别的g i 1 i n k e d 受体一样， 它可以打开k + 离子通道，减小c a ：+ 的导通性，从而抑制腺苷酸环化酶活性。与 g a b a a 受体相比，后突触g a b a b 受体被激动后，对神经原产生较慢的、持续时 间更长的抑制，这种效果很大程度上是由于向内的k + 通道的改变而产生的。 g a b a b 受体有两种异构形式，g a b a b ，a 和g a b a b b 。最近的研究表明，g a b a b 受体通过形成二聚体表现其功能2 1 2 4 1 。 上海师范人学硕士学位论文 图1 - 2g a b a b 受体异源二二聚体模式图，7 次跨膜的基通过c 末端相连形成一聚体 f i g , i - 2 r e p r e s e n t a t i o no f t h e g a b a br e c e p t o rh e t e z o d i m e r w h i c h i s c o m p o s e do f t w o ， s c v e n t r a a s m e m b r a n e - s p a n n i n g u n i t s t h a t a r e l i n k e d b y t h e i r c a r b o x y l - t e r m i n i 1 3g a b a 受体药物的主要作用位点 科学家通过电生理实验，同位素标记以及分子生物学方法已经确定哺乳动物 g a b a 受体主要有5 个配体结合位点，分别是g a b a 位点、b z 位点、p t x 位 点、巴比妥酸盐位点和类固醇类位点吲( 如图1 3 所示) 。这些结合部位调节受体 对g a b a 刺激的反应，是医药和农药领域研究的热点。g a b a 直接负责氯离子通 道开放，各种激动剂与这个部位结合，并诱发类似于g a b a 样的反应。荷包牡丹 碱可与g a b a 位点结合，竞争性地抑制g a b a 诱导的氯离子电流口 。 口 上海师范_ = l ；= 学硕士学位论文 g a b a b e n z o d i a z e p i n e s 图1 - 3 g a b a 受体配体结合位点示意图 f b l - 3s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f a g a b a ar e c e p t o r w i t hs o m e o f t h e l i g a n db i n d i n gs i t e s 巴比妥类i “】、神经类固醇i 哪队及酒精划可能作用在t m 区域；巴比妥盐可增 强g a b a 和苯二氮卓类药物与它们的结合部位结合，增加通道的开放时间和氯离 子的流入量。z n 2 + 、l 一、木防己苦毒素( p i c t o t o x i n i n ) 及t b p s 则直接作用在 氯离子通道。p t x 和p 5 5 v r b p s 非竞争性地抑制g a b a 门控离子通道。p t x 作用 位点也能识别杀虫剂和驱虫剂，包括环戊二烯类杀虫剂、林丹、狄氏剂、阿维菌 素、苯基吡唑类化合物、p t x 以及e b o b 。这一位点也被称为惊厥剂识别位点或 离于通道位点。神经活性类固醇通过与g a b a 受体相互作用而快速改变神经元兴 奋性，调节其介导的突触抑制功能，引发抑制或兴奋性效应的变化。 i a 昆虫g a b a 受体 与哺乳动物g a b a 受体的研究现状相比，人们对昆虫g a b a 受体的研究远 远落后于对哺乳动物g a b a 受体的研究。昆虫的g a b a 受体主要存在与中枢神 经和末梢神经系统中。