（病理学与病理生理学专业论文）5fu可富集肺腺癌spca1细胞系中肿瘤干细胞.pdf

个人简介5 0 中文论著摘要 5 - f u 可富集肺腺癌s p c - a 1 细胞系中肿瘤干细胞 目的 肺癌是对人类健康危害极大的恶性肿瘤，我国是肺癌发病率较高的地区，尽管 目前我国肺癌的发病率有下降趋势，但其发病率和死亡率仍高居恶性肿瘤首位。 由于肺癌的发病机制不清，尚不能有效地预防其发生，因此探索肺癌发生的相关 机制，寻找特异性的阻断和治疗方法一直是人们努力的方向。 最近，大量实验证实存在少量维持恶性生长的并具备自我更新能力的细胞亚 群，这群细胞具备较高恶性程度的细胞被称为肿瘤干细胞( c a n c e rs t e mc e l l ，c s c ) 或肿瘤起始细胞目前已经在乳腺癌，肺癌，前列腺癌，结肠癌等多种实体瘤中证 实了c s c 的存在因此，根据此学说推测肺癌也可能来源于干细胞，是一种干细胞 疾病。传统治疗方法虽然可使肿瘤体积明显缩小，有的甚至可达到完全缓解，但 实际上大部分肿瘤经过一段时间的缓解期之后又会复发或转移，这可能是由于现 有的治疗手段没有清除这些决定复发和转移的关键细胞肿瘤干细胞的缘故。 侧群细胞( s i d ep o p u l a t i o nc e l l s ，s p ) 是g o o d e l l 在对造血干祖细胞分离时发现 的一群特殊干细胞由于其细胞膜表面高表达a b c 转运蛋白( a t p - b i n d i n gc a s s e t t e m e m b r a n et r a n o n - s p o r t e r ，a b c ) ，可将d n a 染料h o e c h s t 3 3 3 4 2 外排至细胞外，并 且具备自我更新、多向分化、成瘤性等一系列干细胞的生物学特征。 肺癌细胞对一些化疗药物具有耐药性，且大部分耐药细胞被5 - f u 阻滞于g o 期，而研究表明，肿瘤干细胞大多处于g o 期。因此我们猜想，对5 - f u 表现出耐 药性的细胞群中是否可能包含了大量的肿瘤干细胞。我们能否利用这一耐药模型 来富集肺癌干细胞? 本研究旨在探索5 - f u 对于肺腺癌细胞系s p c a i 中肿瘤干细 胞的影响。 方法 1 、细胞培养 肺腺癌s p c a 1 细胞系购自a t c c 。s p c a 1 细胞在含有10 胎牛血清( g b i c o i n c ，n y ，u s a ) 的r p m l l 6 4 0 培养基( g b i c o i n c ，n y ，u s a ) 和含有1 0 牛血 清( g b i c oi n c ，n y ，u s a ) 中培养( 3 7 c ，5 c 0 2 ) 。 2 、四甲基偶氮哩盐( t e t r a z o l i u m ，m t t ) 法检测细胞增殖能力 取对数生长期的肺癌细胞悬液进行细胞计数，分别接种于4 个9 6 孔板培养板。 接种2 4 小时后加入各种处理因素。处理后第2 4 、4 8 、7 2 、9 6 小时分别加入 m t t ( 5 m g m 1 ) 2 0 1 x l ，继续孵育4 小时后，每孔加入1 5 0 i - t l d m s o 溶解结晶，测定各 孔吸光度。 3 、流式细胞仪检测细胞周期 收集对数生长期细胞制成1 x 1 0 6 个m l 细胞悬液。7 5 冷乙醇于4 c 固定过夜、 离心后制成5 0 0 1 a l 的细胞悬液，加碘化丙啶染液于4 c 避光孵育4 5 分钟后上机检 测，m o d f i t l t 3 0 软件分析细胞周期。 4 、免疫荧光染色 接种细胞于2 4 孔板中，多聚甲醛固定，用o 2 的t r i t o n - x 1 0 0 于常温打孔1 5 3 0 分钟。1 的b s a 常温封闭3 0 分钟。封闭完后加入一抗，4 c 过夜。次日，加入 相应二抗，室温孵育1 个小时后，d a p i 染核，荧光显微镜观察。 5 、w e s t e m b l o t 收集细胞，提取总蛋白，蛋白定量。电泳后将蛋白转印到p v d f 膜上，然后 用3 小牛血清封闭，一抗4 孵育过夜，二抗3 7 孵育2 小时后e c l 发光，曝 光胶片后，测定灰度值 6 、f a c s 分选侧群细胞 3 7 c 预热的d m e m 培养液( 含2 f b s 和l o m m o l 1h e p e s 缓冲液) 重悬，计 数，至细胞密度为1 x 1 0 6 m l ；实验分两组：一组先加入v e r a p a m i l ( 5 0 b g m 1 ) 3 7 。c ， 15 m i n ，再加入h o e c h s t 3 3 3 4 2 荧光染料( 5 b g m 1 ) 3 7 。c 反应9 0 m i n ；另组直接加入 2 h o e c h s t 3 3 3 4 2 荧光染料( 5 p g m 1 ) 3 7 * c 反应9 0 m i n ，洗涤并重悬，p i ( 2 p g m 1 ) 染死亡 细胞；紫外光源流式细胞仪进行检测及分选。 