（植物营养学专业论文）高效联合固氮菌的筛选、鉴定及其生理生化特征和接种效应研究.pdf

致谢 本论文是在方萍教授和石伟勇教授两位老师的悉心指导下完成的方老师渊博的知 识、开阔的思路、严谨的治学作风、豁达平易的待人风格给了我很多启迪，将是我终生 学习的楷模，在学习和生活上对我无微不至的关心，更令我无法忘怀。石老师扎实的专 业知识和实践技能、刻苦勤奋的工作作风使我永记脑海，对我以后的工作学习必将产生 久远的影响没有两位导师在各个方面耐心的谆谆教诲和批评指正，要完成此论文是不 可想象的，在此谨向两位导师表示我最诚挚的感谢和敬重之情 本论文得到了生命科学学院贾小明副教授的精心指导和大力帮助。余慎博士在菌种 鉴定实验中提供了热情的帮助，并为论文提出了宝贵的建议在论文研究开展过程中还 得到了本系的陶勤南教授、倪吾钟副研究员、马国瑞教授、励仁安教授、叶正钱副教授、 周钗美老师、何积秀老师和生物系的林小青老师等的热心指导和帮助在此向他们致以 深深的谢意 非常感谢季天委硕士和李廷轩博士的全力支持，对我的工作他们总是有求必应，慷 慨相帮，每每让我感动不已实验的进行过程中，朱维琴博士、夏会龙博士、余观梅硕 士、张红辉硕士、方素萍硕士、郁晓敏硕士、王强硕士、余剑东硕士、孙晓华硕士及在 本实验室实习的陈永根、朱日清、方波、周学来、胡彬华等同学都给予了热情帮助，李 志刚博士为实验提供了水稻种子，杨行妃女士在试验实施中付出了辛勤的劳动。在此一 并向他们表示衷心的感谢和良好的祝愿。 感谢三年来学校、学院各级领导和研究生科各位老师的关怀与支持。 最后，向一直以来给我无限关爱、理解和支持的家人及朋友表示我深深地感激和谢 意。 张丽梅 2 0 0 2 年5 月于华家池 摘要 农田生态系统中长期单一、过量偏施化学肥料特别是化学氮肥，造成农产品品质下 降，肥料利用率低，不仅增加了农业生产成本，还严重污染环境，已成为农业可持续发 展的一个重要制约因子。上一世纪7 0 年代d 6 b e r e i n e r 在禾本科植物上发现联合圃氮菌， 并证实了禾本科植物同样具有生物固氮的潜能。因此，充分发掘和利用禾本科植物的生 物固氮潜能，将是确保农业可持续发展的重要途径。 本研究分离、筛选得到一株固氮酶活性高且稳定，生长势强的联合固氮菌株，并对 其分类地位、形态及生理特征、对环境的适应性及其对植物的促生效果和作用机理作了 系统研究z 、姆结果如下。 固氮菌株的筛选与鉴定：测定从不同来源分离、收集和保藏的1 2 个固氮菌株或分 离物在不同保存时期的固氮酶活性和生长能力，发现多数菌株在初分离得到时固氮酶活 性较高，但随着转接次数的增多却逐渐丧失固氮酶活性，生长也随之减弱，只有w 1 2 在五年前从埃及分离得到至今一直保持旺盛生长势和较高的固氮酶活性，4 8 h 内乙烯生 成量可达1 8 0 0n m o l 乙烯m l 菌液以上，远远高于其它菌株，其生长量( o d 4 0 0 值) 也远远 高于其它菌株。通过比较多个菌株与同一水稻基因型的联合固氮效率及w 1 2 与不同基 因型的水稻的联合同氮效率，发现供试菌株中w 1 2 与水稻的联合固氮效率最高，且远 远高于其它菌株；同时这种高的固氮效率在不同的水稻基因型之间没有表现出显著差 异。在无氮培养基上该菌在1 3h 后进入对数生长期，并持续至4 8 5 2h ，这期间其生长 代时为2 4 h ，有氮培养基上为0 9 - l h 。通过形态观察及生理生化特征测定发现菌株w 1 2 为革兰氏阴性菌，短杆状，对数生长期细胞大小为：2 0 x 1 6 “m ，单个排列；兼性厌氧， 氧化酶阴性，发酵葡萄糖产酸产气，不运动。结合b i o l o g 系统对其进行鉴定，结果确 定该菌为肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a es s p n e u m o n i a e ) 。