昆虫的g a b a 受体是否与哺乳动物的g a b a 受体一样也 是五聚体跨膜结构目前还不清楚。除了果蝇的l c c h 3 亚基外已知的昆虫g a b a 受体亚基不能归于脊椎动物的任何一类g a b a 亚基口”。因此对昆虫而言，g a b a 受体并不能称为g a b a 一受体。对昆虫g a b a 受体的研究主要以果蝇为研究材料， 上海师范人学硕士学位论文 到目前为止，科学家只鉴定了果蝇g a b a 受体的三个亚基：f f r e n c h c o n s t a n t 从 果蝇中克隆出r d l ( r e s i s t a n c et od i e l d r i n ) 亚基【3 2 1 ，h e n d e r s o n 从果蝇基因组文库 中筛选出l c c h 3 ( 1 i g a n d g a t e dc h l o r i d ec h a n n e lh o m o l o g u e 3 ) 亚基t 3 3 1 ，r o b e r t 从果蝇 头c d n a 文库中分离出g r d ( g a b a a n d g l y c i n e l i k er e c e p t o ro f d r o s o p h i l a ) 亚基 1 3 4 1 。在这三个亚基中，r d l 亚基研究的最多。只有r d l 亚基形成了功能性的g a b a 门控阴离子通道。r d l 除了作为阴离子选择性配体门控离子通道受体，它还可以 作为昆虫g a b a 受体的模型，因为它是许多重要杀虫剂的靶标。r i c h a r d 将果蝇 r d l 亚基基因转入爪蟾卵母细胞中，并成功的进行了表达。结果表明r d l 亚基 t m 2 中3 0 2 位的a l a 突变为s e r 是果蝇对狄氏剂产生抗性的主要原斟”】。 1 5g a b a 受体的分离方法 哺乳动物g a b a a 受体的分离要追溯到上个世纪8 0 年代。1 9 8 2 年e r w i ns i g e l 等人用苯二氮卓类配体r 0 7 1 9 8 6 1 作为固定相，用亲和层析的方法首先从牛脑中 分离出g a b a a 受体【3 6 】，1 9 8 3 年e r w i n 等从牛脑皮层中纯化出g a b a a 受体，并 用s d s p a g e 分离出a 、p 亚基，得出其分子量【3 7 1 。1 9 8 7 年g r e g o r y 等人发明了 大规模纯化受体的方法，用新的配体1 0 1 2 s 作为固定相，使g a b a a 受体富集了 4 5 6 7 倍，总回收率达到了9 0 以上【3 8 1 。该分离方法样品需要经过高速离心机的梯 度离心预处理，分离步骤大体上需要经过样品处理、亲和柱制备、亲和层析、离 子交换层析等步骤，并利用同位素追踪配体来鉴定所得蛋白质是否为g a b a 受体 蛋白。配体r 0 7 1 9 8 6 1 ，1 0 1 2 s 的结构见图1 - 4 。 上海师范人学硕士学位论文 ooo 000 一n 一卜哗h 卜。一c r + l h 2 f h 2 a k o 7 - 1 9 8 6 ll u l 2 一s 图l - 4 配体r 0 7 1 9 8 6 1 ，1 0 1 2 s 的结构 f i g1 - 4t h es t r u c t u r eo f l i g a n dr 0 7 1 9 8 6 1a n d1 0 1 2 - - s 1 6 基于g a b a 受体的农药研究进展 g a b a a 受体的抑n ? 0 j 能抑制g a b a 活化的氯离子电流。