（园林植物与观赏园艺专业论文）百合鳞茎低温解除休眠过程中生理生化变化研究.pdf

摘要 摘要 本试验以亚洲百合杂种系普瑞头伍p r a t o ) 中层鳞片为试验材料，测定百合鳞 茎低温解除休眠过程中的形态指标，淀粉含量、可溶性糖含量、内源激素( a b a 、 g a 3 、i a a 、z r ) 含量、酚类物质含量以及其相关酶( p a l 、p p o 、p o d ) 活性等生理 生化指标，利用液相色谱鉴定百合鳞茎中层鳞片中与休眠有关的酚类物质成份并测定其 含量，并对百合鳞茎低温处理期问鳞茎内的物质代谢进行相关回归分析。旨在为探讨百 合种球休眠机理和实现百合的周年生产提供依据。主要研究结果如下： ( 1 ) 对百合鳞茎中层鳞片在低温解除休眠过程中的形态和碳水化合物代谢进行了研 究。5 c 和0 c 贮藏1 周后转入5 c 的处理百合鳞茎分别于第7 周和第4 周解除休眠。休 眠解除过程中鳞茎鲜重和淀粉含量逐渐降低，可溶性糖含量上升达到峰值之后下降。 ( 2 ) 对百合鳞茎中层鳞片在低温解除休眠过程中的酚类物质代谢进行了研究。随着休 眠的解除，p o d 活性、p a l 活性和总酚含量下降，p p o 活性升高。说明酚类物质是百 合鳞茎休眠抑制物，p o d 及p a l 活性的变化趋势与总酚含量一致，因而它们可能是调 控鳞茎休眠的关键酶之一。 ( 3 ) 利用液楣色谱鉴定了低温解除百合鳞茎休眠过程中鳞茎内的酚类物质及其含量 的变化。百合鳞茎中主要有6 种酚类物质，鉴定出其中的3 种：对苯二酚、间苯二酚和 邻苯二酚。其中，对苯二酚和问苯二酚在低温处理过程中含量逐渐上升，而邻苯二酚的 含量逐渐下降。推测：对苯二酚和间苯二酚可能是促进休眠解除的主要酚类物质邻苯 二酚可能是百合鳞茎的总酚中对休眠解除起主要抑制作用的酚。休眠的解除可能与两类 酚类物质的协作调控有关，这需要进一步深入地研究。 ( 4 ) 对低温解除百合鳞茎休眠过程中内源激素含量的变化进行了测定，并对内源激 素及其比值进行了相关性分析。低温处理前1 周或3 周是这4 种激素含量变化剧烈的主 要时期，因此也是百合鳞茎解除休眠的关键时期。激素含量及其比值的相关性分析说 明：g a 3 和a b a 是激素中对百合鳞茎休眠解除起主要作用的激素。 ( 5 ) 对百合鳞茎低温处理期间鳞茎内物质代谢进行相关回归分析。明确了5 c 低温处 理时，酚类物质含量主要与p a l 活性和a b a 含量极显著正相关。鳞茎内p a l 活性主 要与a b a 显著正相关，p p o 活性主要与z r 极显著负相关。而0 1 2 贮藏1 周后转入5 低温处理时，酚类物质含量主要与p o d 和a b a 含量极显著正相关。鳞茎内p a l 活性 和p o d 活性均主要与a b a 显著正相关。 关键词百合；鳞茎；休眠；低温；酚类物质 a b s t r a c t t h i sp a p e ri sa b o u tp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a la n a l y s i sf o rd o r m a n c yr e l e a s eo fl i l y b u l b 伍p r a t o ) i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，t h em o r p h o l o g i c a lc h a n g e sa n dt h ec o n t e n t so ft o t a ls u g a r , s t a r c h ，4h o r m o n e s ( a b a , g a 3 ，l 蛾z r ) a n dp h e n o l i cc o m p o u n d sa n dt h ea c t i v i t i e so f3 e n z y m e s ( p o d ，p p o ，p a l ) r e l a t e dt op h e n o l si nl i l yb u l bw e r ed e t e r m i n e dd u r i n gt h ec o o l i n g s t o r a g eo fb u l b s i na d d i t i o n , t h et y p ea n dc o n t e n to fp h e n o l i cc o m p o u n d si nm i d d l eb u l b so f l i l yw e r ei d e n t i f i e db yh p l ca n a l y s i s c o r r e l a t i o na n dr e g r e s s i o na n a l y s e so fs u b s t a n c e m e t a b o l i s mi n l i l yb u l bd u r i n gc o l dt r e a t m e n tf o rd o r m a n c yr e l e a s e t h ep u r p o s e so ft h e s e e x p e r i