（分析化学专业论文）新型ca2荧光探针stdbt胞质、胞核ca2同时测定研究.pdf

新型c a 2 + 荧光探针s t d b t 胞质、胞核c a 2 + 同时测定研究 李华静 摘要c a 2 + 作为细胞内的第二信使，具有重要的生物学功能。而c a 2 + 的信使功能 是通过细胞内游离c a 2 + 浓度及其分布的时空依赖性变化来实现的，c a 2 + 信号的产生 和终止是细胞内c a 2 + 增减、波动的结果。因此亚细胞水平c a “含量及其分布变化的 动态监测对于c a 2 + 信号传递本质的认识至关重要。其中，细胞核c a “在细胞有丝分 裂、细胞凋亡、基因转录、d n a 转录与修复等活动中发挥着重要的调节作用，因 此细胞核c a “的研究对阐明疾病的发病机理及防治具有重要的意义。目前，细胞内 游离c a 2 + 的研究主要是用荧光探针标记，然后通过荧光显微成像分析来实现的，在 此探针的性能至关重要，探针若不能区分标记特定亚细胞区域，荧光显微镜也就 根本无法得到有关区域的c a 2 + 信息。但迄今为止，还没有可区分性的同时标记胞核 和胞质区域的c a “探针，而常采用将一种探针改性后导入胞核和胞质，这需要对改 性后的探针进行校准，而校准又受到细胞环境的影响，故常无法得到准确的结果， 导致得出相互矛盾的结论，尤其是胞核c a 2 + 和胞质c a “的调节机制研究，尚存在争 议。为此，本论文采用我们实验室自行合成的核、质双标的新型c a 2 + 荧光探针 s t d b t 同时标记胞核和胞质，进行了不同激动剂刺激后胞核c a 2 + 和胞质c a “的同时 测定，探讨了其调节机制，为细胞胞质、胞核c a “信号转导机制研究提供了有意义 的参考。 本论文的研究主要开展了以下几个方面：1 采用激光共聚焦显微术，应用核、 质双标的新型c a 2 + 荧光探针s t d b l r 标记大鼠心肌细胞，探讨了5 h t 诱导大鼠心肌 细胞核【c a 2 + 】。和胞质【c a 2 + 】。动员的机理。2 应用双靶向性新型c a 2 + 荧光探针s t d b t 负载大鼠心肌细胞，结合激光共聚焦显微镜，研究了大鼠心肌细胞胞核【c a 2 + 】。和胞 y 贡 c a 2 + 1 。的调节机制。3 应用新型c a “荧光探针s t d b t 负载大鼠心肌细胞，结合 激光共聚焦显微镜，在亚细胞水平探讨1 g f 1 诱导胞质【c a “ 。和胞核c a “】。升高的 机制。 本研究论文主要包括以下两个部分： 一概述 论文对目前报道过的亚细胞区域( 如：内质网、线粒体、胞核等) c a 2 + 的测定 方法进展和测定研究进展进行了较为详尽的综述。 二：新型c a 2 + 荧光探针s t d b t 胞质、胞核钙同时测定研究 1 5 - h t 诱导大鼠心肌细胞胞核 c a “1 。和胞质 c a 2 + 1 。的动员机制研究 利用新型c a 2 + 荧光探针s t d b t - a m 核、质双标的优良性能，结合激光共聚焦 显微镜研究了5 h t 诱导大鼠心肌细胞胞核【c a “】。和胞质【c a 2 + 】。的动员调节机制。 结果表明5 - h t 通过促进外c a 2 + 内流和内c a “释放来使胞质 c a 2 + 】。升高，且5 一h t 通过5 - h t 2 受体介导i p 3 c a “和d g p k c 双信使途径调节钙池内钙释放，通过l 型 钙通道使外c a 2 + 内流。而在胞核中除核被膜紧邻外周的肌浆网内c a 2 + 释放外，还 可能有核被膜空腔上i p 3 介导的核c a 2 + 库c a “直接释放进入胞核的参与。 2 大鼠心肌细胞胞核 c a 2 + 】。和胞质 c a 2 + 】。的调节机理研究 用新型c a 2 + 荧光探针s t d b t - a m 标记大鼠心肌细胞，结合激光共聚焦技术在 亚细胞水平探讨大鼠心肌细胞受不同激动剂刺激后胞核 c a “】。和胞质【c a “】。的变 化。表明在心肌细胞中胞核【c a “】nn 胞n c a “】。在行使其信使作用时具有相对独 立性，激动剂诱导胞质【c a 2 + 】。升高主要来源于外c a “内流和内c a “释放，而胞核 c a 2 + 1 。的升高主要依赖于内c a 2 + 释放，即核被膜紧邻外周的内c a 2 + 释放和被认为 是核c a 2 + 库的核被膜空腔的内c a 2 + 释放。 3 i g f - 1 诱导大鼠心肌细胞胞核 c a 2 + 】。和胞质 c a 2 + 】。升高的机制研究 用s t d b t - a m 标记大鼠心肌细胞，研究了i g f 1 诱导心肌细胞胞核【c a 2 + 】。和 胞质【c a 2 + 】。升高的机制。结果表明i g f - 1 升高胞质【c a 2 + 】。主要依赖于外c a 抖内流和 内c a 2 + 释放，而胞核【c a “1 。的升高主要来源于l p 3 介导的被认为是核c a 2 + 库的核被 膜空腔的内c a “释放。 关键词：钙荧光探针s t d b t 5 - h t1 g f 一1心肌细胞 胞核【c a 2 + 】。 胞质【c a 2 + 。 