具体来说，g a b a 受体抑制剂可分为竞争性抑制剂和非竞争性抑制剂，它们之间的差别就在于是否 与g a b a 的结合位点相同。与g a b a 的结合位点相同的是竞争性抑制剂，如荷 包牡丹碱3 叫0 1 ；与g a b a 的结合位点不同的是非竞争性抑制剂，如木防己苦毒素 【4 1 1 。目前，非竞争性抑制剂是杀虫剂研究的热点之一。 1 9 8 7 年e l d e f r a w iat 等通过电生理及分子生物学等方法证实了杀虫剂林丹 的作用靶标为g a b a a 受体 4 2 1 ，从此展开了农药领域g a b a a 受体抑制剂的研究。 由于哺乳动物和昆虫g a b a 受体的结构上的差异，导致许多类结构不同的化合物 仅对昆虫的g a b a 受体具有高度的亲和力而先后被开发为杀虫剂。例如早期使用 的六氯环烷烃( 林丹) 4 3 1 、多氯环戊二烯( 硫丹、七氯) 和多氯坎烷( 毒杀芬) m 】，当前大量使用的氟虫腈以及一些类农药的化合物( 苦味毒、b i d n 、e b o b 、 二噻烷等) 。其中氟虫腈是第一个成功开发的昆虫g a b a a 受体非竞争性抑制剂， 氟虫腈的化学名为4 - 5 氨基1 ( 2 ，6 二氯0 l ，q t ，0 【三氟p 甲苯基) 一4 一三氟甲基一亚硫酰 基吡唑3 碳化腈，其分子式为c 1 2 h 4 c 1 2 f 6 n 4 0 s ，结构如图1 5 所示。氟虫腈是苯 上海师范大学硕士学位论文 基吡唑类新型杀虫剂中的一员，发现它通过作用于g a b a a 受体而干扰氯离子的 通道。这种干扰破坏正常中枢神经系统的活性并在足够剂量的情况下造成死亡。 这些农药都是以g a b a a 受体为靶标，是g a b a a 受体的非竞争性抑制剂。目前， 大部分的研究工作是以氟虫腈等分子结构作为模版，通过分子对接设计并合成新 的化合物，以求找到具有高效，低毒，高选择性的农药h 6 4 7 1 。 c l f 3 c c f 3 图1 5 氟虫腈的分子结构 f i g1 - 5t h em o l e c u l a rs t m c t u r eo ff i p r o n i l 1 7 昆虫g a b a 受体的研究前景 农药是用来影响和调控有害生物生长发育或繁殖的特殊功能分子。平均 每年全世界有1 0 亿吨左右的庄稼毁灭于病虫害，由于病虫害造成的庄稼减 产幅度达2 0 3 0 。因此，农药白发明以来就在农业发展史中扮演重要角 色。直到今天，农药的作用仍然不可替代。但是长期以来，农药的毒性与残 留却往往成为人类的杀手，它不仅破坏神态环境还时刻威胁着我们的健康。 我们常常能在报刊，网络等媒体上看到剧毒有机磷等农药中毒的新闻。因此， 对农药的革新已经到了刻不容缓的地步。我们把具有一下特征的农药：对 人类安全；对环境生态友好；超低用量；高选择性；作用模式及代谢途 径清晰；绿色制造过程；高技术内涵的农药称为“绿色农药 。开发绿色农 药对全世界来说具有重要的意义。但是目前我国毒性较低的“绿色”农药在农药 市场中所占比重很小，仅为2 3 ，而传统化学农药的使用量占9 0 以上。目 前研究表明，不少农药如硫丹、林丹等有机氯类，以及氟虫腈和阿维菌素等杀 虫剂都是以g a b a 受体为靶标的。但由于昆虫g a b a 受体的组成及结构的未 知，使得对该类农药分子的设计与选择性筛选遭遇瓶颈。所以，准确知道昆虫 上海师范人学硕士学位论文 g a b a 受体的亚基种类、数目、组装方式及其空间立体结构，对更确切地了解农 药对g a b a 受体的作用位点，为更合理的设计特异性分子以至开发无公害的高选 择性农药具有重要的意义。 