属于肠杆菌 科( e n t e m b a c t e r i a c e a e ) 克雷伯氏菌属( k l e b s i e l l a ) 。毒理测定结果表明该菌为无毒非致 病菌。 w 1 2 菌株对环境因子的适应性研究：无氮培养条件下，测定温度、碳源、酸碱度、 渗透压对w 1 2 生长及固氮能力的影响，结果表明，在1 5 4 0 c 下均能生长并表达固氮酶 活性，其最适生长及固氮的温度为2 5 3 5 c ；能利用葡萄糖、蔗糖、苹果酸、甘露醇等 多种碳源生长并固氮，当培养基中同时存在蔗糖和苹果酸时，细菌生长和固氮活性最强； 在偏酸和偏碱的条件下q h 4 5 - 8 5 ) 均能保持较强的生长势和较高的固氮酶活性，并能通 过调节自身代谢平衡并适应环境的酸、碱性变化，使培养液趋于中性：能耐受较高的渗 透压，培养液中1 - 1 5 n a c l 浓度对其生长和固氮酶活性影响不大，当n a c i 浓度升至 2 时，菌株的生长势及固氮酶活性才有所下降；低浓度的铵对其固氮酶活性影响不大， 在0 5 1 m m o l 1 , 的铵浓度下，分别保持6 l 和4 4 的固氮活力。 从我们的实验结果还可得出，在无氮培养条件下，菌株的生长量同其固氮酶活性成 正相关，固氮酶活性越高。w 1 2 生长越旺盛。由此可看出，w 1 2 对环境因子表现出良 好的适应性。 w 1 2 菌株对作物的接种效应：用w 1 2 对水稻、玉米、甘蓝上进行接种试验，得到 相似的结果：接种w 1 2 后对植物的生长表现出一定的促进作用。以w 1 2 菌液蘸秧根接 种玉米后植株的株高、叶绿素含量均比对照植株高，差异达显著水平，地上部干物重也 比对照有所提高；以石英砂和珍珠岩为基质进行水稻水培接种试验，在同一氮水平下， 接种处理水稻的株高，叶绿素含量较不接种处理的对照明显增高，差异达到5 显著水 平，平均单株籽粒数、千粒重、秸杆重和地上部干物重都有一定程度的增加，但差异朱 达到5 显著水平；采用随机区组设计在甘蓝上接种也得到一致的结果，接种w 1 2 后， 小区平均产量增加7 8 公斤，增产率达1 3 7 ，从作物的农艺性状来看，接种处理的植 株较对照生长旺盛，枝叶更健壮，色泽更浓绿，特别是根系较为发达。 在玉米上的按种试验我们采用菌液醮秧根、菌液浇根、施用以草碳为载体的固体接 种剂三种接种方法进行，结果发现采用菌液蘸秧根接种表现出显著的促生效果，用菌液 浇施或以草碳为载体的固体菌剂直接施于土表接种，未见显著的接种效应。可见在相同 的供试条件下，接种方法对联合固氮菌的接种效果有着直接的影响。因此，摸索最佳的 接种方法和最优的栽培管理措施仍是今后值得深入研究的主题。 联合固氮菌可通过多种方式促进宿主植物的生长，从我们的实验结果来看，w 1 2 菌液蘸秧根接种玉米后使玉米的茎、叶、鞘、穗各个部位的氮含量及整株氮百分含量均 比对照有明显的提高；接种水稻后水稻根、秸杆和籽粒中钾的含量明显高于对照；接种 甘蓝后，植物的根系较对照粗壮、侧根更发达。说明w 1 2 可以通过向宿主植物提供固 氮作用的产物，刺激植物根系生长，促进植物根系对土壤中矿物质的吸收等方式促进宿 主植物生长。其确切的作用机理还有待于进一步的研究。 人工诱导水稻结瘤试验：采用终浓度分别为0 2 5 m g l 、0 5 m g l 、o 7 5 m g l 的2 ，4 - d 处理水稻，无论是否接种联合固氮菌w 1 2 ，均能使水稻根部形成瘤状结构，而不用2 。 4 d 处理的水稻未见有瘤状结构形成。说明结瘤过程仅同2 ，4 - d 有关，而与接种的微 生物没有关系。