s i m u l t a n e o u s s t u d ya n d m e a s u r e m e n to fn u c l e a rc a 2 + a n d c y t o s o l i cc a 2 + w i t hn e wc a l c i u mf l u o r e s c e n tc a 2 + p r o b es t d b t h u a j i n g l i a b s t r a c tc a l c i u ma c t s a sa ni n t r a c e l l u l a rs e c o n d m e s s e n g e ra n dp l a y s a v e r y i m p o r t a n tr o l e i n b i o l o g i c a ls y s t e m s t h ec o n c e n t r a t i o nc h a n g ea n ds p a t i o t e m p o r a l d i s t r i b u t i o no fi n t r a c e l l u l a rc a “c o n t r i b u t et oi t s m e s s e n g e rf u n c t i o n ，a n d t h e c o n c e n t r a t i o n c h a n g e o fi n t r a c e l l u l a rc a “c a np r o d u c ea n ds t o pc a l c i u m s i g n a l c o n s e q u e n t l y i t i s v e r yi m p o r t a n t t om e a s u r es u b c e l l u l a rc 一+ c o n c e n t r a t i o na n d s p a l i o t e m p o r a l d i s t r i b u t i o nf o r u n d e r s t a n d i n g c a l c i u m s i g n a l a tp r e s e n t ，m o s t m e a s u r e m e n t so fi n t r a c e l l u l a rc a 2 + a r e a c c o m p l i s h e du s i n gp r o b e s a n df l u o r e s c e n t i m a g i n g ，a n dp r o b e sp l a yap i v o t a lr o l e i fp r o b e sc a n n o td i f f e r e n t i a t ea n d l o a ds p e c i a l s u b c e l l u l a rr e g i o n ，f l u o r e s c e n ti m a g i n gc a n n o ta t t a i ns a t i s f i e dc a l c i u mi n f o r m a t i o no f t h es u b c e l l u l a rr e g i o n s of a rt h e r ea r e n tt h ei n d i c a t o r sw h i c ha r ea b l et o t a r g e t t o n u c l e u sa n dc y t o s o l s i m u l t a n e o u s l y p e o p l eu s e d t o t a r g e t c a 2 + 】na n d c a “】cw i t h r e c o m b i n a n t p r o b e sb yt r a n s f e c t i n gw i t hc o m p l e m e n t a r yd n a se n c o d i n gc h i m a e r a s b e a r i n gn u c l e a ra n dc y t o s o h cl o c a l i z a t i o ns i g n a l s b u tt h er e c o m b i n a n tp r o b e sm u s t b e c a l i b r a t e d h o w e v e r , t h ec e l l e n v i r o n m e n t sw i l li n f l u e n c et h ec a l i b r a t i o nr e s u l t s s o p e o p l ea l w a y sg e tm a n y c o n t r o v e r s i a lr e s u l t s i nt h i st h e s i s t h e i n v e s t i g a t i o n s i n c l u d et h e f o l l o w i n