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浙江大学硕l ：毕业论文 高产酒率酿酒酵母单倍体的分离与杂交育种 摘要 本文在筛选获得一批酒精发酵力较强的二倍体酿酒酵母( s a c c h r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 菌株的基础上，优化产孢条件，应用筛选获得的高产酒精的单倍体菌 株，经杂交育种构建高产酿酒酵母菌株。 以二倍体菌株z j d 3 3 、z j d 3 - 4 、z j d 3 7 、z j d 3 9 和z j d 3 1 1 ( 称为z j d 3 系 列) 及非整倍体菌株c 1 9 为实验菌株，经对产孢培养基的优选，确认m c c l a r y 产 孢培养基为适宜的高产孢率培养基。在该培养基上经2 5 、7 天培养，酿酒酵母 的产孢率可达到4 7 。对刁d 3 系列二倍体菌株进行单倍体分离，获得单倍体7 l 株。对筛选所得单倍体菌株，以及实验室原有单倍体菌株c 3 6 、c 3 6 - 8 、c 3 6 - 9 进行 交配型和发酵性能测定，交配型为a 型的单倍体与交配型为a 的单倍体数目差异较 大。得交配型a 的单倍体菌株3 0 株，交配型a 的单倍体菌株1 8 株。从中筛选获得发 酵性能较强的单倍体菌株4 株，其中1 株为a 型，3 株为伍型，发酵性能最强的z s 5 菌株其同等条件下酒精发酵后的酒度高出二倍体亲株4 5 。 以得到的4 株强发酵菌株和单倍体菌株c 3 6 、c 3 6 8 、c 3 6 - 9 以及非整倍体菌株 c 1 9 为杂交亲株，分别进行群体杂交，发现不同交配型单倍体混合2 h 后开始出现 哑铃型细胞，平板分离培养4 8 h 后，经鉴定共获得杂合子1 2 4 株，经酒精发酵测验， 从中筛选获得发酵性能优良的酵母菌株6 株。结果表明，9 5 以上的杂合子酒精 发酵性能优于杂交亲株，最优者比杂交单倍体亲株提高1 7 7 ，比原始二倍体菌 株高1 5 5 。经杂交育种与重复酒精发酵测验，最终确认z j l 、z j 一2 、z j 3 、z j - 4 、 z j 5 、z i 6 等6 株高产酒精的菌株，为进一步选育构建超级工程菌株奠定了扎实基 础。 关键词：酿酒酵母，单倍体，杂交育种，杂合子，高产酒率 浙江大学硕l 毕业论文 s t u d y o ns e p a r a t i o no fh a p l o i d sf r o m d i p l o i dc e l l so f s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ea n d h y b r i d i z a t i o nb r e e d i n g o fs t r a i n sw i t hh i g he t h a n o lp r o d u c t i o n a b s t r a c t o nt h eb a s i so ft h ew o r kt h a tw eh a v eg o tag r o u po fh i 曲e t h a n o lp r o d u c t i o n d i p l o i da n dh a p l o i ds a c c h a r o m y c e s c e r e v l s i a es t r a i n s ，i no r d e rt oi m p r o v et h ee t h a n o l f e r m e n t a t i o ne a p a c i t ya n ds e l e c th i 【g h e re t h a n o lp r o d u c t i o nn 蹦s t r a i n st h a nt h e m ，w e s l ：】f e e ne l i t es t r a i n sf o re t h a n o lf e r m e n t a t i o nb ys p o r es e p a r a t i o na n dh y b d d i z a t i o n b r e e d i n g d i p l o i ds a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e s t r a i l r l sz j d 3 3 、z j d 3 4 、z j d 3 - 7 、 z j d 3 - 9a n dz j d 3 1 1 ( z j d 3 s e r i e s ) , h a p l o i ds t r a i n se 3 6 、c 3 6 - 8 、e 3 6 - 9a n da n e n p l o i d s t r a i nc 1 9w e r eu s e df o ri n v e s t i g a t i n g f i r s t l y , c h o o s et h eo p t i m u ms p o m l a t i o nm e d i u m a i d e r7d a y