m e n t sa l et op r o v i d ea c a d e m i cb a s i sf o rm a k i n gc l e a rd o r m a n c ym e c h a n i s ma n dm a k i n g a n n i v e r s a r yp r o d u c t i o no fl i l yt ob ec o u l et r u e t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ( 1 ) m o r p h o l o g i c a lc h a n g ea n de n d o g e n e s i ss u b s t a n c em e t a b o l i s mi nm i d d l eb u l bo fl i l y w e r es t u d i e dd u r i n gc o l dt r e a t m e n tf o rd o r m a n c yr e l e a s e t h eb u l br e l e a s e df r o md o r m a n c y r e s p e c t i v e l yi n7w e e k sa n d4w e e k ss t o r e da t5 ca n d0 cf o r1w e e ka n dt h e nr u mt o5 f r e s hw e i g h ta n dc o n t e n to fs t a r c hr e d u c e dg r a d u r a l l yw h e nd o r m a n c yr e l e a s e d , a n dt h e c o n t e n to fs o l u b l et o t a ls u g a rp e a k e da tt h ep o i n to fd o r m a n c yr e l e a s e da n dt h e nd e c r e a s en e x t w e e k ( 2 ) p h e n o l i c sm e t a b o l i s mi nm i d d l eb u l bo fl i l yw a ss t u d i e dd u r i n gc o l dt r e a t m e n tf o r d o r m a n c yr e l e a s e a l o n gw i t ht h ed o r m a n c yr e l e a s e ，p o da c t i v i t y , p a la c t i v i t ya n dp h e n o l i c c o m p o u n dc o n t e n td e c r e a s e d , p p oa c t i v i t i e si n c r e a s e d t h er e s u l ts h o w st h a t ：p h e n o l i c c o m p o u n di sa ni n h i b i t o ro fl i l yb u l bd o r m a n c y , a n dt h ed e c r e a s i n go fp o da n dp a la c t i v i t i e s c o u l db er e s p o n s i b l ef o rt h ed e c r e a s eo fp h e n o l i cc o m p o u n d s s ot h e ya l em a y b eo n eo ft h e k e ye n z y m e sf o rb u l bd o r m a n c yc o n t r o l l i n g ( 3 ) n et y p ea n dc o n t e n to fp h e n o l i cc o m p o u n d si nm i d d l eb u l b so fl i l yw e r ei d e n t i f i e db y h p l ca n a l y s i sd u r i n gc o l dt r e a t m e n tf o rd o r m a n c yr e l e a s e t h e r e 珊6p h e n o l i cc o m p o u n d si n t h em i d d l eo fl i l yb u l b t h r e eo ft h e mw e r ei d e n t i f i e d , w h i c hw e r eh y d r o q u i n o n e , r e s o r c i n o l ， a n dc a t e c h 0 1 a n dt h ec o n t e n to fh y d r o q u i n o n ea n dr e s o r c i n o li n c r e a s e dd u r i n gb r e a ko f