同时，在我们的实验中也可看出，凡结瘤的水稻根整条根未长出侧根， 而长出侧根的则只在根的顶端形成瘤。这主要是由于瘤状物的形成是在2 ，4 - d 的作用 下，植物部分侧根正常生长部位受到阻碍，细胞增殖膨大形成的，也即类根瘤的形成位 点占据了侧根的正常生长部位，侧根生长受到阻碍。 用2 ，4 - d 处理水稻并接种w 1 2 后，培养系统中的乙烯生成量较对照差异不大，类 根唐的形成对固氮酶活性没有太大的影响。水稻根以o 1 的h g c l 2 表面消毒3 分钟后未 检测到根内或类根瘤内苟活菌数存在，可能是消毒时间过长所致。力 jj v vn 关键词：联合固氮，联合固氮菌，固氮酶活性，w 1 2 菌株( 肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种) ， in j 环境因子，接种效应，类根瘤 引言 农业环境中氮素的有效管理是农业可持续发展的一个关键因子。当前，由于农田生 态系统中长期单一，过量偏施化学肥料特别是化学氮肥，造成土壤板结，土壤质量退化， 农产品品质下降，肥料利用率低，环境污染等一系列负面影响( 崔玉亭，2 0 0 0 ) 。据统 计，我国化肥的当季利用率仅为3 0 3 5 ，每年损失的氮量相当于1 9 0 0 多吨尿素，这种 肥料的大量损失，不仅造成经济和能源的巨大浪费，增加农业生产成本，还严重污染环 境，已成为农业可持续发展的一个重要制约因子( 朱兆良，1 9 9 2 ) 。与施用化学肥料相 比，生物固氮毋需消耗非再生能源，固氮产物可直接为植物吸收利用，且不易因挥发、 反硝化、淋溶损失而引起农业环境的污染。统计资料表明，全球范围内每年输入陆地生 态系统的总氮量约在两亿吨左右，其中三分之二来自生物固氮( 洪国藩等，1 9 9 7 ) 。近 年来，随着全球“粮食”、“能源”危机及环境污染的日益加剧，人们越来越重视对生物 固氮的研究。 生物固氮研究迄今有一百多年的历史，7 0 年代d o b e r e i n e r 实验室在禾本科植物根 际发现联合固氮菌，证实了禾本科植物同样存在生物固氮潜能，并提出联合固氮的概念， 为生物固氮的研究开辟了一个新的领域( b a l d a n ie ta 1 ，1 9 9 7 ；d 6 b e r e i n e re ta 1 ，1 9 7 5 ) 。 随后的研究发现，联合固氮菌的宿主植物多为具有重要经济价值的禾本科植物：水稻、 小麦、玉米、甘蔗、牧草等。这引起人们对禾本科植物生物固氮的极大关注。近年来， 许多研究者对禾本科植物根际联合固氮菌的种类、数量、分布情况、研究方法的建立等 方面作了大量的研究工作，并分离、筛选和通过遗传改良获得多个高效固氮菌株，在接 种剂的应用方面也取得了一些可喜的成效( 尤崇杓等，1 9 9 5 ) 。随着新的研究手段( 化 学分析法、遗传工程、分子生物学、免疫学等) 的应用，在联合固氮菌与植物相互作用 机理研究中也取得了一些开拓性的成果。然而，由于联合固氮菌与宿主植物根系问只是 一种松散的联合关系，没有分化出有形的结构，使该领域的研究变得相当困难，对于联 合固氮菌一植物间的相互作用关系了解不深。同时，由于联合圃氮作用受土著微生物的 竞争、结合态氮、氧、植物基因型差异和环境条件的变化等多因素的影响而产生接种增 产效果不稳定的问题。尽管如此，许多田间观察结果及按种试验研究表明，联合固氮菌 对禾本科植物的生长确实起着积极的促进作用。田间资料表明。热带地区联合固氮菌对 禾本科植物的固氮量每年可达3 0 - 4 0 k g n 公顷( c h a l ke t a l ，1 9 9 3 ) ；埃及农业中心的研 究报道水稻接种巴西固氮螺菌n 0 4 0 后取得与常规施氮量同样的产量而节省氮肥1 4 1 3 的效果。