上海师范人学硕士学位论文 二磁性荧光纳米粒子在生物学中的应用 3 1 纳米技术与生物纳米技术 2 0 世纪8 0 年代末9 0 年代初，纳米技术作为一门新兴的技术逐步建立并在 2 1 世纪得到了迅速发展。纳米技术与生物技术、信息技术一起被看作是2 1 世纪 的三大关键技术【4 8 】。纳米技术它是在纳米尺度( 1 1 0 0n m ) 上研究原子、分子 和其他类型物质的运动、变化的特性以及利用单个原子、分子制造新物质的高新 技术，其应用前景贯穿了从以原子、分子为主体的微观领域、微观与宏观的过渡 区( 纳米世界) 以及人类活动的宏观世界。因此，纳米技术作为一门崭新的科学 技术得到了学术界的高度关注。与此同时，纳米尺度上的多学科交叉也展现了纳 米技术巨大的生命力，迅速成为一个有广泛学科内容和潜在应用前景的研究领 域。1 9 9 3 年，国际纳米科技指导委员会将纳米技术划分为6 个分支：纳米电子 学、纳米物理学、纳米化学、纳米加工学、纳米计量学和纳米生物学【4 9 1 。 生物纳米技术作为纳米技术的一个重要分支，是以生命体为研究对象，运用 纳米技术的理论与方法，在传统和现代生物技术的基础上，一方面设计合成功能 性纳米粒子，并对生物、医学及相关学科中的现象、过程与机理进行探索企业技 术开发和研究；另一方面利用生命过程中特有纳米特性如生物中的源纳米颗粒、 细胞膜中的纳米通道结构以及特异的纳米功能性生物分子来开展生物、化学过程 与现象的研究【5 0 1 。它将纳米微型构造技术和现代生物技术二者的长处有机地融合 起来，为在分子、细胞和亚细胞水平上研究生物分子的行为以及疾病的机理研究、 诊断和治疗等方面提供了全新的材料、技术和方法。 3 2 磁性荧光纳米粒子 磁性荧光纳米粒子不仅具有良好的超顺磁性和表面易功能化等特点，而且利 用荧光可以定向识别并标记目标物质而十分引人注意。它可以复合抗体、抗原或 免疫球蛋白，标记细胞。通过与欲分离的目标物相结合，在磁场的作用下进行磁 分离。磁性纳米粒子直接包裹荧光素的制备工艺比较简单，但是制备出的磁性荧 光纳米粒子粒径小、比表面积大、在溶液中易发生团聚。并且由于磁性荧光纳米 粒子多用于生物医学，对其生物相容性也有一定的要求。如何解决团聚问题、提高 生物相容性，也是荧光磁性微球制备面临的一个重要问题。在生物学上应用的磁性 上海师范大学硕士学位论文 荧光纳米粒子，一般由功能性内核、可化学修饰的外壳以及修饰在外壳上的功能 团构成。外壳材料有多种，比较常见的是二氧化硅、琼脂糖、葡聚糖等，他们具 有易于进行修饰的优点。壳表面可以修饰核酸、抗原、抗体、配体等，使核壳生 物纳米颗粒对相应的研究对象具有特异性识别能力和亲和力刚【5 2 1 。其中，二氧化 硅微球5 3 】化学稳定性好，表面有大量羟基可以连接新的官能基团，具有良好的生 物相容性，可以考虑将磁性纳米粒子和荧光素同时包埋在二氧化硅里形成磁性纳 米荧光粒子【5 6 1 。 3 2 1 磁性纳米粒子 磁性材料以其优越的物理特性，在生物医学领域具有广泛的应用前景。y 三 氧化二铁、四氧化三铁、铁钴合金是最为常用的磁性材料。由于磁性纳米粒子粒 径小，比表面积大，所以便于与目标分子偶联；又因为粒子具有超顺磁性，所以 在外磁场作用下固液分离极为简单。而s i 0 2 可以屏蔽磁性粒子之间的偶极相互作 用，阻止粒子团聚；具有良好的生物相容性、亲水性和稳定性，是一种很好的外 壳材料。 3 2 2 荧光纳米粒子 在一定条件下，许多物质都可以发出荧光，但不是都可以用作纳米粒子的荧 光素。一种好的荧光素必须具备安全无毒；荧光强度高，稳定；荧光色泽与背景 色泽对比鲜明；标记后不破坏生物体活性；标记方法简单等特点。目前常用的荧 光素有：无机配合物、异硫氰酸荧光素( f i t c ) 、四乙基罗丹明( i 也2 0 0 ) 。