7 、t r a n s w e l l 基质胶细胞侵袭试验 用无血清的培养基将m a t r i g e l 加入到孔径为8 0 p m 的t r a n w e l l 小室中，向小 室的上室中加入1 0 0 p l 的细胞悬液( 5 x 1 0 5 c e l l s m 1 ) ，下室中加入含1 0 f b s 的血清 作为趋化诱导剂，孵箱中孵育3 6 小时后取出，用无菌的棉签擦拭去上室的胶，滤 膜经固定、染色后封片，镜检1 0 个高倍视野( 4 0 0 x ) 。 8 、克隆形成能力实验 将刚刚分选所得的s p 和n o n s p 细胞分别接种于六孔扳，培养一周左右进行 结晶紫染色计数形成的克隆数( 见图) 。克隆形成率( c l o n e f o r m a t i o ne f f i c i e n c y ，c f e ) 的计算公式为：c f e = 克隆形成数接种细胞数x 1 0 0 。 9 、裸鼠致瘤实验 从s p c a 1 细胞系中分选出的s p 和n o n s p 细胞分别用r p m i 1 6 4 0 完全培养 液重悬，计数，调整细胞浓度至5 x 1 0 4 m l ，每个浓度接种3 只b a l b c 免疫缺陷 小鼠，注射后每隔两天观察一次长瘤情况，注射后2 8 天，断颈处死。 1 0 、统计分析 使用s p s s l 3 0 统计软件进行结果统计。所有以均数土标准差( x 士s d ) 表示的数 据，其实验至少重复3 次，p 值 5 0c e l l s a n dc o m p a r e dt h er e s u l t s 9 、t u m o rf o r m a t i o ni na na n i m a lm o d e l n u d em i c ew e r ep u r c h a s e df r o mt h eb e i j i n gw e i t o n g l i h u a l a b o r a t o r ya n i m a l c o l t da n dm a i n t a i n e di nm i c r o i s o l a t o rc a g e s t u m o rc e l l sw e r es u s p e n d e di n2 0 0 山 r p m i16 4 0c o m p l e t ec u l t u r ew i t h2 5 m a t r i g e l ( b db i o s c i e n c e s ) a n di n o c u l a t e d s u b c u t a n e o u s l yi n t ot h er i g h tf l a n k so f4 - t o5 - w e e k o l dn u d em i c e t h em i c ew e r e m o n i t o r e de v e r yt w i c ed a y sf o rp a l p a b l et u m o rf o r m a t i o na n dt u m o r sw e r em e a s u r e d u s i n ga v e r n i e rc a l i p e r , a n da l s ow e i g h e da n dp h o t o g r a p h e d 10 、s t a t i s t i c a la n a l y s i s a l ld a t aw e r ee x p r e s s e da sm e a n + s t a n d a r dd e v i a t i o n ( s d ) f o ri nv i t r oe x p e r i m e n t s p e r f o r m e da tl e a s t3t i m e s ，a n dt h eo n e w a ya n a l y s i so fv a r i a n c ef o l l o w e db yal e a s t s i g n i f i c a n td i f f e r e n tt e s t ( l s d ) f o rm u l t i p l ec o m p a r i s o n sw a su s e df o rs t a t i s t i c a la n a l y s i s v i as p s s1 3 0f o rw i n d o w s ( s p s si n c ，c h i c a g o ，i l ，u s a ) pv a l u e sl e s st h a n0 0 5w e r e c o n s i d e r e ds t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t 8 r e s u l t s 1 、m t ts h o w e dt h a tt h ep r o l i f e r a t i o no fl u n ga d e n o c a r c i n o m ac e l ls p c - a 1c a nb