d o r m a n c y , w h i l ec a t e c h o ld e c r e a s e dg r a d u a l l y s ow ep r e s u m e dh y d r o q u i n o n ea n dc a t e c h o l w e r el i k e l yt ob et h em a i np r o m o t e r st h a tp r o m o t e dd o r m a n c yb r e a k i n g , a n dc a t e c h o lm a yb e t h em a i ni n h i b i t o ro ft h ep h e n o l i cc o m p o u n d si nl i l yb u l b b r e a k a g eo fd o r m a n c ym a yb e r e l a t i v et oc o o p e r a t i n gc o n t r o lo ft h e s et w ok i n d so fp h e n o l i cc o m p o u n d s ，w h i c hn e e dm o r e s t u d y ( 4 ) v a r i a t i o no fe n d o g e n e s i sh o r m o n a lc o n t e n ta n dr a t i oi nl i l yb u l bw e r ed e t e r m i n e d d u r i n gc o l dt r e a t m e n tf o rd o r m a n c yr e l e a s e ，a n dc o r r e l a t i o no ft h e mw a sa n a l y z e d t h e4 h o r m o n e sv a r i e ds h a r p l yd u r i n gt h ef i r s to n ew e e ko rt h r e ew e e k s ，s oi ti st h ek e yp e r i o d so f b r e a l 【a g co fd o r m a n c yf o rl i l yb u l b c o r r e l a t i o na n a l y s i so fh o r m o n e sc o n t e n ta n dr a t i os h o w s t h a tg a 3a n da b a p l a yt h ec e n t r a lr o l ei nd o r m a n c yc o n t r o l l i n g ( 5 ) c o r r e l a t i o na n dr e g r e s s i o na n a l y s e so fs u b s t a n c em e t a b o l i s mi nl i l yb u l bd u r i n gc o l d t r e a t m e n tf o rd o r m a n c yr e l e a s e t h er e s u l ts h o w st h a t ，f o r5 ，t h ec o n t e n to fp h e n o l i c c o m p o u n d si sc o r r e l a t i v ew i t hp a la c f i v i t ya n da b ac o n t e n t p a la c t i v i t yi sc o r r e l a t i v ew i t h a b a , a n dp p oa c t i v i t yi sc o r r e l a t i v ew i t hz r w h i l ef o r0 cf o ro n ew e e ka n dt h e nt u r nt o5 t h ec o n t e n to fp h e n o l i cc o m p o u n d si sc o r r e l a t i v ew i t hp o d a c t i v i t ya n da b a c o n t e n t e 虬a n d p p 0 a c t i v i t yi sc o r r e l a t i v ew i t ha b a k c y w o r d s l i l l u m ；b u l b ；d o r m a n c y ；l o wt e m p e r a t u r e ；p h e n o l i cc o m p o u n d s m 独创性声明 本人声明所呈交的学化论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中小包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得盘i 垦盎些盘堂或其他教育 机构的学位或证二砖两使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： d 物旃签字日期：如。