无机 配合物通常由i i 趔5 7 1 或i i i v 族5 8 1 元素组成，它们具有优良的光谱特征和光化 学稳定性。f i t c 是一种黄色或橙黄色粉末，易溶于水、乙醇等溶剂。最大吸收波 长4 9 0 4 9 5 n m ，最大发射波长5 2 0 5 3 0 n m ，呈现明亮的黄绿色荧光。它有两种异 构体，其中异构体i 型( 如图1 6 ) 在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面 都更优良。在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要 优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。r b 2 0 0 为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精，丙酮等有机溶剂。化学性质稳定，最大 吸收波长为5 7 0 n m ，最大发射波长为5 9 5 6 0 0 n m ，呈橘红色荧光。其结构如图1 7 所示。 上海师范人学硕十学位论文 i 型 一。 图1 - 6f i t c 的分子结构 f i g 1 - 6t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo f o ff i t c i i 型 图l - 7r b 2 0 0 的分子结构 f i g 1 - 7t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo f o fr b 2 0 0 3 2 3 磁性荧光纳米粒子的制各 制备磁性荧光纳米粒子的方法有很多，常见的有：化学共沉淀法、微乳液法、 溶胶一凝胶法、水热法等。其中，微乳液法是2 0 世纪8 0 年代发展起来的一种制 备纳米微粒的方法。由于微乳液法制备的纳米粒子表面包覆了表面活性剂，粒子 间不易团聚，所以该方法被广泛应用于制备无机纳米功能材料【5 9 j 。在微乳体系中， 用来制备纳米粒子的体系一般是w o 体系，该体系由有机溶剂、水、表面活性剂、 助活性剂四个组分组成。其中常用的溶剂为c 6 - c 8 的直链烷烃和环烷烃；表面活 性剂如：琥珀酸2 一乙基己基磺酸钠、s d s 、c t a b 、t r i t o n l 0 0 等；助表面活性剂 一般为c 5 c 8 的脂肪酸。d o n gk e ey i 等【6 0 】率先采用反相微乳液法将磁性纳米粒 子和荧光素同时包埋在二氧化硅壳层内，其制备示意图如图1 8 所示。它们选用 环己烷作有机溶剂、聚氧乙烯酚醚作表面活性剂形成w o 形乳液。将一定浓度的 磁流体和荧光素倒入乳液中并在碱性环境中搅拌，直到生成透明棕色的微乳液后 ? 上海师范大学硕+ 学位论文 善黪三蕊j j 蕊、墓萋爹： e 1 镬：乏：母童：一霉；擎 寥jr 一 _ ，。 上海师范人学硕士学位论文 3 3 2 细胞分离 磁性纳米粒子作为不溶性载体，在其表面接上具有生物活性的吸附剂或其它 配体( 如抗体、外源凝结素等) ，利用它们与目标细胞的特异性结合原理，能在外 磁场的作用下将细胞分类、分离。f r i e d 等6 9 j 娴p o l y c l o n a la n t i f a b 抗体修饰的磁 性微球成功地对人体c d 4 ，c d 8 ，c d l 9 ，c d 3 4 等细胞进行了分离，分离效率达 9 9 9 以上。但不是所有的磁性纳米粒子都适合细胞分离。u g e l s t a d l 7 0 1 认为磁性纳 米粒子用于细胞分离需考虑以下几个关键因素：在细胞分离介质中不凝结、具有 灵敏的磁响应性、不与非特定细胞结合、能快速、彻底分离、最低程度的吞噬细 胞。 