另外，作为世界主要粮食作物的联合固氮菌的宿主植物( 水稻、小麦、玉米等) 仍不能自主固氮。再次，面对目前单施化肥带来的一系列负面影响，如何保持农业生念 环境的良性循环已成为世界现代农业生产中的一个重大课题。在此背景下，继续深入研 究联合固氮菌的固氮特征及其与宿主植物问的作用关系以及接种剂在农业中的应用效 益更具有特殊的意义。筛选出具有高效固氮活性、生长势强、适应性广、固氮稳定性好 的联合固氮菌株则是此类研究的关键。本论文分离、筛选得到一株固氮酶活性高，无外 源氮源下生长旺盛的圆氮菌分离物，并对该菌作了系统研究，以期对上述问题作进一步 的探讨。 文献综述 1 联合固氮概念的提出与发展 生物固氮研究已有百余年历史，而作为其中的一个重要分支一联合固氮的研究，则 只有几十年的历程。1 9 5 8 年，d 6 b e r e i n e r 、r u s c h e i 等首次从热带甘蔗的根际分离到固氮 细菌：拜叶林克氏菌( b e j e r i n c k i af l u m i n e n s i s ) ，并证实禾本科植物同样存在生物固氮潜 能。1 9 7 5 年，d 6 b e r e i n e r 实验室再次发现与禾本科植物联合共生的固氮菌：固氮螺菌 ( a z o s p i r i l l u m ) ，并提出根际联合圃氮的概念，认为根际中存在一类自由生活的能圊氮的 细菌，定殖于植物根表或近根土壤，部份则能侵入植物根的皮层组织或维管中，靠根系 分泌物生存繁殖，与植物根系有密切的关系，但并不与宿主形成特异分化结构，将植物 与细菌之间的这种共生关系称为联合共生固氮( a s s o c i a t i v es y m b i o t i cn i t r o g e nf i x a t i o n ) ， 现称联合固氮作用。 继d 6 b e r e i n e r 等人的发现之后，又相继发现许多具有重要经济价值的禾本科作物如： 甘蔗、水稻、玉米、牧草等存在明显的生物固氮现象，这引起了人们对禾本科植物生物 圃氰的极大关注然而，由于联舍圃氮菌与宿主植物根系之间只是一种松散的联合关系， 没有分化出有形结构，使该领域的研究具有较大难度，且由于受多种因素的影响联合固 氮效率不及共生固氮高，限制了联合固氮接种剂在农业中的应用。近年来，随着一些新 的研究手段包括化学分析、遗传工程、分子生物学、免疫学等方法的运用，推进了联合 固氮领域的研究深度。 2 业已发现的联合固氮菌种类及其特性 自根际联合固氮茵的概念提出以来，相继从禾本科植物根际发现了许多新的联合固氮 细菌，其中较普遍的如：甘蔗中发现的醋酸固氮菌( a c e t o b a c t e rd i a z o t r o p h i c s ) 、草螺菌 ( h e r b a s p i r i l l u ms e r o p e d i c a e ) ，卡拉草中发现的固氮弧菌( a z o a r u ss p p ) ，水稻和玉米中 发现的产碱菌( a l c a l i g e n e s ) 、固氮螺菌( a z o s p i r i l l u m ) 、芽孢杆菌( b a c i l l u s ) 、肠杆菌 ( e n t e r o b a c t e r ) 、草螺菌、克雷伯氏菌( k l e b s i e l l a ) 、假单胞菌( p s e u d o m o n a s ) 、固氮根 瘤菌( a z o r h i z o b i u m ) 等。同时，应用n 素平衡法、1 5 n 同位索稀释法和15 n 自然丰度技 术也证实了一些热带禾本科植物特别是甘蔗( s a c c h a r u ss p p ) 、湿生水稻( o r y z as a t i v a ) 和卡拉草( l e p t o c h l o a f u s c u ) 能通过生物固氮获得其生长所需的部分氮源( j a m e se ta l ， 2 0 0 0 ) 。