gs e v e r a la s p e c t s ：1 c o n f o c a l m i c r o f l u o r e s c e n c ea n dt h en e wf l u o r e s c e n t c a 2 + p r o b es t d b t - a mw e r e u s e dt o i n v e s t i g a t et h em e c h a n i s mo f5 一h y d r o x y t r y p t a m i n o ( 5 - h 1 ) o nn u c l e a r c a l c i u ma n d c y t o s o l i cc a l c i u md y n a m i c si nr a t c a r d i a cm u s c l ec e l l s 2 s t u d yo ft h er e g u l a t i o no f n u c l e a ra n dc y t o s o l i cc a z + i nr a tc a r d i a cm u s c l ec e t t sw i t hd o u b l et a r g e t a b l ep r o b e s t d b t - a m 3 t h en e wf l u o r e s c e n tc a 2 + p r o b es t d b t - a ma n dc o n f o c a lm i c r o s c o p y w e r eu s e dt od i s c u s si n s u l i nl i k e g r o w t hf a c t o r - 1 ( i g f 一1 、- i n d u c e dc y t o s o l i cc a “a n d n u c l e a rc a 2 + d y n a m i cm e c h a n i s m si nc a r d i a cm u s c l ec e l l s t h et h e s i si n c l u d e st w o p a r t s ： 1 r e v i e w m e t h o d sa n d i n v e s t i g a t i o n s f o rt h e s u b c e l l u l a r ( e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m 、 m i t o c h o n d r i a 、n u c l e a re t c ) m e a s u r e m e n t sw e r er e v i e w e di nd e t a i l 2 s i m u l t a n e o u ss t u d yo ft h er e g u l a t i o no fn u c l e a ra n dc y t o s o l i cc a + w i t hn e w f l u o r e s c e n tp r o b es t d b t - a m 2 1 s t u d yo ft h em e c h a n i s m s o f5 - h y d r o x y t r y p t a m i n oo nn u c l e a rc a 2 + a n d c y t o s o l i c c a 2 + d y n a m i c s t h ed o u b l et a r g e t a b l e p r o b es t d b t - a ma n dc o n f o c a lm i c r o s c o p yw e r eu s e d t o i n v e s t i g a t et h em e c h a n i s m so f5 - h y d r o x y t r y p t a m i n o ( 5 - h t ) o nn u c l e a rc a l c i u ma n d c y t o s o l i c c a l c i u m d y n a m i c s i nr a tc a r d i a cm u s c l ec e l l s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t c y t o s o l i cc a 2 + s i g n a l c a nb e o r i g i n a t e d f r o m c a 2 + i n f l u xa n dc a 2 + r e l e a s ef r o m i n t r a c e l l u l a rc a “s t o r e s ，a n d5 一h ta c t sv i a 5 一h t 2r e c e p t o r s ，t h e nt h r o u 【g h5 - h t 2 r e c e p t o r sm e d i a t e di p 