e i n h i b i t e dw h e ne x p o s e dt o5 一f ua td i f f e r e n td o s a g e s t h ei n h i b i t i o nw a si nc o r r e l a t i o n w i t ht h et i m ea n dd o s a g eo f5 一f ut r e a t e dw i t hc e l l sa n dt h e ( i c 5 0 ) w a sa b o u ta t 10 0 1 x g m 1 2 、a f t e r5 一f ue x p o s u r ea ta ni c 5 0v a l u e t h es - p h a s ef r a c t i o nd e c r e a s e df r o m 3 3 1 4 t 0 18 2 0 m e a n w h i l e t h eg g op h a s ec e l lp o p u l a t i o no f5 一f u - t r e a t e dc e l l s i n c r e a s e df r o m5 8 4 6 t o7 6 6 8 t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a t5 - f um a i n l ya c to nc e l l s i np r o l i f e r a t i v ep h a s e ，e s p e c i a l l yi nt h esp h a s ep o p u l a t i o n ，w h i l es l i g h ta c t e do nc e l l si n o t h e rp h a s e s 3 、t h ei m m u n o f l u o r e c e n c ea n dw e s t e r nb l o td i s p l a y e dt h a t5 一f uc o u l de n h a n c e t h ee x p r e s s i o no fo c t 3 4 ，s o x 2 ，a n da b c g 2i ns p c - a 1c e l ll i n e s t h er e s u l t sa l s o s u g g e s t e dt h a ti tc o u l de n h a n c et h ee x p r e s s i o no fs t e mc e l lm a r k e r si nt h e s ec e l ll i n e s b i tb yb i tt ob o o s t e rd o s ea n da d dt i m eg r a d u a l l y 4 、t h ef a c sa n a l y s i ss u g g e s t e dt h a t5 一f uc o u l di n c r e a s et h ep e r c e n t a g eo fs i d e p o p u l a t i o nc e l l si n s p c a 1c e l ll i n e a f t e rt r e a t e dw i t h5 - f uf o r2 4 ha n d4 8 h t h e p e r c e n t a g eo fs i d ep o p u l a t i o nc e l l si n c r e a s e df r o m1 3 t o4 8 a n d8 o s e p a r a t e l y 5 、t h et r a n s w e l li n v a s i o na s s a yi n d i c a t e dt h a ts pc e l l sh a v eag r e a t e ri n v a s i v e p o t e n t i a li nv i v o 6 、t h ec l o n e - f o r m i n ga s s a yi n d i c a t e dt h a ts pc e l l sf r o ms p c a1c e l l sw e r ea b l et o f o r m2 5t i m e sm o r ec o l o n i e st h a nn o n s pc e l l s 俨 5 0 个细胞时进行结晶紫染色计数， 所形成的克隆数目，克隆形成率( c f e ) = 克隆形成数接种细胞数x 1 0 0 1 9 9 、裸鼠体内成瘤试验： ( 1 ) 将当天上午分选所得到的s p 和n o n - s p 细胞准确记数病重悬于p b s 中，接种 体积为2 0 0 p l ，数量为5 1 0 4 个； ( 2 ) 在动物房中分别注射于b a l b c 免疫缺陷小鼠右侧腋窝下( 北京维通利华实验 动物中心提供) ，每组3 只小鼠； ( 3 ) 饲养4 - - - 9 周，每隔两天观察一次肿瘤生长情况。