3 3 3 核酸分离 磁性纳米粒子同样可以用于d n a 、r n a 的分离与纯化。传统的核酸分离技术 有超离心密度梯度技术和凝胶电泳等。如目前实验室纯化质粒d n a 最常用的吡啶 溴红一氯化艳密度梯度平衡超离心法，分析和提纯r n a 并f l d n a 的琼脂糖凝胶电泳和 聚丙烯酞胺凝胶电泳等，这些纯化方法步骤繁杂、费时长、收率低。磁性微球分 离核酸时，基于碱基配对原则，通过偶合与目标核酸碱基互补的一段引物链而达 到分离目标核酸的目的，这种分离方法简单、快速、选择性高。如将无核酶的 o l i g o ( d t ) 2 0 2 5 共价偶联于磁粒上，基于r n a 的p o l y a 尾巴与之相配对的原理，使 m r n a 结合于磁粒上，通过外加磁场将携带有m r n a 的磁粒与体系中的杂质分离， 最后用d e p c 处理的水或缓冲液即可将m r n a 从磁粒上洗脱下来。该法可快速、高 收率、便利地从真核细胞总r n a 或从动物组织、细胞和植物的粗裂解液中分离纯 化m r n a 7 1 。7 2 1 ，甚至还可以从磁粒分选出的细胞或石蜡包埋的组织中得到较纯的 m r n a 7 3 1 。 3 3 4 蛋白质的分离与纯化 以磁性纳米粒子为固相介质，对蛋白质进行提纯是一项新兴的蛋白分离技 术。目前已经成功地对溶胞产物、血浆、原生质和腹水中的各种蛋白质进行了分 离和纯化。传统的蛋白质分离方法如盐析、有机溶剂沉淀、膜分离技术、离子交 换技术和层析技术等，通过改变p h 值、温度、离子强度、介电常数等因素来达到 分离的目的，分离过程复杂，而且目标蛋白质的损失大。而蛋白质的磁分离是通 上海师范大学硕士学位论文 过对磁性微球表面的改性，共价结合能被目标蛋白质识别和可逆结合的配基，然 后进行目标蛋白质的分离。在磁分离过程中，将磁性微球直接放入含有目标蛋白 质的混合溶液中，目标蛋白质与磁性微球紧密结合，然后利用外部磁场进行分离。 整个分离过程不需对混合溶液的p h 值、温度、离子强度和介电常数进行调整，从 而避免了传统分离过程中蛋白质的损失。与传统分离方法相比较，蛋白质的磁分 离技术具有快速、高纯、高收率等优点。y u c h e nl e e 、s u e h w al i n 等利用磁性 纳米粒子从细胞中分离了膜蛋白【7 4 1 。 3 4 磁性荧光纳米粒子的应用前景 磁性荧光纳米粒子是一种新型的纳米材料，而传感器是纳米材料可能利用的 最有前途的领域之一。纳米技术的介入为生物传感器的发展提供了无穷的想象空 间。总的说来，磁性荧光纳米粒子可以广泛地应用于酶的固定，信号的识别、检 测和放大，待测物质的富集、浓缩、分离，靶向给药等领域。其中，靶向给药能 减少药物的使用剂量，增强药物对把组织定位的特异性，提高疗效并减小毒副作 用。f e 3 0 4 就是很好的一种靶向给药的载体f 7 5 】- 【7 刀，研究证明f e 3 0 4 纳米粒子能通过 人体的脾脏和肝脏自然排泄。 由于纳米结构有着优异的化学和物理性能，有着极大的比表面积，这有利于 提高对敏感分子的吸附能力，并能提高生化反应的速度，因此越来越多的研究者 把磁性荧光纳米粒子作为生物学的研究工具。此外，利用磁性荧光纳米粒子独特 的性质，可以制作全新的生物传感器。目前国内外已有很多学者对基于磁性纳米 粒子的生物传感器应用与开发进行了大量的理论和实践研究，并取得了突破性的 进展，充分显示了磁性纳米粒子作为新型材料的应用前景。尽管磁性纳米粒子已 经能产业化生产，但是其相关理论还尚不完善，给科研工作带来了一定的困难， 但我们相信，随着制备和纯化工艺的改进，磁性纳米粒子必定将为生物学的发展 开创更广阔的前景。 