3 c a 2 + a n dg c p k c d o u b l es i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y st oc a u s e c a 2 + r e l e a s ef r o mi n t r a c e l l u l a rc a 2 + s t o r e sa n df o l l o w e dc a 2 + i n f l u xp o s s i b l vt h r o u g h l - t y p ec a l c i u mc h a n n e l s w h i l e n u c l e a rc a 2 + s i g n a lc a l lb ec o m e f r o mc a 2 + r e l e a s ei n t h ei m m e d i a t ep e r i n u c l e a rv i c i n i t yo ft h en ea n dc a 2 + f r o mt h el u m e no ft h en e c o n s i d e r e da st h ei p 3m e d i a t e dn u c l e a r c a 2 + p 0 0 1 2 2s t u d yo ft h er e g u l a t i o no fn u c l e a ra n dc y l o s o l i cc a “i nr a tc a r d i a cm u s c l ec e l l s t h ea g o n i s ti n d u c e d 【c a 2 + 】na n d 【c a 2 + 】cd y n a m i c si nr a tc a r d i a cm u s c l ec e l l sw e r e i n v e s t i g a t e d a n dt h em e c h a n i s m so f r e g u l a t i o nb e t w e e n 【c a 2 + 】。a n d 【c a 2 4 】cw e r e d i s c u s s e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t 【c a 2 + 1 nm a yb er e g u l a t e di n d e p e n d e n t l yo f 【c a 2 + c w h e n a g o n i s ts t i m u l a t e dc a r d i a cm u s c l ec e l l s c y t o s o l i cc a 2 + s i g n a lc a nb ef r o mc a 2 + i n f l u xa n dc a 2 + r e l e a s ef r o mi n t r a c e l l u l a rc a “s t o r e s w h i l e n u c l e a rc a “s i g n a lc a nb e d e r i v e df r o mt h ec y t o s o l i cc a 2 + w a v eb yp a s s i v ed i f f u s i o n t h r o u g ht h en p c ，c a 2 + r e l e a s ei nt h ei m i n e d l a t ep e r i n u c l e a r v i c i n i t yo f t h en ea n dc a “r e l e a s ef r o mt h el u m e n o ft h en ec o n s i d e r e da st h en u c l e a rc a 2 + p 0 0 1 2 3 s t u d yo ft h ei n s u l i n l i k e g r o w t hf a c t o r - l ( i g f 一1 1 一i n d u c e dc y t o s o l i cc a “a n d n u c l e a rc a 2 + d y n a m i cm e c h a n i s m s t h en e wf l u o r e s c e n tc a “p r o b es t d b t - a ma n dc o d f o c a lm i c r o s c o p yw e r eu s e dt o d i s c u s st h ei n s u l i nl i k eg r o w t h f a c t o r - i ( i g f 一1 、- i n d u c e dc y t o s o l i cc a 2 + a n dn u c l e a rc a 2 + d y n a m i cm e c h a n i s m si nc a r d i a cm u s c l ec e l l s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc y t o s o l i cc a ” s i g n a lc a nb eo r i g i n a t e df r o mc a 2 + i n f l u xa n dc a 2 + r e l e a s ef r o mi n t r a c e l l u l a rc a 2 + s t o r e s a n dn u c l e a rc a 。