7 年多月劫日 l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 塞些盎些盘堂有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权 盘a 垦盐些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 义。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 割狍薜 导师签名： 签字日期：砌7 7 年- b 月伽日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 闰彪址 签字日期：叩年舌月沙日 电话： 邮编： l 绪论 1 绪论 1 1 引言 百合( l i l i u ms p p ) 是单子叶植物亚纲百合科( l i l i a c e a e ) 百合属( l i l i u m ) 的所有 种类的总称，我国人民依据百合地下鳞茎是由许多鳞片抱合而成，将其起名为“百 合”。我国的百合栽培历史悠久，但以往的栽培目的主要是生产食用和药用百合。南北 朝时( 4 2 0 5 8 9 ) ，梁宣帝萧察曾为百合题诗，赞美百合花的纯洁。诗日：“接叶多重， 花无异色，含露低垂，从风偃抑。”说明在1 4 0 0 多年前，百合在我国已作为观赏花卉得 到应用。而今这种集观赏、食用和药用于一体的多年生球根花卉以其丰富的花色、淡雅 的花姿，迷人的花香倍受人们喜爱，作为一种高品位、高档次的切花被广泛应用于各种 庆典、节日和人们的日常生活中，己成为鲜花市场的主要品种和世界著名的球根花卉。 其切花和种球生产在国际花卉市场上占有十分重要的地位1 1 】1 。 由于百合种球在发育后期逐渐进入休眠状态，未解除休眠的鳞茎种植后会导致发芽 率不高和盲花出现。解除休眠一般需要经过2 5 个月( 依品种而定) 的低温贮藏处 理，为此，百合生产用的种球一般为前一年生产的已经解除休眠的种球。而这些种球由 于贮藏时间过长，种球易萌发，养分大量消耗，感染病菌或腐烂，致使种球质量降低， 生产成本提高。若采用当年秋季生产的种球进行促成栽培就可以避免上述不利因素。显 然实现百合的促成栽培及百合切花的周年供应，关键在于快速打破百合鳞茎的休眠。所 以百合鳞茎的休眠机理及打破休眠技术一直倍受学者的关注。 迄今为止，对百合鳞茎休眠的研究结果表明，鳞茎的休眠可能与体内发芽抑制物的 存在有关，其休眠的解除不仅受环境因子的制约，而且与内源激素及多种物质代谢有 关。其中酚类物质代谢与植物休眠的关系是2 0 世纪9 0 年代以来一个新的研究内容。酚 类物质作为次生代谢产物，其含量的变化与植物组织的生长发育及代谢活动密切相关， 有关酚类物质在果蔬褐变、植物抗病、植物开花与育性等领域的研究已十分深入，而在 植物休眠方面的研究较少，且结果不尽一致，有关酚类物质与球根花卉休眠之间关系的 研究更是不多。为缩短百合鳞茎的休眠时间从而缩短生产周期，为实现我国百合鲜切花 的周年生产以及优质种球的国产化提供理论基础，需要采用合适的方法解除百合鳞茎的 休眠，通过对其休眠解除过程中的生理生化变化进行研究，来明确其休眠机制，完善其 休眠理论。 本文就环境因素对百合鳞茎休眠的影响和与休眠有关的生理代谢的研究成果加以综 述，并阐明本研究的目的和意义。 东北林业人学硕i ：学位论文 1 2 环境因素对百合鳞茎休眠影响的研究进展 1 2 1 温度对百合鳞茎休眠的影响 东方百合和亚洲百合属于冬季休眠的种类，露地栽培的成年鳞茎于秋季产生基生 根，随后萌芽但不出土，经过自然低温越冬后于早春气温上升后萌发。因此，温度是影 响百合鳞茎休眠的最主要因子，目前打破休眠最有效的方法也是低温处理。通常，亚洲 百合鳞茎收获以后，在1 4 预冷处理2 周，然后放在2 8 的低温下处理8 1 0 周，可以有效地缩短到花日数，提高开花率。而不进行预冷处理，一般的亚洲百合品种 在5 低温冷藏条件下，经4 6 周处理即可解除休眠；而东方百合杂种系一般为长需冷 性( 如凝星、卡萨布兰卡) ，至少需要处理1 0 周以上。此外，同品种的百合，低温处 理时间愈久，则从定植到开花所需时间愈短，但处理不是无限期的，如果休眠已打破， 百合鳞茎已开始发芽，再继续处理对花的发育有影响。 国外有关鳞茎休眠解除的生理，更多的研究是在组培条件下进行的【2 _ q 。无论什么 品种，所有的组培鳞茎如果不经过冷处理都保持休眠1 7 j 。组培温度低于1 5 ，可获得非 休眠的鳞茎1 8 1 ，在2 5 c 条件下培养的鳞茎不经冷处理时，发芽率仅为5 ，甚至更小i ”， 说明温度对组培鳞茎的体眠有很强的影响；与2 5 和2 0 相比，4 c 低温贮藏9 周可以 更加迅速地解除生理休眠，获得极高的发芽率1 7 。，在2 c 冷处理小鳞茎6 周，发芽率高 达9 0 - 1 0 0 ，而未经冷藏直接移植到土壤中的小鳞茎发芽率仅为1 5 3 5 n ，说明冷藏 后休眠已被打破。休眠程度受温度影响很大。在标准温度( 2 0 ) 下离体培养4 周开始 形成鳞茎【删，6 周还没有进入休眠或只是浅休眠1 1 l 】，但也有8 周以后才开始表现休眠的 报道【1 2 l 。