so f g r o w t ho nt h e m c c l a r ym e d i u mt u b e sa t2 5 r e a c h e dam a x i m u ms p o r u l a t i o nr a t eo f 4 7 w eg o t 7 1h a p l o i ds t r a i n sa f t e rs p o r u l a f i o no f z j d 3s e r i e s t e s t i n gt h e i rm a t i n gt y p e sa n d m e a s u r i n gt h ee t h a n o lf e r m e n t a t i o nc a p a c i t y , f o u n dt h a ta m o n g a l lt h em a t i n gt y p e s , t h en u m b e ro f at y p ew a sf a rm o r et h a nt h en u m b e ro f a t y p e 4h i g h e t h a n o l p r o d u c t i o nh a p l o i d sw l 贯- es e l e c t e d t h ee t h a n o l - p r o d u c t i o nc a p a c i t yo f b e s t s t r a i nz s - 5i n c r e a s e db y4 5 t h a ni t sd i p l o i dp a r e n ts t r a i n ，a n dlam a t i n gt y p ea n d3 m a t i n gt y p e t a k et h es e l e c t e d4s t r a i n sa n d h a p l o i ds t r a i u sc 3 6 、c 3 6 - 8 、c 3 6 - 9a n da n e u p l o i d s t r a i nc 1 9a sh y b r i d i z a t i o ns t r a i n s , a n dm a k eg r o u ph y b r i d i z a t i o n w ef o u n dt h a ta f t e r 2 ho f e r o s s i n g , h y b r i dc e l l sa r o s e , a n dc u l t u r e di to np l a t ea f t e r4 8 h at o t a lo f1 2 4 h y b r i d sw e r ee n u s t r u c t e db yc r o s s i n ga n ds e r e e r ts t r a i n so f b e t t e rf e r m e n t a t i o n c h a r a c t e rb yo r i g i n a ls e l e c t i o na n dr e s e l e c t i o r lt h er e s u l ts h o w e dt h a tm o r et h a n9 5 h y b r i d sp r o d u c e dm o 化e t h a n o lt h a nt h e i rp a r e n t ss t r a i l l s w eg o t6s t r a i n sf i n a l l y , a n d t h e yw e r en a m e dz j l ，z j 一2 ，巧- 3 ，2 j _ 4 ，勾- 5 ，z j 6 k e yw o r d ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v l s i a e ；h a p l o i d ；h y b r i d i z e ；h y b 耐；l l i 曲 e t h a n o lp r o d u c t i o n 2 浙江大学硕士毕业论文 前言 酒精生产用酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 属于子囊菌亚门中的酵母 菌科成员，主要以出芽方式进行繁殖，属单细胞真核微生物。利用酿酒酵母发酵 糖类生产乙醇的历史非常悠久。目前世界乙醇产量的8 0 以上是通过酿酒酵母以 淀粉质或其他糖质原料发酵生产的川。 酵母菌在厌氧条件下发酵己糖生成酒精，其生化途径主要由两个阶段组成。 第一个阶段为己糖通过糖酵解途径( e m p 途径) 分解生成丙酮酸。第二个途径丙 酮酸由脱羧酶催化形成乙醛和二氧化碳，乙醛进一步被还原生成乙醇。葡萄糖发 酵生成乙醇的总反应简式为： c 6 h 1 2 0 6 _ _ + 2 c 2 h 5 0 h + 2 c 0 2 十能量 就理论而言，酿酒酵母行酒精发酵，每消耗lm o l 葡萄糖可产生2m o l 乙醇， 即1 8 0 克葡萄糖产生9 2 克乙醇，理论得率为5 1 1 1 。可在生产实际中，远未达到 此得率。