根据禾本科植物联合固氮细菌的生理生态特征可将其大致分为三类：根际固氮菌、 兼性内生固氮菌、专性内生固氮菌。 2 1 根际固氮菌 包括定殖于植物根表的所有固氮细菌，如雀稗固氮菌( a z o t o b a c t e rp a s p a l i ) 、拜叶林 克氏菌( b e u e r i n c k i as p p ) 。许多研究表明这类细菌对宿主植物的有益影响主要在于其产 生的植物激素改变根系形态而促进植物的生长，因此也将这类菌归为根圈促生细菌 ( p l a n t g r o w t hp r o m o t i n gr h i z o b a c t e r i a ) ( b a s h a ne ta 1 ，1 9 8 9 ；z i m m e re ta 1 ，1 9 8 8 ) 。但也有 研究证实一些根际固氮细菌能增加植物氮素的积累。b o d d e y 等( 1 9 8 3 ) 发现在雀稗固氮菌 与雀稗( p a s p a l u mn o t a t u mc v b a t a t a i ) 的联合共生系统中植物可通过生物固氮积累氮素 2 0k h a 。y ，且这种联合共生关系具有严格的专性，但参与这种专一性联合共生关系 的化合物还不清楚，推测可能与在根瘤菌一豆科植物共生关系中起作用的分子信号类似。 另一种典型的根际联合固氮菌是拜叶林克氏菌( 以丑i n d i c a 和最f l u m i n e n s i s 为主) ， 主要与热带地区生长的甘蔗形成联合固氮关系。研究发现植株根系能分泌一些含糖化合 物，而这种细菌能优先定殖于植株的根际和根表，且主要集中于含糖化合物释放处，可 见植株通过这些物质调节着细菌在根部的定殖及其优势菌群的形成。推测可能正是不同 细菌对这些含氮化合物的竞争以及不同甘蔗品种所分泌的化合物的种类和数量的不同导 致了甘蔗中生物固氮现象的多样化( b a l d a n ie t a l ，1 9 9 7 ) 。 2 2 内生固氮菌 内生生物( e n d o p h y t e ) 原意是指在植物根内定居而不对植物造成伤害，在植物组织内 生活而不引起植物病害的微生物( 细菌和真菌) 。后来这个定义被延伸，指在土壤中生存 能力低，而主要定殖于植物根内部并能促进植物生长的一类微生物。由于一些细菌主要 定殖于禾本科植物根内，且能与植物进行联合固氮，因此d 6 b e r e i n e r 将“e n d o p h y t e ”这 个概念引入该领域，称为内生固氮菌( d 6 b e r e i n e re l a l ，1 9 9 2 ；f a l l i k 甜a 1 ，1 9 8 9 ) 。根据内生 固氮菌的特点不同，又可分为兼性内生固氮菌和专性内生固氮菌两类。 2 2 1 兼性内生固氮菌 这类固氮菌既能在根内也能在根表和土壤定殖，主要为固氮螺菌属( a z o s p i r i l l u m ) 的细菌，该属细菌为革兰氏阴性菌，能利用多种碳源和氮源进行代谢，在不良环境下形 成胞囊，同时分泌大量胞外多糖，并在体内形成聚b 羟基丁酸作为能源以渡过不良环境 ( s u b h a s h e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。目前已分离鉴定出的有以下5 个种，并对其生理生化、遗传学特征 有了进步认识： ( 1 ) 产脂固氮螺菌( “1 i p o f e r u m ) ：可利用柠檬酸、葡萄糖为碳源：具n 2 0 还原酶基 因，能同化亚硝酸盐及亚硝态氧化物；能产生植物激素，存在i a a 合成基因( b o t h e e la 1 ， 1 9 9 4 ；v a n d e 口fa 1 1 9 9 5 ) 。 ( 2 ) 巴西固氮螺菌( a b r a s i l e n s e ) ：能利用柠檬酸为碳源，但不能利用葡萄糖；具n 2 0 还原酶基因；存在i a a 合成基因( b o t h e e ta 1 ，1 9 9 4 ；v a n d ee ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 ( 3 ) 亚马逊固氮螺菌( 爿a m a z o m e n s e ) ：能利用蔗糖，并能在较广p h 值下生存：无 n 2 0 还原酶基因：能产生植物激素，存在i a a 合成基因( b o t h e e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 ( 4 ) 伊拉克固氮螺菌( a i r a n k e n s e ) ：能利用蔗糖作为碳源，并能水解果胶，耐高浓 度盐( 盐浓度可达3 ) ；无n 2 0 还原酶基因；不存在i a a 合成基因( b o t h ee t a l 。1 9 9 4 ；李 久蒂等，1 9 9 4 ) 。 ( 5 ) 高盐固氮螺菌口h a l o p r a e f e r e t l s ) ：从盐碱性土壤中分离到，在高盐浓度下生长和 固氮，固氮的最适温度为4 1 c ( r e i n h o l d e la 1 ，1 9 8 7 ) 。 尽管已知道固氮螺菌的许多生理生态特征，但固氨螺菌与植物问的相互作用机制仍 不十分清楚。近年在基因水平上的研究取得了一些进展，发现固氮螺菌具有一些与根瘤 菌同源的基因，这些基因在根瘤菌中调节着细菌一植物间的共生关系。 2 2 2 专性内生固氮菌 这是一类具有独特生理生化特征的固氮菌，在土壤中不能生存或生存能力很差，而 以相当高的数量存在于植物组织内。这一类群包括属于原细菌n 亚纲的醋酸固氮菌 ( a c e t o b a c t e r d i a z o t r o p h i c u s ) 和属于原细菌b 亚纲的固氮弧菌( a z o a r u ss p p ) 、织片草螺 菌( h e r b a s p i r i l l u ms e r o p e d i c a e ) 、红苍白草螺菌( h e r b a s p i r i l l u mr u b r i s u b a l b i c a n s ) 、伯克 霍尔德氏菌( b u r k h o l d e r i as p p ) 。这类细菌主要从植物根表皮细胞或次生根形成点的细胞 间隙处感染植物，经木质部扩散至植株上部。近年来的研究对它们的生理生化、生态学 及遗传学特征有一定的了解： ( 1 ) 醋酸固氮菌( a c e t o b a c t e rd i a z o t r o p h i c u s ) ：具有一定的宿主专一性，其宿主主要是 一些含糖丰富的植物如甘蔗、甜马铃薯、喀麦隆草等( r e i se ta 1 ，1 9 9 9 ) 。能耐高浓度糖 ( 1 0 ) 渗透；在酸性( p h 5 ) 条件下生长和固氮；缺乏硝酸盐还原酶；固氮酶活性不 受商浓度的n o a ( 2 5 m m ) 影响，高糖渗透下n h 4 + 能部分抑制固氮作用；耐氧，具有泌 铵能力( r e i se la 1 ，1 9 9 9 ；r e i s 口fa 1 ，1 9 9 4 ) 。含质粒，大小在5 0 一1 1 0 m d a ，在染色体上有 n i f 基因位点。