+ s i g n a lm o s t l yc o m ef r o mc a 2 + r e l e a s ef r o mt h el u m e no ft h en e c o n s i d e r e da st h ei p 3m e d i a t e dn u c l e a r c a 2 + p 0 0 1 k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n tc a 2 + p r o b es t d b t , 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n o ，i n s u l i nl i k e g r o w t hf a c t o r 一1 ，c a r d i a cm u s c l ec e l l s ，n u c l e a rc a 2 + ，c y t o s o l i cc a 2 + i v 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 作了明确说明并表示谢意。 作者签名 学位论文使用授权声明 日期 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索； 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名日期 第一章概述 1 1 引言 钙是维持人体生命活动的重要元素之一，c a 2 十是生物体内最广泛而又最重要的 信息传递物质之一。c a 2 + 作为细胞内的信息传递物质，它起着调节许多重要细胞功 能的作用，如肌肉兴奋收缩、细胞运动以及细胞分化和增殖、血管紧张度调节、 神经冲动传导等。作为第二信使，c a 2 十还参与生物信号的跨膜传递，维持神经、肌 肉的正常兴奋性，并介导细胞对外界刺激的应答反应等。c a 2 + 不仅在细胞代谢反应 中起第二信使作用，同时也参与或协调其它第二信使的代谢，调节众多的生理和 代谢过程，并参与诸如缺血再灌注损伤等多种病理过程。随着人们对于钙代谢、 钙通道、钙受体及其调控，钙的转运和利用以及某些疾病发生和发展关系的认识 越来越深入，胞内c a “的研究已成为化学、生物学、基础和临床医学等学科重要的 前沿热点课题【1 5 j 。 1 2 胞内c a 2 + 的分布及其信使作用 通常细胞钙( 总钙) 以结合态和自由离子态( c a “) 两种形式存在。只有处于 自由离子状态的游离c a 2 + 才具有生理活性，而游离c a 2 + 又分为细胞夕l - c a 2 + 和细胞内 c a “。一般认为，大多数细胞外钙约5 0 一6 0 是结合钙，游离c a 2 + 浓度在1 0 0 1 0 0 0 , u m o l l 左右。细胞内钙贝j 9 9 9 以结合钙的形式存在，且分布也极不均匀。细胞内 钙总浓度约为1m m o l l ，有5 0 存在于细胞核。许多被称为“钙库”的细胞器，如内 质网、线粒体等，其钙含量很高，其游离c a 2 + 浓度也较胞质高。按占细胞钙含量百 图1 , 1 细胞游离钙分硝i 示意图 分数的多少排列，其分们情况是：线粒体占3 0 ，浓度为0 6m m o l l ：内质网占1 4 ，约0 2 8m m o l l ；质膜( 夕h 层) 占5 ，约0 1m m o l l ；而细胞溶质中钙仅占总钙 的0 5 ( 结合态) 或0 0 0 5 f 离子态) 。细胞在静息( 非激活) 状态时，胞质c a “ 浓度存0 1 m o l l 左右。如图1 1 所示。 由图1 1 可见，细胞c a “的分布是极不均匀的，细胞内外之间以及胞内各细胞器 与胞质之间均存在较大的浓度梯度。因此，当一种到达细胞表面的刺激，使少量 的胞# f 、c a 2 + 进入细胞溶质时，就令细胞溶质c a “浓度大幅度增加，产生钙信号。同 样，当细胞钙库受到刺激时，钙库c a 2 + 就释放至细胞溶质，使细胞溶质内的c a 2 + 浓度增高，这是钙信号产生的另一重要途径。胞质内的c a 2 + 浓度大幅度增加，继而 与一些能够与c a “高度亲和的蛋白质或酶结合，使其激活，引发细胞一系列生理、 生化反应，从而起到传递胞外信号的作用。由此可见，c a 2 + 的信使功能是通过调控 细胞内游离c a “浓度及其分布来实现的，c a “信号的产生和终止是细胞内c a 2 + 增 减、波动的结果。 图1 2 细胞膜c a 2 + 信号转导途径 c a 2 + 信号的传导途径主要是跨越质膜的外c a 2 + 内流和外排，以及胞内诸细胞器 的内钙释放和泵入f 6 】。