在高温条件下形成的鳞茎与在较低温度下形成的鳞茎相比有较长的休眠期， p a f f c n 也报道过相似的结果，他以美丽百合栽培品种( 上s p e c i o s u mc v r u b r u m ) 鳞片做 外植体，发现2 5 培养的小鳞茎比1 5 c 培养的小鳞茎进入休眠早1 1 2 j 。a g u e t t a z 通过进 一步实验发现：2 5 培养的小鳞茎休眠较深，而1 5 培养的小鳞茎几乎没有休眠现象 【9 】o 矢岛( 1 9 9 1 ) 的研究发现，百合鳞茎打破休眠的有效温度在1 5 以下。组培1 1 周 获得的美丽百合栽培品种( ls p e c i o s u mc v r u b r u m ) 休眠小鳞茎2 处理时，3 8 周发 生萌动一休眠即行解除，但是亚洲百合品种黄焰的商品球在2 c 处理时至少需要1 0 周 以上。对于通过短暂冷处理没有彻底解除休眠的鳞茎转移到可诱导休眠的温度仍然可以 重新完全进入休眠1 1 3 】。后来d j i l i a n o v 也证实了这一点，对休眠小鳞茎进行短暂的冷处 理后，在2 0 的继续培养，小鳞茎又重新进入休眠【i o j 。 1 2 2 光照对百合鳞茎休眠的影响 多数认为百合冬季休眠的诱导园子是短日照。短日照有利于冬季休眠的球根植物地 下贮藏器官的形成，加速球根进入休眠。光照对于休眠的作用主要发生在球根的生长发 育阶段，在采收后的影响未见报道。一些学者分析了短日照诱导体眠的可能机理，即短 日照条件下叶内产生抑制物质，这种物质从感光部位叶片转移至球根的生长点，最终休 眠与否取决于这种抑制性物质的强弱与球根本身生长活性的大小。但r o h 认为长的光周 l 绪论 期和短的光周期均可诱发麝香百合( ll o n g i f l o r u m ) 的休眠【1 4 】。p a f f e n 和a g u e t t a z 认为 光周期对小鳞茎休眠无影响1 9 , 1 2 1 。s u h 研究表明，光质对i 亍合鳞片扦插及组织培养形成 的小鳞茎休眠有影响，红光和远红光均可诱导小鳞茎的休眠【1 5 l 。k l e r k 发现组织培养形 成的小鳞茎比在土壤中种植形成的小鳞茎的休眠程度浅，他认为在很大程度上可能是由 于光刺激促进了萌发【1 6 1 。这与后来o h s h i t o 的研究结果相同：暗培养形成的日本百合 ( lj a p o n i c u m ) 小鳞茎休眠程度深于在光下离体培养形成的小鳞茎旧。 1 2 3 水分对百合鳞茎休眠的影响 无论是冬季休眠还是夏季休眠的球根，水分亏缺往往可以加速休眠，甚至可以直接 引起休眠。东方百合的种球在干藏后除重量下降外。经低温处理后，叶的萌发晚于经湿 藏处理的种球，可能是水分胁迫加深了鳞茎的休眠。另有研究表明，休眠状态的球根比 非休眠状态的球根束缚水的比例要耐1 8 l ，有人认为这是由于水分变化诱导了a b a 的积 累，而a b a 参与了球根的休眠 1 3 百合鳞茎休眠中的生理代谢 1 3 1 抗性与呼吸的变化 随着休眠的加深，球根的呼吸强度逐渐下降，抗性逐步增强，在进入“深休眠”阶 段，呼吸强度降为最低，而抗性达到最高。而随着休眠的逐步解除，球根的呼吸强度又 逐渐加强，抗性逐渐下降。这种变化也是植物适应炎热、干旱和寒冷等环境条件的反 应。孙红梅研究了兰州百合( ld a v i d i iv a t u n i c o l o r ) 鳞茎解除休眠过程中呼吸速率的变 化，表明采收对鳞茎的呼吸速率最高，这可能是由于采收时切断基生根等轻度机械损伤 促进了呼吸作用【1 9 1 。在鳞茎低温处理第3 4d 至1 0 1d 范围内，随着处理时间的延长，呼 吸速率略有升高。不同温度处理相比较，呼吸速率处理温度降低而下降。而目前有关百 合鳞茎解除休眠程中呼吸途径的详细报道很少。 1 3 2 碳水化合物的变化 百合在休眠期内几乎没有形态和结构的变化，但它们的生理生化变化极其复杂。低 温处理和适宜的植物激素处理虽然都可打破百合鳞茎的休眠，但是其内含物的变化有所 差别。淀粉是百合鳞茎内主要的贮藏物质。在低温处理打破百合鳞茎休眠期间，低温解 除休眠过程中，一系列淀粉降解酶的活性增加1 2 0 - 2 4 ，鳞茎内的淀粉水解，可溶性糖大量 积累1 2 5 埘】，即发生“低温糖化”作用，其中蔗糖是主要的可溶性糖成分，葡萄糖和果糖 的含量相对较低 7 1 ，淀粉酶的活性与糖分的积累呈正相关。可溶性糖分的积累对于百 合鳞茎的萌发及初期的生长具有重要的作用。某些植物激素如赤霉素( g a 3 ) 和高桩素 ( g a “7 ) 水溶液处理虽然能打破某些百合鳞茎的休眠，促其提早萌发，但却不能导致 碳水化合物的降解，或者降解发生较迟且降解不完全p ”。低温贮藏和g a 3 处理过程 中，百合鳞茎中都有一个活跃的蛋白质净合成。表明这些游离氨基的含量变化与休眠的 逐渐解除有关，是为百合鳞茎的萌发进行着生理的准备。 东北林业人学硕士学位论文 1 3 3 内源激素的变化 目前，人们广泛地认为植物的休眠是由植物内源激素所调控的，是内源抑制物和促 进物之间平衡的结果。研究较多的植物激素是脱落酸、赤霉素类物质、细胞分裂素和生 长素。