原因是酵母发酵过程中除主要生成乙醇外，还生成少量的其他副产物， 包括甘油、有机酸( 乙酸、乳酸、琥珀酸等) 、杂醇油( 高级醇) 、醛类等，大约 有4 - 1 0 的碳源将被用于形成副产物，加之工艺条件与其他环境因素的影响，实 际可发酵性糖的利用率更低2 1 。我国目前工业规模的酒精生产因不同地区、企业、 所用原料与酵母种类、工艺条件等方面的差异，糖醇转化率一般在8 5 9 0 之间 自改革开放以来，由于我国经济与社会的持续快速发展，能源需求快速增长 与供给能力严重不足的矛盾r 益突出，环境空气污染的日益加剧，已经成为制约 社会可持续健康发展的瓶颈之一。2 0 0 0 年后，国家开始具体实施发展可再生、替 代性、环保型能源战略，先后在我国黑龙江、吉林、河南、安徽四省布局建设以 农作物所含有淀粉或糖质原料生产可再生、环保型、替代性能源燃料乙醇的 定点生产基地，2 0 0 6 年生产规模已达到1 0 0 余万吨，并以较快速度发展至本五年 计划末达到近5 0 0 万吨年的生产规模。 由于燃料乙醇的大规模生产消耗了数量比较巨大的淀粉与糖质原料，导致相 应原料的市场价格较快速上扬，燃料乙醇生产成本不断上升，虽然现燃料乙醇定 点生产得到国家一定的财政补贴，但目前原料价格上涨幅度已使燃料乙醇生产企 浙江大学硕士毕业论文 业濒临亏损边缘。因此，构建酒精高产酵母，对于降低燃料乙醇生产成本，确保 燃料乙醇生产企业利润，促进其自身稳定发展，顺利实现国家新能源战略目标， 保持社会与经济可持续健康发展等均具重要的意义。 长期以来，提高酵母酒精发酵的得率不外乎探索新发酵工艺和选育高产酿酒 酵母菌株。高产菌株的选育主要是从自然界或已知能产酒精的酵母中分离筛选u 禾5 1 。从自然界筛选的野生酵母一般很难具有用于发酵工业生产的理想特性，需 要进一步的驯化培养和利用育种技术进行改良，使其达到工业大生产的要求。诱 变育种是菌种选育的重要方法之一，通过各种物理和化学因子诱变，能够得到性 能增强的酵母菌株6 1 。随着原生质体融合和基因工程技术的不断成熟，采用原 生质体融合和重组d n a 技术实现高产酒率酿酒酵母菌株的构建，其研究报道屡 见不鲜3 一_ o 1 1 1 。通过代谢工程手段阻断酿酒酵母甘油的合成或降低甘油的合 成量以提高乙醇发酵的糖醇转化率，也已有实验室条件下获得成功的报道“2 _ 3 h 。可见工业微生物优良菌株的选育从自然选择( n a t u r a ls e l e c t i o n ) 、驯化育种 ( a c c l i m a t i o nb r e e d i n g ) 、诱变育种( m u t a t i o nb r e e d i n g ) 、杂交育种( b r e e d i n gb y h y b r i d i z a t i o n ) 、代谢调节育种( m e t a b o l i cc o n t r o lb r e e d i n g ) 发展到基因工程育种 ( g e n e t i ce n g i n e e r i n gb r e e d i n g ) ，在减少盲目性、省时、降低工作量、提高选育效 率等方面已取得长足的进步临临1 7 1 。 工业微生物遗传育种，选用哪种或先后采用哪几种方法为宜，应根据所用菌 株的特性，目的产物生成的代谢途径与调控模式、工业化实际应用时的工艺条件 等因事制宜，具体把握。 酿酒酵母属真核生物，结构组成与代谢调控体系复杂。酿酒酵母酒精发酵的 代谢，属细胞基础代谢范畴，酵母细胞高效率吸收利用可发酵性糖生长代谢生成 乙醇的效率受细胞全能性调控网络协调控制，属本源性多基因、多步骤、全局性 高度协调的基因表达调控模式。因此，要人为地方向明确地提升其代谢水平，又 要使其良好适应环境多变的大规模工业生产条件并收到实效，技术难度极其大。 作者所在实验室曾用高温热击、多级诱变为主的技术途径，在技术创新上有所突 破，成功选育耐高温、高转化率酒精生产菌株，并在酒精工业上实际应用，取得 较显著的经济与社会效益。该技术体系虽目前与今后仍不失为一种行之有效的高 产酵母选育方法，但该研究成果的问世几近十年，工耗大、费时多、周期长和效 4 浙江大学硕上毕业论文 率低。 现尚未见通过基因或代谢工程获得工业化高效率酒精生产菌株的报道。这主 要是由于基因工程技术在工业微生物育种方面虽已取得不少成果，但目前的技术 水平主要适用予新增受外源基因及其调控系统调控的代谢类型，或内源性单基 因、寡基因控制的代谢水平的提高。 酵母杂交在基础研究与酒精高产酵母选育方面，有关专著与论文中可见报 道，它是一种相对传统的微生物育种手段，通过杂交可以把不同菌株的优良经济 性状集于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷；通过 杂交可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种6 1 8 ，实 践中已取得不少成果。例如。开本的小阳等人用酒精酵母和卡尔斯伯酵母杂交获 得的杂交株，其乙醇产量和菌体生长量都比亲本有显著的提高，且发酵麦芽糖的 能力比亲株明显增强鲫。但止目| 尚未见较为系统地探索研究酒精生产工业菌 株的杂交育种规律，成功构建工业化规模应用的高性能酒精酵母菌株的报道。