处死前用游标卡尺测量肿瘤大 小，采取断颈法处死小鼠，拍照取出瘤组织，剪取部分用1 0 福尔马林浸泡固定， 切片进行h e 染色确定病理类型。 硅田 ；口7 i 1 、5 - f u 对s p c - a 1 细胞增殖的影响 不同浓度的5 f u 作用于肺癌s p c a 1 细胞后，细胞的生长有不同程度的抑制， 这种抑制呈时间依赖性。1 0 “g m l 的5 一f u 作用2 4 小时后对肺癌s p c - a 1 细胞生长 抑制率为3 8 8 ，1 0 0 v t g m l 的药物作用2 4 小时后，对细胞生长抑制率可达到 5 1 9 8 ，而5 0 0 p g m 1 5 f u 组几乎未见活细胞。故5 - f u 对肺癌s p c a 1 细胞的半 数抑制率( i c 5 0 ) 约为1 0 0 p g m l 。见图l 及表1 。 - 一- 一l 匈唔槛t i i , 1 - - 2 蠹蜡m l - - 辩蜡m l _ - 一1 0 b 嘿锄 一4 - - 2 愀吐 一。秘呻阻 l 压现h4 8 bz 2 h t i m e o f 孓f ut r e a t m e n t 图1 不同浓度5 - f u 对肺癌s p c a i 细胞生长的抑制率5 f u 可显著抑制s p c a i 细胞的增殖，并且呈明显时 间和剂量依赖性，1 0 0 v g m l 的药物作用2 4 小时后，对细胞生长抑制率可达到5 1 9 8 ，故5 f u 对肺癌s p c - a i 船 o l l o 一苗1 co量cl互ul一孚v 细胞的半数抑制浓度o c 5 0 ) 约为l 鸺，m i 表1 不同浓度孓f u 作用于s p c - a 1 细胞2 4 h 的细胞增殖抑制率 组别na 值( m e a n 圭s )抑制率 2 、通过细胞周期检测5 一f u 对s p c - i 细胞周期的影响 细胞周期结果提示：i c 5 0 的5 - f u 作用于肺腺癌细胞系后，s 期细胞比例从 3 3 1 4 减少至18 2 0 ，g o g l 期细胞比例从5 8 4 6 增加至7 6 6 8 。( 图2 a b ) ab j & a 。 一 圈2 5 - f u 对s p c - a i 细胞周期的影响5 - f u 作用于肺癌s p c - a i 细胞2 4 h 后，s 期细胞比例由3 3 9 9 凋t 少至 1 3 0 7 * ；0 2 期由9 铭减少至5 弱0 i 期由5 6 3 9 翅i 加至8 1 4 1 说明5 f u 主要作用于增殖期尤其是s 期细 胞， 0 0 5 ， 3 、5 一f u 可诱导s p c 以1 细胞干细胞标记物的表达 根据生长曲线推算5 - f u 对肺癌细胞株的4 8 h 半数抑制率0 c 5 0 ) 约为 1 0 0 删，为了避免药物浓度过小或过大对实验产生较大的影响，同时在实验结 束的时间点保证一定量的存活细胞进行实验，选择药物浓度为1 0 0 p g n d 进行后面 的实验。免疫荧光显示1 0 0 t 唱, m l5 - f u 作用后肺癌细胞株s p c - a 1 中o c t 3 4 和s o x 2 2 1 表达水平随着作用时间的延长而逐渐升高( 图3 ) ；w e s t e m b l o t 结果显示：1 0 0 酬 5 - f u 作用后肺癌细胞株s p c - a 1 中o c t 3 4 ，s o x 2 和a b c g 2 表达水平随着作用时 间的延长而逐渐升高；对照组与1 2 h 组、2 4 h 组和4 8 h 组两两之间比较o c t 3 4 ， s o x 2 和a b c g 2 表达均有显著性差异( p 0 0 5 ) ( 图4 ) o c t 引4 ，d a p n 2 4 h4 8 h 一 一 图3 免疫荧光观察5 - f u 作用前后o c t 3 4 ，s o x 2 表达变化在正常的肺腺癌s p c - a i 细胞中o c t 3 4 ，s o x 2 表 达近乎阴性，5 - f u 分别作用2 4 h ，4 8 h 后，研i c a l 细胞中o c t 3 4 ，s o x 2 表达逐渐增强，阳性细胞数目逐渐 增多 a n2 4 1 14 8 h 仉龇i - i 鼍苎 s o x 2 一。_ _ a b c 醴 u 。 d 一- - 一 p 咄1 ：1 n b 图4 w e s t e r n - b l o t 观察5 - f u 作用前后o c t 3 4 ，s o x 2 和a b c g 2 表达变化在正常的肺腺癌s p c - a i 细胞中 o c t 3 4 ，s o x 2 表达阴性，5 - f u 分别作用2 4 h ，4 8 h 后，s p c - a 1 细胞中o c t 3 4 。s o x 2 和a b c g 2 表达逐渐增 强，三者表达趋势接近一致。 o o 0 0 o 0 0 n o 冒tr【譬苫墨t石-il 4 、5 一f u 上调肺腺癌细胞株的侧群细胞群体 肿瘤干细胞的鉴定方法尚未成熟，迄今为止比较公认的是流式细胞仪检测s p 细胞比例。