脱落酸( a b a ) 是被广泛证实了的萌发抑制物，参与休眠的建立和维持，并存在 于休眠组织和正在进入休眠的器官中，这是较为公认的说法 3 2 - 3 5 。在百合组培的研究中 发现，在培养基中加入a b a 虽不影响组培小鳞茎的休眠状态，但加入a b a 的合成抑制 剂氟草同( f i u r i d o n e ) 则可有效地阻止休眠的发生；若同时加入a b a 和氟草同，对休 眠没有影响，这表明a b a 是诱导休眠的必需物质，但是内源a b a 的水平低时不会引起 休眠，只有不断地合成a b a 才会诱导休眠【3 l 】。k i m 的研究也证实了这一点【1 1 l ，他发现 1 5 c 条件下组培获得的l s p e c i o s u m 隗r u b r u m 小鳞茎只有轻度休眠，而这种轻度休眠 不是由于鳞茎中a b a 水平低造成的，因为填加a b a 并没有影响休眠程度，这表明除了 内源a b a 的水平在百合休眠中起作用外，还有一个未知的因素在起关键性的作用。 d i m i t a rd ! j i l i a n o v 的研究中也提到了这一未知因素i i ，他以美丽百合栽培品种( l s p e c i o s u mc v r u b r u m ) 鳞茎为外植体，通过测定小鳞茎中a b a 含量和敏感度发现：2 0 和2 5 培养4 周后获得的小鳞茎逐渐进入休眠，在休眠建成期间a b a 敏感性很高，其 后降低，完全进入体眠后几乎完全不受a b a 影响( 对a b a 不敏感) ；a b a 的敏感性不 随温度的升高而增加，相反，在1 5 时敏感性最低，说明1 5 所产生的浅休眠或不休 眠不是由于a b a 敏感度低导致的。因此得出结论：除了a b a 敏感性对休眠形成起着重 要作用外，还有其他未知因素也起着关键作用。由此可见，导致百合鳞茎休眠的原因非 常复杂，a b a 可能不是导致休眠的唯因素。 赤霉素( g a x ) 是被广泛证实了的萌发促进物。百合鳞茎随着低温处理时间的延 长，鳞片中的g a 类物质的活性逐渐提高，鳞茎萌发所需天数减少例。在兰州百合( l d a v i d i iv a lu n i c o l o r ) 低温处理解除休眠过程最初的3 4d 内，除内部鳞片g a 3 变化不大 外，其余部位( 顶芽、鳞茎盘、中部和内部鳞片) g a 3 含量都呈上升趋势；在此期间， 休眠虽未完全解除，但顶芽在鳞茎内迅速增大【矧。这表明，内源赤霉素活性及水平的提 高与低温解除休眠有关。在组培获得的非休眠鳞茎中也观测到高浓度的赤霉素类物质。 有观点认为g a 类物质打破休眠而a b a 类物质促进休眠，与g a 诱导水解酶合成而 a b a 抑制水解酶合成有关例。但是植物内源赤霉素的变化也很复杂。如美丽百合的鳞 茎在1 5 低温处理的6 0d 内，其内源g a 类物质急剧下降，而这个温度下对于打破休 眠、促进萌发非常有效；相反，在2 俨c 下处理6 0d 内，g a 类物质含量却增加。这可 能暗示，百合鳞茎的休眠状态不单纯是由g a 类物质的含量和水平决定的，可能是多种 萌发抑制物和促进物综合调控的。 内源激素对百合鳞茎休眠的调控相当复杂，不仅涉及某一种激素的含量，同时与它 们之间的比值有关，促进生长的物质互作，甚至起到强烈的抑制发芽作用，这也是外源 施用植物生长调节剂处理种球效果并不明显、结果不尽一致的重要原斟”l 。 1 绪论 1 3 4 百合鳞茎休眠中酚类物质及其活性酶的变化 酚类化合物广泛分布于植物体，以糖苷或糖脂状态积存于液泡中。酚类物质含量的 变化与植物组织的生长发育及代谢活动密切相关，有关酚类物质在果蔬褐变、植物抗 病、植物开花与育性等领域的研究已十分深入，而酚类物质与植物休眠的关系，研究结 果不尽一致。从2 0 世纪5 0 年代人们开始注意抑制生长的物质对休眠以及萌发有影响以 来，普遍认为酚类化合物是植物体内主要的生长抑制剂。即便是发现脱落酸以后，一些 酚类化合物对生长的抑制作用仍被人们所认可，如水杨酸、对羟基苯甲酸、香豆酸、咖 啡酸、龙胆酸等。在球根类植物唐菖蒲球茎的休眠中曾有报道认为酚类物质与a b a 一 起抑制了萌发。b e n k e b l i a 在研究低温解除洋葱休眠过程中总酚含量的变化时，发现当 鳞茎开始发芽( 休眠解除) 时总酚含量下降，说明酚类物质抑制洋葱芽的萌发，是抑制 鳞茎休眠解除的物质p 8 】。但进入2 0 世纪9 0 年代以后，随着研究领域的不断扩展和研究 内容的不断深入，不但开始实现简单而且快速地分离和鉴定植物中酚类物质组分的【3 9 1 ， 而且出现了与上述报道截然相反的观点，提出了一些酚类物质对某些植物如马铃薯等萌 发的促进作用。有关酚类物质与百合鳞茎休眠的关系报道甚少。孙红梅以兰州百合鳞茎 作试材，发现低温解除休眠过程中，鳞茎内酚类物质含量呈增加趋势。这些结果暗示 在百合鳞茎的休眠过程中，酚类物质可能促进了百合鳞茎的萌发。但目前，酚类物质是 否促进萌发，酚类物质中对休眠起作用的具体成分和可能的机制还不清楚。 