本 文试图结合工业化高产酒精酵母构建课题的研究内容，对现有优良的工业化应用 的酒精生产菌株的产孢条件、子囊发育、产孢率、交配型分布规律、杂交与及其 子代中高产株的分布与产酒优势性状的分离组合规律等进行较为系统地研究，为 建立相对高效率的通过杂交选育构件酒精高产酵母菌株的技术体系奠定基础，同 时为促进遗传学理论与技术的发展做出新的贡献。 浙江人学硕 毕业论文 材料与方法 l 菌株 本文所用的酵母均为s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e , 系列菌株见表1 。 表1 用于实验的菌株 t a b l e1s t t i h l $ f o re x p e r i m e n t 2 培养基 2 1 固体斜面完全培养基( y p d ) 1 3 1 1 酵母提取物2 葡萄糖2 0 0 蛋白胨1 5 琼脂p h 自然 1 1 5 0 c 湿热灭菌3 0 m i n ，用于制备斜面和平板。 2 2 产孢培养基( m c c l a r y ) 2 0 1 葡萄糖o 1 k c l0 1 8 n a a c0 8 2 酵母膏o 2 5 琼脂2 2 3 产孢培养基( s p m ) 2 葡萄糖o 1 k c i1 k _ i 1 2 p 0 45 m m o l l 酵母膏0 2 5 琼脂2 6 浙江大学硕士毕业论文 2 4 基本培养基2 2 1 葡萄糖2 k h 2 p 0 4o 1 m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 ( n h 4 ) 2 s 0 4o 5 琼脂2 p h 6 0 2 5 酒母培养基 玉米面粉糖化醪，加糖化酶过夜( 2 0 , - - 2 4 h ) 后，醪液用两层纱布过滤，取 滤过液，加水调整其糖度为1 4 b x 。 1 1 5 0 c 湿热灭菌3 0 m i n 。 如暂不使用，则置于2 0 1 2 冰箱中冷藏，化冻后再灭菌使用。 2 6 发酵培养基 2 3 2 6 0 b x 的玉米面粉糖化醪，不需要糖化过夜与过滤。 4 加压闷煮l h 后，直接使用。无需灭菌。 2 7 甘油保种培养基 5 0 甘油+ 5 0 y p 加琼脂的固体培养基) ，分装至甘油管中。 1 1 5 0 c 湿热灭菌3 0 m i n ，用于保种。 3 试剂 3 1斐林试剂( 廉爱浓法) 1 甲液：精确称取分析纯硫酸铜( c u s 0 4 5 h 2 0 ) 6 9 2 7 8 克，加水溶解后，稀 释定容至1 0 0 0 毫升。 乙液：称取酒石酸钾钠( k n a c , h 0 6 4 h 2 0 ) 3 4 6 克和氢氧化钠( n a o h ) 1 0 0 克，加水溶解后，稀释定容至1 0 0 0 毫升。 3 20 2 标准葡萄糖溶液2 4 1 取分析纯葡萄糖置1 0 5 1 1 0 0 c 干燥1 5 2 h ，冷却后，精确称取2 0 0 0 克， 溶于水后，稀释定容至1 0 0 0 毫升。 3 3 液化酶2 0 0 0 0 u m l ，苏州宏达酶制剂公司 3 4 糖化酶l o o o o o u m l ，苏州宏达酶制剂公司 3 5o i n 氢氧化钠2 4 1 称取4 克分析纯氢氧化钠( n a o h ) ，溶于少量已煮沸并冷却的蒸馏水中， 弃去下面碳酸钠沉淀物，取上层清液，用上述蒸馏水稀释至1 0 0 0 毫升。 7 浙江大学硕t 毕业论文 3 6l 次甲级蓝溶液2 3 1 称取次甲级蓝l 克加水溶解，稀释至1 0 0 毫升。 3 7 1 酚酞指示剂2 4 1 称取酚酞l 克，溶解于1 0 0 毫升9 5 酒精中。 3 8o 8 5 氯化钠溶液( 生理盐水) 0 8 - 0 9k g c m 2 压力下高压蒸汽灭菌2 0m i n 3 95 n 浓硫酸 量取比重为1 8 4 的分柝纯浓硫酸1 3 5 毫升，缓缓注入已盛有8 0 0 毫升 水的1 0 0 0 毫升容量瓶中，待冷却至常温后，加水稀释至刻度。 3 1 0 柠檬酸磷酸缓冲液( c p b ) 2 5 1 0 i m o l l 柠檬酸 0 2 m o l l n a h p 0 4 ( o 8 - 0 9 k g c m 2 压力下高温蒸汽灭菌) 3 111 0 蜗牛酶，购于华东医药公司 使用前用高渗c p b 缓冲液配置，0 4 5 i _ t m 滤膜抽虑灭菌 3 1 21 0 毓基乙醇 4 主要设备与器材 4 1台式离心机，t g l - 1 6 c ，上海安亨科学仪器厂 4 2 糖液计，2 5 ，帖l o ，1 0 - 2 0 ，2 0 - 3 0 ，浙江余姚芝林玻璃仪器厂 4 3 酒精计，0 - 1 0 ，1 0 - 2 0 ，浙江余姚仪表 4 a 电热恒温水槽，d k - 8 b ，上海精宏实验设备有限公司 4 5 电子天平，m e t t l e rp m 4 6 0 4 6 显微镜，x s j 1 4 7 血球计数板，x b k - 2 5 ，上海医用光学仪器厂 4 8 灭菌锅，z d x - 3 5 b i ，上海申安医疗器械厂 4 9 振荡器，h z - 9 3 1 1 k 、h z 2 0 1 0 k ，太仓实验仪器厂 4 1 0 磁力搅拌器，上海申安医疗器械厂 4 1 1 电热恒温培养箱，d h p 9 0 8 ，上海一恒科技有限公司 浙江丈学硕毕业论文 4 1 2 冷冻摇床，f i z 9 3 1 0 k ，太仓实验仪器厂 4 1 3 p h 计，上海申安医疗器械厂 4 1 4 烘箱，上海精宏实验设备有限公司 5 单倍体的获得 5 1 诱导孢子形成的方法2 6 将酿酒酵母菌株于y p d 固体斜面上2 8 1 2 培养4 8 h 活化，活化两次后接入产 孢培养基，2 5 培养3 7 天，在显微镜下观察子囊孢子形成情况，计算一个视野 内酵母总数和子囊孢子数，并计算产孢率。 