通过流式细胞仪检测，贴壁生长的s p c - a i 细胞其s p 细胞比例约为 1 3 2 ，5 f u 作用于肺腺癌细胞后，其s p 细胞比例明显增加。本研究表明，5 - f u 分别作用2 4 h ，4 8 h 后，s p 细胞比例显著升高，分别达4 8 ，8 0 。由此我们认 为5 - f u 上调了这部分s p 细胞而使得s p c - a i 细胞千细胞标记物表达增强( 图5 ) 。 h o e c h s tr e d - a 圈5 童a c s 检测侧群细腮细胞比例变化赴h o e c h s t3 3 3 4 2 ( 未处理s p c - a i - a i 细胞中的鲫爱星) lb l v e m p a m i l + h o e c h s t3 3 3 4 2 ( 未处理s p c - a i 细胞中的s p 表型) lc lh o e c h s t3 3 3 4 2 ( 5 - f u 作用2 4 h 的印表型) l d tv e m p a m i i + h o e c u s t3 3 3 4 2 ( 5 - f u 作用2 4 h 的跚表塑) ；e lh o e c h s t3 3 3 4 2 ( 5 - f u 作用4 8 h 的趼表型) lf l v e r a p e m i l + h o e c h s 0 3 3 4 2 ( 5 一f u 作用4 8 1 1 的s p 表塑) 5 - f u 作用于肺腺癌s p c - a i 细胞后，站细胞比例显著高 于未处理组，随着药物作用时问延长，s p 细胞比饲逐渐增高 5 、s p 细胞具备较强集落形成能力 将刚刚分选所得的s p 和n o n - s p 细胞分别接种于六孔扳，每孔2 0 0 个细胞，培 养一周左右进行结晶紫染色计数形成的克隆数( 见图) 。克隆形成率( c l o n e f o r m a t i o ne f f i c i e n c y ，c f e ) 的计算公式为：c f e = 克隆形成数，接种细胞数x 1 0 0 。 计算所得s p 细胞的c f e 为4 0 士2 3 ，而n o n - s p 细胞的c f e 仅为1 4 - 圭i 2 ，二 一州葛寄葛a+ 者差异显著俨 0 0 5 ) 。( 图6 ) ab 2 0 0 ：暑0 ：s 0 毒：o ：o 暑：。 分 j5 0 4 0 图6 s p 和n o n - s p 细胞克隆形成能力结果，s p 细胞相对于n o n - s p 细胞形成的克隆体积大数量多，p o 0 5 6 、s p 细胞具备较强侵袭能力 为了鉴定s p 细胞与n o n - s p 的侵袭能力，我们进行了t r a n s w e l l 侵袭实验，结 果提示s p 细胞相对于n o n - s p 具备更强的侵袭能力。分别计数s p 细胞及n o n - s p 细胞在2 4 h 时穿过基底膜的细胞数，结果发现2 4h 时s p 细胞穿过基底膜的平均 细胞数( 6 0 7 5 ) 远远多于转染n o n - s p 细胞( 2 0 1 3 ) ，这提示s p 细胞具备较强侵 袭能力，具备肿瘤干细胞特性。( 图7 ) ab 一- 一 图7 t r a n s w e l l 结果表明，s p 细胞穿过基膜的细胞数却明显多于n o n s p 细胞穿过基膜的细胞数，p 0 0 5 7 、s p 细胞具备较强致瘤能力 裸鼠体内成瘤实验是证明肿瘤干细胞特性的一个重要依据。收集分选后的s p 和n o n - s p 细胞重新进行仔细计数，将细胞重悬于2 0 0 0 1p b s 缓冲液中，细胞总数 分别为5 x1 0 4 ，于小鼠右侧腋窝下进行皮下注射，细胞每种剂量设立3 只小鼠作为 重复，每周两次反复观察小鼠成瘤情况。于注射后第8 天发现，s p 细胞组基本上 都有肿瘤形成，图8 a 为典型的荷瘤小鼠外观；而n o n - s p 细胞注射组注射后第1 5 ：7囊墨7枷0秘踏汐，触-冬一。0；_ 嚣搿。l一一陵 狮 狮 啪 m 一 叠0|，j-ijl 天有肿瘤形成；注射2 8 天后，s p 细胞组3 只小鼠中均形成肿瘤，而n o n - s p 细胞 注射组仅有1 只鼠形成肿瘤，且肿瘤体积明显小于n o n - s p 组。至第4 周时，将小 鼠用断颈法处死，剥离肿瘤组织，部分浸泡入1 0 福尔马林中固定做病理检查用， 经过h & e 染色表明s p 和n o n - s p 细胞注射后形成的肿瘤都是典型的肺腺癌( 见图 8b ) 。 a b 图8 裸鼠成瘤实验结果以及h & e 染色结果于注射后第8 天发现，s p 细胞组基本上都有肿瘤形成，图8 a 为典型的荷瘤小鼠外观；而n o n - s p 细胞注射组注射后第1 5 天有肿瘤形成；注射2 8 天后，s p 细胞组3 只小 鼠中均形成肿瘤，而n o n - s p 细胞注射组仅有1 只鼠形成肿瘤，且肿瘤体积明显小于n o n - s p 组。图8 1 3 经过 h e 染色表明s p 和n o n - s p 细胞注射后形成的肿瘤都是典型的肺腺癌。 讨论 近年来，人们对干细胞的研究加深了对肿瘤发生、发展的认识，提出了肿瘤 的干细胞起源学说。