高等植物酚类物质的合成是从p a l ( p h c n y l a l a n i n ca m m o n i a 1 y a s c ) 催化的苯丙氨酸 脱氨反应开始的，p a l 是形成酚类物质的关键酶和限速酶，该酶在细胞内的活性水平受 内外因素的影响，各种类型的低温1 4 1 卅、机械损伤1 4 3 】和g a 3 、i a a 等激素【删刺激都可 以诱导p a l 基因的表达，这己在番茄、黄瓜、甜瓜、烟草、马铃薯等植物上得到证 实。孙红梅的研究表明兰州百合鳞茎低温解除休眠过程中p a l 也是导致酚类物质含量 增加的关键因素【椰】。试验未发现p p o 活性与酚类物质含量存在显著相关关系。但是在 酚类物质合成的过程中，p a l 催化其第一步反应，p p o 则催化香豆酸向咖啡酸的转化， 为木质素、栓质的合成提供前体物质，是酚类物质合成的另一关键酶【4 5 】。因此，促进百 合鳞茎发芽的酚类物质的具体成分和作用机制是今后百合鳞茎休眠机理研究的重点之 一，确定与百合鳞茎休眠有关的酚类物质的具体成分和作用机制无论在理论上还是在生 产实践上都具有重要意义。 1 4 研究目的与意义 虽然我国是百合种类分布最多的国家，是世界百合起源的中心，也是应用和栽培百 合最早的国家，但是在百合研究方面起步较晚，且已有研究多集中在百合资源调查、引 种栽培、细胞生物学、发育生物学和繁殖生物学方面，对种球脱毒、远缘杂交及鉴定技 术，鳞茎及组培小鳞茎生长发育的研究不多，而有关百合在种球及组培小鳞茎的膨大机 理和休眠机制方面的研究甚少，导致生产技术缺乏明确的理论依据，造成实际生产中的 产量低、效益差，实现周年生产还存在许多问题。因此，百合种球多年来基本靠从荷兰 东北林业大学颂i 学位论文 进口，仅2 0 0 3 年进口百合种球就达8 0 0 万头以上，其中仅云南就达4 0 0 0 多万头。每年 进口百合种球消耗我国外汇数千万美元。国内百合种球市场的价格及品种变化，百合切 花市场的主流品种及花价，几乎完全依赖于荷兰百合的生产形势。直接影响我国百合切 花生产，造成百合生产成本高，风险大。如果我们在充分开发利用种质资源的基础上， 掌握百合鳞茎的休眠特性和快速解除休眠的方法，则不但可以为实现百合周年生产和种 球国产化莫定坚实的基础，还可以在种球出品贸易中增加在国际市场上的竞争力，从而 带来更多的经济效益。 。 。 目前，对百合休眠机理的认识还十分有限，休眠机理仍然不清楚。虽然碳水化合物 的变化与休眠的关系已基本明确，但激素和酚类物质对休眠的调控作用还不明确。现在 的研究结果表明内源a b a 、g a 类物质、i a a 、i b a ( i n d o l e a b u t y r i ca c i d ) 和b a 以及 酚类物质和鳞茎体眠都有一定的关系，百合鳞茎的休眠状态可能不单纯是峦这其中某类 物质的含量和水平决定的，可能是多种萌发抑制物和促进物综合调控的结果。但这种调 控的生理机制还不明确。在对内源激素的研究中也发现，除了已经研究过的a b a 和 g a 类物质外，可能还有其他的未知因素对休眠起重要的作用。酚类物质一直被认为是 萌发的抑制物，但在马铃薯、百合的研究中却得出了相反的结论，认为酚类可能是萌发 8 促进物质。迄今为止酚类物质促进体眠还是抑制植物体眠，究竟是哪些成分在对休眠 起作用，仍然是未知的。内源激素及酚类物质对百合休眠的调控机制还不明确。 本项目拟采用低温解除亚洲百合杂种系普瑞头鳞茎的休眠，研究百合鳞茎休眠 解除过程中的内源激素含量、酚类物质含量、相关酶活性及碳水化合物含量的变化规 律，为解释百合鳞茎休眠机理奠定基础。项目的研究不仅在球根花卉休眠机理研究领域 具有一定的理论价值，而且对实现百合种球国产化和实现百合的周年生产，增加种球出 口贸易在国际市场上的竞争力也具有定的实践意义。 2 百合鳞茎低温解除休眠过程中的形态平n 碳水化合物变化 2 百合鳞茎低温解除休眠过程中的形态和碳水化合物变化 百合鳞茎在收获后即进入休眠，在休眠期内鳞茎外观几乎没有形态和结构的变化， 但是其内部形态却发生着较大的变化，也会出现极其复杂的生理生化变化，研究较多的 是鳞茎可溶性碳水化合物的积累，即“低温糖化”。目前，有关百合鳞茎休眠解除的形 态标志和生理标志尚无科学定论。但是已有学者认为，东方百合冷藏打破休眠时，以顶 芽顶端位于鳞茎直立高度2 3 处或距鳞茎顶端1 咖左右为形态依据，以总可溶性糖含量 出现降低为生理指标【铝】。而有关亚洲百合休眠解除的形态和生理标志未见相关报道。 研究亚洲百合鳞茎解除体眠过程中的形态变化、碳水化合物代谢规律及与其萌发的关 系，对探讨百合鳞茎休眠解除标志及休眠机理具有重要的理论意义和实践意义。 2 1 材料与方法 2 1 1 材料 以十月份从辽宁凌源购买的亚洲百合杂种系普瑞头( l p r a t o ) 中层鳞片为试 验材料。选取鳞片抱合紧密、无病虫害的独头鳞茎，冲洗干净，用5 0 多菌灵可湿性粉 剂5 0 0 倍液浸泡3 0m i n 后放入聚乙烯袋中，储藏介质为事先消毒含水量为7 0 的锯木 屑，以保持一定湿度。将上述经木屑保湿的鳞茎进行两种低温处理：放入h s x 2 5 0 b 型智能恒温恒湿气候箱( 5 o 5 ) 温度下进行贮藏。放在2 5 0 - b 型生化培养箱中0 温 度下冷藏1 周。然后放入h s x - 2 5 0 b 型智能恒温恒湿气候箱( 5 0 5 ) 温度下进行贮藏。 