产孢率( ) = 子囊孢子数量总细胞数 5 2 子囊孢子分离和单倍体的获得 菌株活化后接入产孢培养基，3 天后镜检观察，无菌水( 2 m 1 ) 倾于斜面上， 用接种环刮下菌体，收集菌悬液于7 m l 离心管中，6 0 0 0 r p m 离心1 0 r a i n 收集菌体。 o 8 5 生理盐水悬浮洗涤l 2 次，分别加入o 7 m lt r i s h c i ( p h 8 0 。0 0 1 m ) ：2 0 0 u l 1 0 蜗牛酶( 终浓度为o 0 2 ) ；1 0 0 u l1 0 巯基乙醇( 终浓度为0 0 1 ) 1 2 0 r p m ( 缓 慢振荡) 培养1 6 h 破子囊壁，使孢子释放。利用孢子比营养细胞耐热特性，采用5 8 1 2 高温致死处理营养细胞，离心收集孢子，并用t r i s h c i ( p h 8 o o 0 1 m ) 洗涤两次。 取适当稀释倍数，涂布于y p d 平板上，2 8 1 2 培养2 3 d 。 5 3 单倍体的鉴定 培养后挑取小菌落，镜检观察是否为单倍体。将获得的疑是单倍体再接入 产孢培养基，培养7 天左右观察子囊形成，以确定是否为真正的单倍体。有子囊 形成者基本确认为二倍体，不形成子囊者基本确认为单倍体。把确定为单倍体的 菌株分别保种( y p d 斜面、甘油管) 。 6 单倍体交配型的确定啪瑚1 单倍体菌株与标准菌株在y p d 斜面活化后，分别接种到装有1 0 m l y p d 液体 培养基的2 5 0 m l 三角瓶中培养，3 0 1 2 ，2 0 t h l m v m i n ，2 4 h 。 取l m l 待测的单倍体菌株菌液和l m l 标准菌株菌液接种到新鲜的1 0 m l y p d 液体培养基中，3 0 1 2 ，2 0 0 r p m m i n 9 浙江人学硕l 二毕业论文 镜检观察哑铃形细胞产生，混合菌液培养过夜后离心( 3 0 0 r p m ，5 r a i n ) 。菌 体沉淀后接种到产孢培养基中培养3 7 天，镜检观察有无子囊产生，确定交配型， 能与a 型标准菌株杂交并且产孢的菌株交配型为c t ；能与c t 型标准菌株杂交并且 产孢的菌株交配型为a 。 7 单倍体杂交与二倍体的检出唧 将a 型与c t 型单倍体菌株混合接种于y p d 液体培养基中，3 0 摇床培养， 镜检观察接合子的形成情况。镜检杂交完成后吸取适量菌液，涂布于基本培养基 平板，3 0 0 c 培养。挑取较大的单菌落。在产孢培养基上鉴定菌株的产孢能力，能 够产孢的菌株确定是经杂交形成的二倍体菌株，编号保存 8菌株酒精发酵转化率的测定 8 1 玉米面粉糖化醪的制作( 双酶法) 将水的p h 值调至5 左右，将玉米与面粉以3 ：7 混合，按照l ：2 6 的料水 比搅拌混合均匀，浸泡3 0 r a i n 。高温蒸煮且不断搅拌，使淀粉初步糊化而不至于 结块，当温度升至5 0 6 0 0 c 时每克淀粉加5 u g 淀粉的液化酶。继续蒸煮，加压 使温度达到1 1 5 。c ，蒸煮1 h 使淀粉完全糊化。冷却至9 5 0 c 后再加液化酶5 u g 淀 粉，彻底搅拌均匀，冷却至6 0 0 c 时加糖化酶2 0 0 u g 淀粉，并在5 5 0 c 水浴条件 下糖化，用于培养酒母的糖化醪，糖化1 8 - 2 4 1 1 ，两层纱布过滤得滤液即玉米面粉 糖化液。用于酒精发酵的糖化醪不需要糖化过夜与过滤，在加糖化酶2 0 0 u g 淀 粉糖化3 0 r a i n 后直接分装三角瓶接种发酵。 8 2 发酵工艺流程 将待测菌株经过斜面传代培养验证稳定性后，接种于新鲜斜面培养基培养， 再转接至种子培养基培养，当细胞生长至对数生长期、细胞数目达到1x1 0 s m l 以上时，按发酵培养基体积的1 5 的接种量，接种到发酵培养基中，发酵7 2 h 左右，测定发酵成熟醪外观糖度、酒精度、酸度、残余还原糖等相关参数值。 具体操作如下： ( 1 ) 菌种于y p d 斜面上3 0 。c 活化两次，接种至装有8 m 1 1 4 - 15 b x 种子糖化 液的2x 2 0 大试管中，3 0 0 c 培养1 6 - 2 0 h 。 l o 浙江大学硕毕业论文 ( 2 ) 菌液接入装有1 0 0 m l1 4 - 1 5 b x 的种子糖化液的2 5 0 m l 三角瓶中，3 0 0 c ， 2 0 0 r p m 培养1 0 - 1 2 h 。 ( 3 ) 发酵使用5 0 0 m l 三角瓶，内分装2 5 5 9 发酵培养基，接3 , - - 级种子液4 5 9 ， 装上发酵拴，3 1 0 c 静置培养。 ( 4 ) 8 1 2 小时后注入5 n 浓硫酸于发酵拴小瓶中封口，发酵培养的温度每隔 2 h 升高i o c 直至升温达3 5 0 c ，静置发酵7 2 h 左右。 ( 5 ) 发酵完成后测定发酵成熟醪的酒精度、外观糖度、残余还原糖与酸度等 参数值，供结果分析。 8 3 酒精发酵相关参数的测定 8 3 1 发酵曲线的测定 将酵母接入发酵培养基发酵静止培养以后，每隔1 2 h 测定c 0 2 失重量，并 计算发酵效率。 发酵效率( ) = c 0 2 失重量，( 培养基中葡萄糖量x 0 4 9 ) x 1 0 0 8 3 2 酒精度的测定 将发酵后的成熟醪1 0 0 m i 与水1 0 0 m l 混合后置于5 0 0 m l 三角瓶或蒸馏烧瓶 中，电炉上蒸馏出1 0 0 m l 的酒精水溶液，用酒精计温度计测量该溶液的酒精度 ( v v ) 与温度，查温度酒度校正表，求出在温度2 0 时以容量百分数表示的酒 精水溶液的酒精浓度。 8 3 3 外观糖度的测定 量取过滤后的滤液1 0 0 m l ，用糖度计和温度计直接测量出外观糖度和温度， 然后查糖度温度校正表校正为2 0 0 c 时的糖度。 8 3 4 酸度的测定 取用两层纱布过滤后的发酵成熟醪滤过液l m l ，放入1 0 0 m l 三角瓶中，加中 性蒸馏水5 0 m l ，加入酚酞指示剂2 滴，用0 1 nn a o h 滴定至微红色在3 0 秒内 不消失为终点。每l m l 糖化醪过滤液用上述n a o h 溶液滴定至终点，每消耗 o 1 m l n a o h 溶液计为一个酸度。 8 3 5 还原糖的测定 称取试样s o g ，用水洗入2 5 0 m l 容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，过滤后 备用。 浙江大学硕士毕业论文 空白试验：吸取斐林氏甲、乙液各5 m l ，入1 5 0 r a l 三角瓶中，加水2 0 m l ， 由滴定管加入o 2 葡萄糖溶液2 4 m i ，置电炉上加热煮沸2 m i n ，加入1 次甲级 蓝溶液一滴，继续用o 2 葡萄糖液在一分钟内滴定至蓝色完全消退即为终点。 记录消耗糖液毫升数v l 。 正式滴定：吸取斐林氏甲、乙液各5 m l ，入1 5 0 r a l 三角瓶中，加入日口述备用 过滤液v 3 m l ，加水2 0 m l ，再加入0 2 葡萄糖液适量，置电炉上加入煮沸2 m i n ， 加入1 次甲级蓝溶液一滴，继续用o 2 葡萄糖液滴定至终点。记录消耗糖液毫 升数v 2 。 还原糖( ) = ( v l - v 2 ) x o 0 0 2 x 2 5 0 ( v 3x5 0 ) 1x1 0 0 9数据处理 所获得的基本测定数据，采用e x c e l 自带的单因素方差分析进行处理，此工 具可对两个或更多样本的数据执行简单的方差分析。此分析可提供一种假设测 试，该假设的内容是：每个样本都取自相同基础概率分布，而不是对所有样本来 说基础概率分布都不相同。 1 2 浙江大学硕 毕业论文 1 高产孢率培养基的筛选 结果与分析 5 株二倍体菌株在两种产孢培养基( s p m 和m c c l a r y ) 中2 5 。c 培养3 7 天， 显微镜下观察产孢情况，计算产孢率。结果如下所示： 表2两种产孢培养基中酿酒酵母的产孢率 t a b l e2 印o r u l a f l o nr a t eo f s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eg r o w ni nt w od i f f e r e n t s p o l u l a t i o nc u l t u r e s 从表中可以看出，不同的菌株在产孢培养基中产孢率不同。s p m 培养基中 z j d 3 - 3 的产孢率最低，只有4 6 7 ，z j d 3 9 的产孢率最高，为1 3 2 7 左右。 在m c c l a r y 培养基中，z j d 3 - 9 的产孢率最低，为3 7 8 9 ，z j d 3 1 1 的产孢率 最高，达到4 6 5 8 。z j d 3 系列菌株在s p m 产孢培养基培养的总产孢率为4 - 1 3 ， 在m c c l a r y 产孢培养基培养的总产孢率为3 7 4 6 ，就各个菌株言，不同菌株在 不同的产孢培养基中，产孢率各不相同，而从总体看，在m c c l a r y 产孢培养基中 产孢率较高。由此可见，m c c l a r y 培养基是酿酒酵母的高产孢率培养基，故本研 究中选取m c c l a r y 培养基为产孢培养基。 2 单倍体菌株的获得 利用最佳产孢培养基对菌株7 _ j d 3 3 、z j d 3 - 4 、z j d 3 7 、z j d 3 9 、z j d 3 1 1 进行产孢培养并对子囊进行破壁释放子囊孢子，根据子囊孢子比二倍体营养细胞 更耐热的特性，对营养细胞与子囊孢子的混合物进行5 8 、1 0 m i n 热处理，稀释 1 3 浙江大学硕士毕业论文 涂布y p d 平板，然后挑取y p d 平板上长出的小茵落，经过活化并再次对挑出的 单菌落进行产孢培养，经镜检观察细胞形态较小，具有凝聚性，并且不产孢的即 为单倍体。