根据肿瘤干细胞理论，肿瘤细胞具备等级性，仅有小部分肿 瘤细胞具备干细胞特征【2 】。之后，研究者从各种来源的肿瘤及肿瘤细胞系中，证 实了c s c 的存在，并对其生长特性、表面标志、与肿瘤复发和转移的关系及其相 关的信号转导途径等方面进行了深入的研究。最近研究证实：具备高侵袭性和致 瘤能力的c s c 与肿瘤的转移起始密切相关 2 8 9 1 。这就为肿瘤的临床治疗树立了新 的靶点，而对c s c 的研究也成为目前肿瘤研究中的前沿课题。 5 - f u 是一种细胞周期特异性药物，通过抑制d n a 合成进而干扰细胞分裂增 殖。我们通过m t t 实验证实：5 - f u 可以抑制肺腺癌细胞系s p c a 1 细胞增殖， 半数抑制浓度1 0 0 1 t g m l 。进一步细胞周期分析发现：i c 5 0 的5 f u 作用于肺腺癌 细胞系后，s 期细胞比例从3 3 1 4 减少至1 8 2 0 ，g o g l 期细胞比例从5 8 4 6 增 加至7 6 6 8 。这提示：5 f u 主要作用于增殖期细胞，而c 0 6 l 期细胞对于5 - f u 并不敏感。研究表明9 5 以上的造血干细胞和表皮干细胞都位于g o 期，提示g o 期细胞中富含干细膨3 0 。2 1 。此外，处于静止状态的c s c 对于化疗药物不敏感，可 躲避化疗损伤【3 3 1 。越来越多的实验已经证实：可以通过化疗药物处理富集肿瘤干 细胞，例如，联合采用多柔比星，顺铂，依托泊苷富集肺癌中c s c e 2 6 1 ，利用多柔 比星富集乳腺癌干细胞【3 4 1 ，利用5 一f u 富集结肠癌中c s c t 3 5 】等。最近研究证实 o c t 3 4 ， n a n o g 和s o x 2 表达于5 f u 诱导的气管损伤修复过程的g o 期细胞中， 这些细胞被认为是参与修复的气管干细胞【3 6 ，3 7 1 。基于上述依据，我们利用5 - f u 富集肺腺癌细胞系s p c - a 1 中肿瘤干细胞。 关于肺癌干细胞的标记物一直争议不断，近几年关于肿瘤干细胞分子标记的 研究时有报道，但是至今真正的为大家普遍接受的分子标记一直未曾找到。c d l 3 3 ， 是一种五次跨膜蛋白，被证实为在肝癌【3 8 】、前列腺【”l 、结肠癌【4 0 1 、脑部肿瘤【4 1 1 的干细胞膜中存在，当然在正常组织的干细胞中也存在，之前被认为是多种肿瘤 中c s c 的标记物。e r a m 0 1 4 2 】等发现c d l 3 3 + 肺癌细胞具备多种干细胞特性，如较强 自我更新和多分化能力。而m e i l d 4 3 】及其同事证实c d l 3 3 + 和c d l 3 3 细胞具备相同 的克隆形成能力，自我更新，分化和侵袭能力，及耐受化疗药物能力，提示仅凭 c d l 3 3 + 尚不能作为分选肺癌中c s c 的标记物。 o c t 3 4 是维持干细胞未分化状态的关键基斟辑4 5 1 ，最近在人类胚胎细胞癌， 精原细胞瘤，和膀胱癌【4 6 。5 0 】中证实了o c t 3 4 的表达。c h i o uf 5 l 】等证实o c t 3 4 在维 持口腔鳞癌中c s c 自我更新能力发挥了重要作用，c h e i l 【5 2 】等发现c d l 3 3 + 肺癌细 胞的侵袭能力，克隆形成能力和耐受化疗能力均与o c t 3 4 基因表达有关。而且 o c t 4 通过调控干细胞多重潜能在细胞分化过程中发挥了主要开关的作用。敲除 c d l 3 3 + 肺癌细胞中o c t - 4 基因，c d l 3 3 + 干细胞球形成能力下降，更容易向c d l 3 3 肺癌细胞分化。半数抑制浓度5 - f u 作用于肺腺癌细胞系后，干细胞标记物o c t 3 4 和s o x 2 表达逐渐增强，提示5 - f u 杀灭了大部分已分化肺癌细胞而干细胞样的细 胞数目增加了。我们首次发现5 - f u 可以诱导干细胞标记物o c t 3 4 的表达。s o x 2 是对于哺乳动物胚胎早期发育和维持干细胞多分化潜能致关重要的转录因子，此 外研究还表明s o x 2 在多种实体肿瘤中高表达，人类肺癌中也证实了其高表达【2 2 2 3 】 o 研究人员已经发现，来自许多正常组织【5 3 划和一些肿瘤组织”1 8 t5 5 1 的侧群细 胞具有干细胞的特点。h o 等【1 8 】从6 种肺癌细胞系( h 4 6 0 ，h 2 3 ，h t b 5 8 ，a 5 4 9 ， h 4 4 1 ，h 2 1 7 0 ) 中分离出了侧群细胞，并证实其具备多种c s c 特性。 我们的研究发现，5 - f u 作用于s p c a 1 细胞2 4 h 和4 8 h 后侧群细胞比例从 1 3 ，分别增加至4 8 ，8 0 ，与干细胞标记物o a 3 4 和s o x 2 的表达上调一致。 研究表明a b c g 2 是维持s p 表型和肿瘤耐药的关键因素，可通过胞膜转运机制将 化疗药物转运至细胞外保护干细胞免受放化疗损伤56 5 7 1 。我们通过w e s t e m b l o t 证实5 f u 作用于s p c a 1 细胞后，a b c g 2 的表达上调，与s p 细胞比例增加一致。 