上海师范大学硕士学位论文 3 1 课题的提出 三课题的提出和主要研究内容 为研究昆虫g a b a 受体蛋白的亚基种类、数目、组装方式及其空间立体结构， 对更确切地了解农药对g a b a 受体的作用位点，为更合理的设计特异性分子以至 开发无公害的高选择性农药提供理论基础，本文拟利用磁分离的方法，利用修饰 了配体的磁性荧光纳米粒子标记表面有g a b a 受体的家蝇的神经细胞，从而分离 家蝇的g a b a 受体蛋白。 3 2 研究内容和方法 本文拟利用反向微乳法制备磁性荧光纳米粒子，并对其进行表面修饰得到磁 性荧光纳米粒子复合物m n f p g a b a 。 利用红外光谱、原子力显微镜、透射电镜、振动样品磁强计、b e t 比表面分 析仪对磁性荧光纳米粒子的理化性质进行表征。 以k 5 6 2 白血病细胞为靶细胞，检验磁性荧光纳米粒子对细胞的毒性作用。 荧光显微镜下观察分离得到的表面带有g a b a 受体的家蝇的神经细胞的形 态。 对比家蝇与小鼠g a b a 受体的分子量。 上海师范大学硕+ 学位论文 第二章磁性荧光纳米粒子复合物的制备、表征及毒性分析 0 前言 上世纪6 0 年代末九十年代初，一门新兴的技术纳米技术逐步建立起来 并在2 1 世纪得到了迅速发展。在现代科学中，纳米材料是最重要的研究和开发 的前沿阵地之一。纳米材料因其独特的大小、物理性质和大的比表面积等特点， 近年来成为广大科学家研究的热点。而生物纳米技术作为纳米技术的一个重要分 支，以生命体为研究对象，运用纳米技术的理论与方法，在传统和现代生物技术 的基础上，一方面设计制备功能性纳米粒子，并对生物、医学及相关学科中的现 象、过程与机理进行探索企业技术丌发和研究；另一方面利用生命过程中特有纳 米特性如生物中的源纳米颗粒、细胞膜中的纳米通道结构以及特异的纳米功能性 生物分子来开展生物、化学过程与现象的研究。 在所有材料中，磁性粒子因其独特的磁相应性而引起了更广泛的关注，在生 物医学领域具有广泛的应用前景。y 三氧化二铁、四氧化三铁、铁钴合金是最为 常用的磁性材料。由于磁性纳米粒子粒径小，比表面积大，所以便于与目标分子 偶联；又因为粒子具有超顺磁性，所以在外磁场作用下固液分离极为简单，是很 好的分离纯化工具。 荧光标记作为一种很好的示踪工具，能很好得跟踪目标分子的去向。目前荧 光标记的主要荧光素为异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白等。这些荧光素荧光 强度强，化学性质稳定，是很好的示踪材料。 本章主要介绍利用反向微乳法，用s i 0 2 包裹荧光素r b 2 0 0 和y - f e 2 0 3 ，合成 磁性荧光纳米粒子。通过对磁性纳米粒子表面进行氨基修饰并连接配体g a b a ， 以满足分离g a b a 受体的需要。利用红外光谱跟踪粒子的制备过程。合成的磁性 荧光纳米粒子通过原子力学显微镜，透射电镜，振动样品磁强计，b e t 比表面分 析仪等对其理化性质进行表征，并以k 5 6 2 细胞为靶细胞，m t t 法检测其对生物 体的毒性作用。 上海师范大学硕士学位论文 l 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 药品试剂 ( 1 ) r p m i 一1 6 4 0 ：g i b c o 公司产品，用双蒸水按包装说明配置，青霉素、链霉 素各1 0 0 u m l ，滤菌后4 保存。 ( 2 ) 胎牛血清( f b s ) ：杭州四季青生物工程材料有限公司产品。产品经5 6 c ， 3 0 m i n 灭活后分装，- 2