z j d 3 系列一共得到7 1 株单倍体，其中分布下表： 表3 各系列二倍体菌株产孢情况 t a b l e 3s c h e m e o f s p o r ec l o n e ss e l e e t i o a 亲株编号单倍体编号交配型 “ 浙江大学硕士毕业论文 亲株编号单倍体编号交配型 亲株编号单倍体编号 交配型 刀d 3 11 1 z j d 3 1 1 2 z ，d 3 1 l - 3 z ，d 3 1 1 4 1 5 n d a n d 口 浙江大学硕士毕业论文 2 j d 3 1 l 到- d 3 1 1 5 z j d 3 1 1 6 刀d 3 1 l - 7 z j d 3 1 1 8 z j d 3 一l1 - 9 a 口 n d n d a n d ：朱检测剑或无交配型 这些菌株分别编号为z j d 3 - 3 1 刁d 3 3 1 5 ， z j d 3 4 1 刁d 3 4 - 1 4 ， z j d 3 7 1 z j d 3 7 1 8 ，z j d 3 9 1 z j d 3 9 - 1 5 ，z j d 3 1 1 1 一刁d 3 1 1 9 。 对得到的单倍体进行交配型测定，其中交配型为a 的菌株占4 4 ，a 型的菌 株占2 4 ，这可能与二倍体带有隐性致死基因或带有孢子发育关键基因的突变基 因，从而导致部分子囊孢子不能正常发育有关。实验中发现，部分菌株的形态特 征为单倍体，但不能与a 型或a 型标准单倍体菌株杂交，表现出既不是a 型又非 a 型的有待进一步鉴定的性状。 3 单倍体菌株酒精发酵力分析 对分离得到的7 l 株单倍体进行发酵能力测试，以z j d 3 3 ，c 1 9 ，以及各自 的亲株为对照，经初步发酵试验，获得发酵力较高的单倍体菌株3 0 株。 表4发酵力较高单倍体菌株 t a b l e4 h a p l o i ds t r a m so f h l g he t h a n o l - p r o d u c t i o n 上述单倍体菌株经酒精发酵力测定，发现它们的发酵能力高低不一，暗示酿 酒酵母的发酵性能受多基因调控。在3 0 株发酵力较高的菌株中，有1 2 株单倍体 的发酵性能高于或等于它们各自的亲株，2 3 株单倍体的发酵力高于对照菌 z j d 3 3 ，9 株单倍体的发酵力高于对照菌株c 1 9 。 在这3 0 株菌株中，分离自z j d 3 3 的单倍体7 株，分离自z j d 3 4 的单倍体 1 6 浙江大学硕士毕业论文 2 株，分离自z j d 3 - 7 的单倍体6 株，分离自z j d 3 - 9 的单倍体7 株，分离自7 _ j d 3 i i 的单倍体8 株。对这些菌株多次发酵，比较它们与对照菌株7 _ j d 3 3 和c 1 9 以及 亲株之间酒精发酵性能的差别，结果如图1 所示。其中z j d 3 3 系列单倍体中有 6 株单倍体菌株的发酵性能高于对照菌株z j d 3 3 ，占z j d 3 3 系列单倍体的 8 5 7 ，两株菌株的发酵性能高于c 1 9 ，占该系列的2 8 6 ；z j d 3 4 系列单倍 体菌株中，有1 0 0 的菌株发酵性能高于对照菌株z j d 3 3 ，5 0 菌株发酵性能高 于对照菌株c 1 9 ，没有菌株的发酵性能超出亲株z j d 3 - - 4 。7 _ j d 3 7 系列单倍体中， 有4 株菌株的发酵性能超过对照菌株7 _ _ j d 3 3 和c 1 9 以及亲株z j d 3 7 。7 - - j d 3 - 9 系列的7 株菌株中，4 株菌株超过对照菌株z , j d 3 3 ，l 株菌株超过亲株z j d 3 9 ， 但没有超过c 1 9 的。7 - - j d 3 i i 系列的单倍体中，7 株菌株超过对照菌株7 - - j d 3 3 ， 2 株菌株超过c 1 9 ，l 株菌株超过亲株刁d 3 1 l 。 蠢 篁 求 比z j d 3 - 3 酒精度高的菌株占此系列比例 l i ： z j d 3 - 3 系z j d 3 4 系z d d 3 7 系z j d 3 9 系z j d 3 - 1l 系 列 列判列 列 菌株系列 1 7 瞄蓍；嗽矾瞄姒枞姒獬懈嘛 浙江大学硕十毕业论文 比c 1 9 酒精度高的菌株占此系列比例 厂 z j d 3 - 3 系z j d 3 - 4 系z j d 3 - 7 系z j d 3 - 9 系z j d 3 - 1l 系 列列列列列 菌株系列 比亲株酒精度高的菌株占此系列比例 图15 个系列单倍体菌株与对照菌株发酵能力对比 f i 9 1 p r o f d e so f f e r m e n t a t i o nc a p a c i t yo f 5g r o u p so f s p o r ec l o n e sc o m p a r e dw i t hc o n t r o l n t a i l l $ 最终从z j d 3 系列的单倍体中挑出4 株发酵性能最高且具有明确交配型的菌 株，其中l 株a 型，3 株旺型。