( 1 ) 质膜的外c a 2 十内流和外排：c a 2 斗从胞外内流进入胞内主 要是通过质膜c a 2 + 通道( 如图1 2 所示) ，离子通道是一种膜结合蛋白，它通过构象 变化呈开放或关闭状态，从而控制c a “流动。目前已知的质膜c a 2 十通道根据操纵启 闭的上游调控因子主要分为电压门控钙通道、激动剂一受体门控钙通道、机械操 纵性钙通道和钙库操纵钙通道等四类。当受到通道激动剂的刺激后，通道就会打 开，使胞p b c a 2 + 内流，胞质c a “浓度升高。但当细胞溶质中c a 2 + 的浓度过高时，就 会对细胞有害，甚至使细胞死亡，所以必须有c a “外排系统将胞质钙返回静止状态。 质膜上就存在有普遍存在的高亲和力低容量的c a 2 + 泵( c a 2 + - a t p 酶) 和主要存在于 可兴奋性细胞中的低亲和力高容量的n a + 一c a 2 + 交换器这两个c a 2 + 转移系统，可将 c a “排至胞外，从而终止强而持续的c a “信号。( 2 ) 胞内钙库的内钙释放和泵入： 细胞中内质网、线粒体等胞内钙库主要是通过l p 3 受体钙通道和r y r 受体钙通道来 释放c a “的( 如图1 3 所示) ，近年来还发现烟酸腺苷二磷酸( n i c o t i n i ca c i da d e n i n e d i n u c l e o t i d e ，n a a d p ) ，也可引起胞内钙库释放c a 2 + 。当胞质中出现钙超载时，内 质网就会通过内质网或肌浆网膜上的钙泵依靠水解a t p 将细胞溶质c a 2 + 逆浓度梯 度泵入内质网；线粒体则依靠存在于膜上的蛋白质使c a 2 + 顺电位梯度向内移动。内 质网对细胞内c a “起着灵敏而快速的调节作用，线粒体则起着持久的、大容量的调 节作用。 钙信号要准确传递各种复杂信息，不是简单的c a 2 + 浓度变化所能完成的，钙信 号还具有时空多样性。首先，对于大多数细胞，胞内c a 2 + 升高并非是单一性持续 图1 3 细胞器c a 2 + 信号转导途径 增加，而是波动性升高，周期性出现c a “峰，称为c a “振荡( c a l c i u m o s c i l l a t i o n ) ， c a 2 + 振荡体现了整体钙信号的时间性i 训。此外，在钙动员信使或环境刺激处于低水 平时，使一些单个钙通道开放而形成的称之为脉冲( b l i p s ) 和夸克( q u a r k s ) ，以 及由一组邻近的钙通道一起协同开放而形成的钙火花( s p a r k s ) 和钙团( p u f f s ) ， 通称为钙信号的基本单位( e l e m e n t a r yu n i t s ) 或称基本事件( e l e m e n t a r ye v e n t s ) 。 基本单位钙信号首先形成空间限制的局部钙信号，而足够数量的基本单位钙信号 协同作用又可形成整体信号( g l o b a ls i g n a l ) 。在一些细胞，局部c 2 + 释放形成热斑， 达到一个闽值后，这些热斑突然变成全有一全无的钙跃升反应并扩散形成环形或 螺旋形的波“钙波( c a l c i u mw 州c ) ”，钙波是出从一个钙库扩散到另一个钙库的 c a 2 + 释放，或被称之为c a “诱导的c a 2 + 释放( c a l c i u mi n d u c e dc a l c i u mr e l e a s e ，c i c r ) 而产生的。钙波也可通过胞间联系到达相邻细胞，钙波体现了c a 2 + 信号的空间性 质f 8 1 。 由此可见，c a “行使其胞内信使作用是通过胞内不同区域游离c a 2 + 含量及其分 布的时空依赖性变化而实现的。因此亚细胞水平的c a “含量及分布变化的动态监 测对于c a 2 十信号传递本质的认识具有十分重要的意义。即要求细胞c a 2 + 测定不仅 能提供全细胞c a 2 + ( g l o b l ec y t o s o l i cf r e ec a 2 + ) 的信息，更能够提供有关c a “亚细胞 区域的彼此独立又相互关联的信息，诸如胞质、胞核、线粒体、内质网、高尔基 体等n 从2 0 世纪5 0 年代起，先后建立和发展了多种测定细胞内c a 2 + 的方法，如钙有机 显色剂法、钙离子传感器法、核磁共振法、微电极法和c a 2 + 荧光探针法等，其中 c a “荧光探针法是目前最常用的一种方法。 1 3c a “荧光探针法 c a “荧光探针法是近年来发展起来的一类钙离子浓度测定方法，其原理是采用 一些能与钙离子特异结合的荧光分子，这些分子与钙离子结合后，其光学性质发 生变化，在一定波长的光激发下发出特定波长的荧光，荧光强弱与溶液中的钙离 子浓度成一定的相关性，因此可以通过测定荧光强度来反映细胞中钙离子的浓度。 c a “荧光探针法包括发光蛋白法和小分子c a 2 + 荧光探针法。 1 3 1 发光蛋白法 发光蛋白主要包括c a “激活生物发光蛋白和基因重组发光蛋白。 ( 1 ) c a 2 + 激活生物发光蛋白：1 9 6 2 年，s h i m o m u r a l 9 l 等从多管水母f a e q u o r i a v i c t o r i a ) 中分离出一种蛋白质一水母发光蛋白( a e q u o r i n ) 。1 9 6 7 年，r i d g w a y 年ha s h l e y 用该蛋白首次成功地应用于活细胞内【c a 2 + 】i 的测定。水母蛋白与c a 2 + 结合后发射 蓝色荧光( , 1 6 5n m ) ，在0 1 1 0 p m o l l c a 2 + 浓度范围内，荧光强度与c a 2 + 浓度成正 比，是目前应用较广的一种c a 2 + 荧光探针1 1 1 - 1 5 j 。 水母发光蛋白有许多优点：( 1 ) 该蛋白对细胞无毒性，故不会影响细胞的正常 生长发育；( 2 ) 它是一种高负电性蛋白，没有区域化现象，也不会渗出细胞【1 ”。( 3 ) 由于测量时不需要强光照射，因此不会出现光漂白现象和白发荧光干扰等问题。 ( 4 ) 利用基因工程技术合成的一些具有较好靶向性的该蛋白质的突变体，可以用于 亚细胞器内的游离c a 2 + 浓度的测赳1 7 。23 1 。但水母发光蛋白的不足之处在于高浓度 c a 2 + 会使其不可逆转的失活1 5 】，所以不能用来测定浓度较高的某些亚细胞器中的游 离c a 2 + 浓度，如内质网【2 4 1 ；发射的荧光太弱( 平均每6 个水母蛋白分子结合1 2 个 以上c a 2 + ，仅发射一个光子) ，使得成像很困难；使用时必须要加入肠腔素 ( c o e l e n t e r a z i n e ) 这种辅副5 , 2 4 】。此外，在基因重组过程中也会遇到很多困难，如 在基因转染时，一些细胞系就抵制基因转染：转染过程繁杂费时，且细胞经过基 因转染后需放置一段时间才能进行c a “浓度测定，这对于一些急性分离的细胞是 很不适用的1 。j 。 ( 2 ) 基因重组发光蛋白：以绿荧光蛋白( g t e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 为基 础的基因重组发光蛋白是近年来研究非常活跃的一个领域【5 ，簿2 ”。1 9 9 7 年n a t u r e 报道了r y t s i e n 在这方面的代表性工作基因重组g f p 突变体“c a m e l e o n s ”，即基 于c a “水平依赖的两发光蛋白之间的荧光共振能量转移( f r a n 3 ，构建了中心为钙 调蛋白及m 1 3 多肽，两边分别为发光蛋白c f p 和y f p ，并在一端插入某细胞器靶 位的信号肽序列的“三明治”式重组d n a 序列，转染受体细胞，即可在细胞内表达 出亚细胞区域定位的、对c a 2 + 响应的发光蛋白。使用不同的细胞器信号序列构建 的系列“c a m e l e o n s ”已成功应用于h e l a 细胞胞质、胞核、内质网等区域c a “的检测。 基因重组发光蛋白为亚细胞区域c a “的测定开辟了光明的发展前景，它是目前 测定亚细胞游离c a 2 + 的最常用的方法1 3 0 l 。基因重组发光蛋白克服了水母发光蛋白的 许多缺点，如c a “诱导的荧光响应是可逆的；不需要外加特别的辅基；发射的荧光 较强，可以采用普通的激光共聚焦显微镜和多光子荧光显微镜来成像等饩”。此外， 该探针可进行细胞内c a 2 + 的比例分析，使得对c a 2 + 的灵敏性及其与c a “的结合动力 学均不再受探针浓度的影响1 3 1 1 。但该探针也有许多缺点：( 1 ) 其与c a 2 + 结合导致的 荧光强度变化幅度较小( r m a x r r a i n 1 0 0 。( 2 ) 对d h 较为敏感【2 4 32 1 。( 3 ) 对c a “含量瞬变的响应迟 缓且不灵敏。( 4 ) 该蛋白在某些细胞或细胞器中难于表达，因为蛋白在3 7 。c 时折 叠和重组非常困难1 2 。( 5 ) 用该蛋白标记细胞时，手续繁杂，耗费时间太长，故 不适用于急性分离细胞的测定。 综上所述，发光蛋白c a 2 + 探针的成功构建解决了c a 2 + 探针的亚细胞区域定位标 记问题，但发光蛋白对c a 2 + 含量瞬变的响应迟缓且不灵敏【2 7 】：探针自身在细胞内 有附加生理活性；发光波长极为有限；特别是他们为基因重组蛋白，需要先构建 获得目的基因，随后标记细胞时又需采用基因转染的手段，手续特别繁杂，耗时 又费力，且不能用于急性分离细胞的测定【4 】口所有这些都严重制约着该类探针的广 泛应用，因此发光蛋白c a 2 + 探针未能够发展成为一类人们普遍采用的细胞c a 2 + 测 定探针。 1 3 2 小分子c a 2 + 荧光探针法 该方法可无损伤导入细胞、对c a “选择性高、响应迅速且能与现代先进的荧光 成像技术联用，是目前应用最广泛的测定胞内c a 2 + 浓度的方法。 目前常用的小分子c a 2 + 荧光探针主要是由美籍华裔科学家t s i e n 等合成的- - , i t 小分子c a 2 + 荧光探针及其类似物。 1 9 8 2 年美籍华裔科学家t s i e n 等合成了第一代c a 2 + 荧光探针q u i n 1 、q u i n 2 、 q u i n 3 1 3 3 i 。 