同其他研究者一样【1 4 。8 1 ，我们发现s p 细胞相对于非s p 细胞具备显著的c s c 特性，体外具备较强集落形成能力，体内具备较强致瘤能力。集落形成实验是检 测单个细胞增殖能力的有效方法，实验结果表明：s p 细胞相对于非s p 细胞可在较 短时间内形成较大克隆。我们还发现s p 细胞相对于非s p 细胞具备较强的侵袭能 力，提示s p 可能与肺癌的侵袭密切相关。体内致瘤能力被认为是c s c 的重要特 性之一，裸鼠体内致瘤实验表明：s p 细胞成瘤率和成瘤体积都显著高于非s p 细 胞。通过以上的实验我们发现s p c a 1 中的s p 细胞具有干细胞的一系列特性：较 强的增殖能力、克隆形成能力和较强的成瘤能力，鉴于这些特性我们考虑此类细 胞为肺癌细胞系s p c - a 1 中的肿瘤干细胞样细胞。 由于高表达a b c g 2 ，s p 细胞还具备较强的耐受化疗能力，与肿瘤的复发密 切相关。化疗药物，如5 - f u ，可以通过干扰d n a 合成杀灭大部分肿瘤细胞，但 是，5 - f u 对于耐受化疗的c s c 却效果甚微，反而起到富集的作用。目前大量的 理论和实验表明肿瘤干细胞可能与耐药性密切相关，a b c 转运体的表达是细胞对 化疗药物耐受的一个重要机制，也成为阻碍癌症治疗成功的主要障碍。 大量实验数据已经证实：c s c 与肿瘤的形成复发转移密切相关。c s c 理论或 2 7 许可以解释传统致瘤方案可以使肿瘤体积缩小，但是往往伴有复发【5 引，并不能从 根本上治愈。研究表明：耐药细胞和c s c 存在一定的重叠【2 6 1 ，发现传统化疗后残 存的乳腺癌细胞富含干细胞样亚科5 9 1 ，z h a n g 等【删发现5 f u 可富集白血病细胞系 k g 1 中c d 3 4 + c d 3 8 。的干细胞亚群。我们的研究发现，尽管5 f u 可杀灭大部分 增殖期肺腺癌细胞，具备较强致瘤能力和侵袭能力的干细胞样s p 细胞的比例反而 增加了。体外侵袭实验和裸鼠致瘤实验表明，s p 细胞相对于n o n s p 具备将强的 侵袭转移能力和致瘤能力，具备肿瘤干细胞特性。我们猜测，5 - f u 作用于肺癌细 胞后，杀灭了大部分增殖期细胞，而o c t 3 4 阳性的肺癌干细胞所占的比例反而增 加了，这些结果为进一步深入研究肺癌的耐药和复发提供了依据。 最近有学者证实w n t 信号通路参与了人类肿瘤干细胞自我更新和致瘤能力的 维持。d e n g 掣6 1 】发现5 f u 可上调c d l 3 3 + 结肠癌细胞中w n t 的活性，阻断w n t 活性后可逆转c d l 3 3 + 细胞对5 f u 的敏感性。y i n g t e n g 等【6 2 】发现i b - c a t e n i n 和o c t 3 4 高表达于耐受顺铂的a 5 4 9 细胞，w n t 通路在调控干细胞标记物o c t 3 4 的表达中 发挥了关键作用。w n t 通路在s p c - a 1 细胞系c s c 的富集过程中是否发挥了同样 作用还有待于进一步研究。 综上，我们的研究证实：尽管大部分已分化肺癌细胞对于5 - f u 敏感，但是具备 较强侵袭和致瘤能力的c s c 数量反而增加了。基于上述结果，我们认为在制定临 床化疗方案时应充分考虑到肿瘤干细胞的作用，关于肺癌干细胞及其具体耐药机 制还有待于进一步探究。 论 l 、5 - f u 作用于肺腺癌细胞s p c - a 1 ，干细胞标记物o c t 3 4 ，s o x 2 表达增强，侧 群细胞比例增加 2 、5 - f u 不能有效杀灭肺腺癌细胞s p c a 1 中的肿瘤干细胞，反而起到富集作用 本研究创新性的自我评价 本研究首次阐明5 - f u 不能有效杀灭肺腺癌细胞系s p c a 1 中的肺癌干细胞， 反而起到富集作用，可能与化疗后复发有关 2 9 参考文献 1 a j e r n a l ，r c t i w a e i ，t m u r r a y , e ta 1 ，c a n c e rs t a t 。，c a n c e rj ，c l i n2 0 0 4 ；5 4 ：8 - 2 9 2 r e y at , m o r r i s o ns j ，c l a r k em e w e i s s m a ni l s t e m c e l l s ，c a n c e r , a n d c a n c e rs t e m c e l l s n a t u r e ，2 0 0 1 ；4 1 4 ：1 0 5 1 1 1 3 d b o n n e t ，j e d i c k ，h u m a na c u t em y e l o i dl e u k e m i ai so r g a n i z e da sah i e r a r c h yt h a to r i g i n a t e s f r o map r i m i t i v eh e m a t o p o i e t i cc e l l , n a t m e d 3 ( 19 9 7 ) 7 3 0 - 7 3 7 4d a l e