这4 株单倍体重新编号为z s - 5 ( a ，z j d 3 - 3 系列) 、z s - l l ( a ， z j d 3 7 系列) 、z s 一1 3 ( a ，z j d 3 7 系列) 、z s - 1 4 ( a ，7 _ j d 3 ii 系列) ，发酵性能见表5 。 1 8 瞄晰础嗽晰懈姒撕懈雠 l 基采妞 慨蓍|啷m雠粥懈i毫批懈“ i 篁求陋 浙江大学硕士毕业论文 这4 株单倍体菌株发酵终了的酒精度与它们的亲株相比，分别增长为z s - 54 5 ， z s - l l3 2 ，z s - 1 33 2 ，z s - 1 43 2 。 表54 株高产单倍体的发酵性能 t a b l e5f e r m e n t a t i o nr e s u l to f 4h i g he t h a n o l - f e r m e n t a t i o nh a p l o i d s ：此表中的转化率是指每生成l 度酒精所需要消耗的外观糖度 上述4 株最高产的单倍体菌株与实验室原有单倍体c 3 6 ，c 3 6 8 ，c 3 6 - 9 和z 2 - 3 以及一株非整倍体c 1 9 进行杂交( 这些原有单倍体菌株的交配型均为a 型) ，以求 获得更高产的杂合后代。 4 杂交及其后代二倍体菌株的检出 单倍体细胞具有接合能力，在杂交过程中，不同交配型的两个单倍体在营养 等条件适宜时，两个细胞相互识别，相互接触，通过质配、核配，最后融合成一 个完整的二倍体合子。在两个细胞杂交融合的过程中往往会出现哑铃形细胞，可 在显微镜下辨认，故哑铃形细胞的检出成为检查有无杂交的一个方法。单倍体混 合培养2 h 之后少数混合菌株开始出现哑铃形细胞( 见图2 ) ，随后，哑铃形细胞 逐渐增多，至4 8 h 时，镜检混合菌液发现哑铃形细胞数目变少，出现个体较大的 细胞，视为杂交基本完成。因此在混合培养4 8 h 后吸取菌液涂布，基本培养基平 板培养。 1 9 浙江大学硕士毕业论文 z s - l f x z s - 5 z l l x 口- 1 4 c 3 6 x z s - $ 浙江大学硕j ：毕业论文 图2 杂交哑铃型细胞 f i g2m o r p h o l o g yo f e e l bi nh y b r i d i z i n g 将来源于不同亲本的a 型单倍体和a 单倍体菌株进行杂交试验，基本培养基 平扳培养。在基本培养基平板培养过程中，二倍体的生长速度比单倍体的生长速 度快，所以杂交菌株的单菌落会最早出现且较大，选取这样的菌落来进行检测。 但单倍体菌株z s 1 4 的生长速度比较快，杂交菌不容易被挑出。单菌落再接种到 产孢培养基中培养，最后挑选出具有产孢能力的杂交二倍体菌株共1 2 4 株，接入 y p d 斜面保种。 表6 杂交结果 t a b l e6r e s u l to f h y b r i d i z i n g 5 杂交菌株发酵性能测验 2 l 浙江大学硕t 毕业论文 获得的1 2 4 株杂交二倍体菌株和单倍体亲株以及原始二倍体亲株一同进行 发酵性能试验，试验结果见表7 。只有5 个杂交后代的发酵力低于两个单倍体亲 株，4 2 株杂交二倍体菌株的发酵力比亲株提高不到5 ，而有6 6 株杂交二倍体 菌株的发酵力比亲株高5 以上。这里表现出一种趋势，即绝大部分菌株的发酵 性能比原始的二倍体亲株要高。 表7 与单倍体亲株比较 t a b l e7c o m p a r i s o no f h y b r i d sa n dp a r e n t ss t r a i n s 最后挑选出6 株发酵力最高以及产酒精最多的杂交菌株，将它们编号为 z j l 、z j 一2 、z j 一3 、z j - 4 、z j - 5 、z j 一6 。这6 个菌株的发酵能力见表8 ，最多可比单倍 体亲株高出弘1 7 7 ，也比原始的二倍体亲株高出11 3 ，1 5 3 。其中z j - 4 产酒 精能力最强，酒精度达到1 3 9 5 ，分别比亲株c 3 6 8 和z s - 1 3 高出8 6 和1 7 7 ， 比原始的二倍体亲株z j d 3 7 高出1 5 5 。利用c o ：失重法，对这6 株杂交菌株 在3 5 条件下的葡萄塘发酵率进行测定，图3 显示了在发酵仞始阶段，杂合子 与亲株对比，它们的发酵能力没有多大差别，但这表明杂交二倍体菌株获得了亲 株高产酒精的性状。但发酵4 8 h 以后，单倍体亲株和原始二倍体亲株的c 0 2 失 重量减小，也就是说，葡萄糖转化为酒精的量减少，但杂合子的转化率相对较高。 表8 杂交菌株的发酵力 t a b l e0e t h a n o lf e r m e n t a t i o nr e s u l t so f h y b r i d s 浙江大学硕士毕业论文 一 棚 水 谨 基 蜉 3 0 2 5 2 0 1 5 1 0 5 1 2 h 2 5 i 2 0 棚 錾1 5 掣 f 1 0 5 o 2 4 h3 6 1 14 8 h6 0 h 7 2 h 8 4 h 时间h z j 1 的发酵曲线 1 2 h2 4 h3 6 h4 8 h6 0 h7 2 h8 4 h 时间h z j - 2 的发酵曲线 浙江大学硕士毕业论文 3 0 2 5