1 9 8 5 年，第二代c a 2 + 荧光探针出现，包括f u r a i 、f u r a 2 、f u r a 3 、i n d o 1 t 3 4 1 ， 其中f u r a 一2 最好。 1 9 8 9 年，第三代c a 2 + 荧光探针f l u o 一3 出现【3 3 1 。 后来，在此基础上还衍生出许多c a 2 + 荧光探针。但均系在具有c a 2 + 配位功能的 b a p t a 或其类似物的母体上连接不同的荧光发色团而得到的。根据激发波长的不 同，可将其分为紫外光激发和可见光激发的c a 2 + 荧光探针。 ( 1 ) 紫外光( u v ) 激发的c a 2 + 荧光探针 表1 1 列出了常用紫外光激发的c a 2 + 荧光探针的基本参数。 表1 1 常_ j 紫外光激发的c a 2 + 荧光探针的基本参数 i n d i c a t o rc a 2 + f r e ef e x e m )c a 2 + b o u n df e x e m ) k d ( n m ) f u r a 2 3 6 3 5 1 23 3 5 ，5 0 5 1 4 5 i n d o 一1 3 4 6 f 4 7 53 3 0 4 0 12 3 0 b i s - f u m23 6 6 5 1 l 3 3 8 5 0 4 3 7 0 o u i n 23 5 3 4 9 5 3 3 3 4 9 5 6 0 l n d o 1 f f3 4 6 4 7 5 3 3 0 4 0 1 3 3 0 0 0 f u r a 一2 f f3 6 0 5 0 5 3 3 5 5 0 5 3 5 ，0 0 0 n d op e 33 4 6 4 7 53 3 0 ，4 0 8 2 6 0 f u r ap e 33 6 4 5 0 8 3 3 5 5 0 0 2 5 0 c l b - f u r a2 3 6 5 5 0 13 3 8 4 9 4 1 5 0 b t c4 6 4 5 3 3 4 0 1 5 2 97 ，0 0 0 m a g - i n d o1 3 4 9 4 8 03 2 8 3 9 03 5 ，0 0 0 m a g f u r a2 3 6 9 5 1 13 2 9 5 0 82 5 ，0 0 0 m a g - f u r a5 3 6 9 5 0 53 3 0 5 0 02 8 。0 0 0 f i p l 83 4 6 5 0 23 3 5 4 9 54 5 0 f f p l 83 6 4 4 7 53 3 5 4 0 84 0 0 b e n z o t h i a z a 13 6 8 4 7 03 2 5 4 7 06 6 0 b e n z o t h i a z a - 23 6 8 ，4 7 03 2 5 4 7 0 1 ，4 0 0 ( 2 ) 可见光激发的c a 2 + 荧光探针 表1 2 列出了常用可见光激发的c a 2 + 荧光探针的基本参数。 表1 2 常用可见光激发的c a 2 + 荧光探针的基本参数 c a “f r e ec a 2 + b o u n d i n d i c a t o r k d ( n m ) f e x e m )( e x 九e m ) f 1 0 0 - 35 0 3 ，5 2 65 0 6 5 2 63 9 0 f i u o - 44 9 14 9 4 ，s 1 63 4 5 f i u o - 5 n4 9 14 9 4 5 1 69 0 0 0 0 f 1 u o 3 f f5 0 6 ，5 2 65 1 5 ，5 2 6 4 1 ，0 0 0 f 1 d o l r5 0 6 ，5 2 55 0 6 5 2 55 5 0 m a g - f l u o - 4 4 9 0 4 9 3 5 1 62 2 ，0 0 0 c a l c i u mg r e e n 15 0 6 - 5 3 15 0 6 5 3 11 9 0 c a l c i u mg l e e n 25 0 6 5 3 65 0 3 5 3 65 5 0 c a l c i u mg r n5 n5 0 6 朽3 25 0 6 5 3 21 4 ，0 0 0 c a l c i u m o r a n g e 5 4 9 5 7 55 4 9 5 7 6 1 8 5 c a l c i u m o r a n g e5 n 5 4 9 5 8 25 4 9 5 8 22 0 ，0 0 0 c a l c i u mc r i m s o n5 9 0 ，6 1 55 8 9 6 1 51 8 5 o r e g o ng r e e nb a p t a 4 8 8 14 9 4 5 2 34 9 4 5 2 3】7 0 7 o r e g o ng r e e nb a p t a 4 8 8 - 2 4 9 4 5 2 34 9 4 5 2 35 8 0 o r e g o ng r e e nb a p t a 4 8 8 5 n 4 9 4 5 2 14 9 4 5 2 12 0 ，0 0 0 f u r a r e d 4 7 2 6 5 74 3 6 6 3