2 1 2 方法 2 - 1 2 1 两种低温处理条件下百合解除休眠时间的测定 处理过程中于每周取样，各处理每次取鳞茎3 个，仔细剥下鳞片，测定芽伸长后离 鳞茎顶端的距离，用以测定百合解除休眠的时间。 2 1 2 - 2 鳞茎鲜重的测定 各处理分别取鳞茎4 5 个，随机分成3 组，进行鳞茎鲜重的测定。分组后的每个鳞 茎用标签做好标记，每2 周用电子天平对其进行鲜重的测定，直到百合鳞茎萌发。记录 每个鳞茎每次测定的鲜重值。 2 1 2 3 生理指标的测定 处理过程中于每周取样，各处理每次取鳞茎3 个，将中层鳞片充分混合，立刻进行 液氮处理，放入8 0 冰箱中保存备用。 ( 1 ) 淀粉含量的测定。采用蒽酮比色法 4 6 j 测定。取鳞片冻样o 1 5g ，加5m l 蒸镏 水进行研磨，将匀浆转入1 0m l 离心管，于沸水中提取3 0m i n ，离心提取( 转速4 0 0 0 r p m ，一次3r a i n ，共3 次) 。每次离心后倾去上层清液，再加入5m l 蒸镏水混匀。最 后一次离心后倾去上层清液，残渣加入2 0m l 热蒸馏水，煮沸1 5r a i n ，加入2m l 9 2 东北林业犬学钡二亡学位论文 m o l l 高氯酸，煮沸1 5r a i n ，冷却后混匀。用滤纸过滤至5 0m l 容量瓶，并用蒸馏水定 容待测。取待测液o 2m l ，加入o 5m l 葸酮乙酸乙酯试剂和5m l 浓硫酸，充分振 荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1m i n ，取出后自然冷却至室温，在 6 3 0n m 波长下测其吸光度。 ( 2 ) 可溶性糖含量的测定。采用葸酮比色法m 测定。取鳞片冻样o 1 5g ，加5m l 蒸镏水进行研磨，将匀浆转入1 0m l 离心管，于沸水中提取3 0m i n ，离心提取( 转速 4 0 0 0r p m ，一次3m i n ，共3 次) 。每次离心后将上层清液倾入2 5m l 容量瓶定容待测。 取待测液0 1m l ，加入0 5m l 蒽酮乙酸乙酯试剂和5m l 浓硫酸，充分振荡，立即将试 管放入沸水浴中，逐管均准确保温1m i n ，取出后自然冷却至室温，在6 3 0n l n 波长下测 其吸光度。 2 2 结果与分析 2 2 1 两种低温处理条件下百合解除休眠时间的确定 国外在具体判定冷藏打破休眠时，以顶芽顶端位于鳞茎直立高度2 3 处或距鳞茎顶 端1c m 左右为形态依据【牾j 。因此判定低温下百合鳞茎打破休眠的时间可以通过测定顶 芽伸长距鳞茎顶端比例( 芽高鳞茎高) 来实现。 o 低温处理时间( 周) 一5 c 一o c l 周后转入5 67 图2 - 1 低温处理不同时间顶芽伸长距鳞茎顶端比例的变化 从图2 - 1 可看出，5 和0 贮藏1 周后转入5 的两种不同低温处理，百合鳞茎的 顶芽处于不断的伸长生长中。其中o 贮藏1 周后转入5 的处理萌发速度较快，至第4 周芽高与鳞茎高的比值已达0 6 8 ，顶芽距鳞茎顶端不到1c m ，这与国外判定休眠解除时 的形态指标一致，说明0 贮藏1 周后转入5 处理的百合鳞茎至第4 周时已解除休 眠，顶芽处于即将萌发的前期，应及时转入冰冻冷藏，否则给予合适的温度鳞茎很快就 可以发芽。即便在本实验中未给予适合萌发的条件( 继续放置在5 的低温条件下储 藏) ，顶芽的伸长生长也很迅速，第5 周和第6 周的芽高与鳞茎高比值分别为0 6 9 和 8 0 9 8 7 6 5 4 l o o o 0 o o 恒州螯恒妆 2 百台鳞茎低温解除休眠过程中的形态和碳水化合物变化 0 7 l ，两比值均大于国外对百合鳞茎休眠解除的判定值，至第7 周比值达0 9 1 ，可见解 除休眠的鳞茎发芽迅速。而5 0 的处理顶芽距鳞茎端部的比值增加缓慢，直到第7 周顶 芽离鳞茎顶部的距离才开始小于1c m ，芽高与鳞茎高的比值为o 6 8 ，达到国外判定百合 休眠打破的形态标准。表明5 c 的处理第7 周解除休眠。 本实验表明，百合鳞茎在休眠期间，虽然外部形态没有变化，但是内部形态却发生 着很大变化，顶芽不断地伸长，芽生长点离鳞茎顶部的距离越来越小。 2 2 2 低温处理过程中鳞茎鲜重的变化 有研究发现冷藏前后鲜重变化显著而干重变化不显著，认为在鳞茎休眠期间鳞茎损 失最多的是水分，养分损失的少，说明低温能有效降低鳞茎的呼吸消耗。本试验的结果 也表明在低温处理过程中，百合鳞茎鲜重的变化趋势是逐渐下降的，并且第1 周鲜重下 降明显，以后几周趋于平缓( 图2 2 ) 。说明低温处理的第1 周是呼吸速率下降最强的时 期。这个时期细胞呼吸大大减弱，消耗的糖分迅速减少，有利于糖分的快速积累，从而 提高对低温的抵抗力的同时有利于休眠的提前解除。从图中我们还可以发现与5 的处 理相比，o c 贮藏1 周后转入5 的处理在第1 周内的鲜重降低程度大( o 贮藏1 周后 转入5 的处理降低0 6 6g ，而5 c 的处理降低0 3 7g ) 。因此o 贮藏1 周后转入5 的 处理比5 的处理更有利于休眠的解除，休眠解除所需的时间比5 的处理要少一些， 事实也证实了这一点。 3 l 3 0 q2 9 嬲9 8 蓥2 7 2 6 2 5 olj57 低温处理时间( 周) 一5 0 一o c 1 周后转入5 c 图2 - 2 低温处理不同时间鳞茎鲜重的变化 2 2 3