r b aed y l l as j ，p a r ki k , e ta 1 p h e n o t y p i cc h a r a c t e r i z a t i o no fh u m a nc o l o r e c t a lc a n c e r s t e mc e l l s p r o cn a i la c a ds c iu s a ；1 0 4 ：1 0 1 5 8 - 6 3 5p r i n c em e ，s i v a n a n d a nr ，k a c z o r o w s k ia ，e ta li d e n t i f i c a t i o no fa s u b p o p u l a t i o no fc e l l s w i t hc a n c e rs t e mc e l lp r o p e r t i e si nh e a da n dn e c ks q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a p r o cn a i la c a d s c iu s a 2 0 0 7 ；1 0 4 ：9 7 3 - 8 6 o b r i e nc a ，p o l l e ra ，g a l l i n g e rs ，d i c kj e ah u m a nc o l o nc a n c e rc e l lc a p a b l eo fi n i t i a t i n g t u m o u rg r o w t hi ni m m u n od e f i c i e n tm i c e n a t u r e2 0 0 7 ；4 4 5 ：1 0 6 - 1 0 7 a 1 - h a l m ，w i c h am s ，b e n i t o h e r n a n d e za ，m o r r i s o ns j ，c l a r k em ep r o s p e c t i v e i d e n t i f i c a t i o no ft u m o r i g e n i cb r e a s tc a n c e rc e l l s p r o cn a t la c a ds c iusa 2 0 0 3 ；1 0 0 ：3 9 8 3 - 8 8 c o l l i n sa t , b e r r yp a ，h y d ec ，e ta 1 p r o s p e c t i v ei d e n t i f i c a t i o no f t u m o r i g e n i cp r o s t a t ec a n c e r s t e mc e l l s c a n c e rr e s ，2 0 0 5 ，6 5 ( 2 3 ) ：1 0 9 4 6 - 1 0 9 5 1 9 w a n gj , g u ol p , c h e nl z ，z e n gy x ，l us h i d e n t i f i c a t i o no fc a n c e l s t e mc e l l 1 i k es i d e p o p u l a t i o n c e l l si nh u m a n n a s o p h a r y n g e a l c a r c i n o m ac e l ll i n e c a n c e rr e s 2 0 0 7 ；6 7 ：3 716 - 3 7 2 4 1 0g o o d e l lm a ，b r o s ekp a r a d i sg , c o n n e ra s ，m u l l i g a nr c i s o l a t i o na n df u n c t i o n a lp r o p e r t i e s o fm u r i n e h e m a t o p o i e t i c s t e mc e l l st h a ta r e r e p l i c a t i n g i nv i v o j e x p m e d 1 9 9 6 ；1 8 3 ：1 7 9 7 8 0 6 11s a r k a d i b ，o z v e g y - l a c z k ac , n e m e tk , v a r a d i a a b c g 2 ：at r a n o n - s p o r t e rf o ra l l s e a s o n s f e b sl e t t2 0 0 4 ；5 6 7 ：116 - 12 0 12z h o us , s c h u e t zj d ，b u n t i n gk d ，c o l a p i e t r oa m ，s a m p a t hj , e ta 1 t h ea b ct r a n o n s p o r t e r b c r p l a b c g 2i se x p r e s s e di naw i d ev a r i