其遗传多样性有限，这可能与寄主范围较窄及内生环境相对稳定有关 8 ( t e i x e i r ae ta 1 ，1 9 9 4 ) o ( 2 ) 织片草螺菌( h e r b a s p i r i l l u ms e r o p e d i c a e ) ：宿主范围广。从禾本科植物：玉米、高 粱、水稻、甘蔗、牧草和非禾本科植物油棕中都分离到该菌( b a l d a n i e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。能在高 蔗糖浓度下生长，但不利用蔗糖而偏好有机酸；固氮酶活性仅被1 0 m m 的n h 4 + 部分抑制； 耐氧。n i f a 基因已被克隆和测序，用n i f a 启动子区缺失的突变株研究发现n i f a 蛋白的表 达受n h 4 + 阻遏，但不受氧阻遏( i n d i r a e ta 1 ，1 9 9 6 ；o l i v a r e se ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 ( 3 ) 红苍白草螺菌( h e r b a s p i r i h u mr u b r i s u b a l b i c a n s ) ：宿主较专一，多局限于甘蔗，但 最近也从高梁、水稻、油棕中分离到。偏好有机酸，不能利用乙酰氨基葡糖，但能利用 内消旋赤藓糖醇。能引起某些甘蔗品种的条纹病，以前将该菌错归为假单胞菌属 ( p s e u d o m o n a s ) ，基于其d n a ：r r n a 同源性及一些生理特征，现将其归为草螺菌属 ( h e r b a s p i r i l l u m ) ( b a l d a n i e ta 1 ，1 9 9 5 ；f e r r e u ae ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 ( 4 ) 圆氮弧菌( a z o a r u ss p p ) ：是卡拉草中的优势菌群。在有机酸中生长良好，不能 利用碳水化合物，只能利用少数氨基酸：己检测到该菌能产生纤维素酶如胞外葡萄糖酶 ( e x o g l u c a n a s e ) 和内葡聚糖酶( e n d o g l u c a n a s e ) ，这两种酶可能与细菌入侵组织有关( h u r e k e l a 1 ，1 9 9 4 ) 。菌体内膜堆叠成管状，利用固氮酶抗血清的研究认为该膜可能是固氮作用的功 能膜，称为“d i a z o s o m e ”( h u r e k e ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 ( 5 ) 伯克霍尔德氏菌属( b u r k h o l d e r i as p p ) ：近来从水稻、木薯及某些水果上分离到。 3 根际联合固氮中细菌和植物的相互作用 3 1 根际联合固氮体系的建立 根际联合固氮是介于自生圆氮和共生圃氮体系中间的类型，它们未能形成象根瘤那 样的特化共生组织，是一种松散的共生关系，彼此之间依赖程度低。因此，d 6 b e r e i n e r ( 1 9 8 7 ) 建议将联合固氮菌在根表的定殖作为联合固氮体系形成的标志之一。一般说来，根际联 合固氮体系的形成包括趋化、结合、侵入三种途径。 ( 1 ) 趋化( c h e m o t a x i s ) 在根际土壤中联合固氮细菌在宿主植物根分泌物诱导下表现 出特异的趋根性。b e c k 等利用c 扩散法证明根分泌物中低分子量物质在短距离内有明 显的扩散梯度，在离根3 m m 以外根分泌物浓度锐减，而且接种后根系的1 4 c 扩散梯度的 延伸距离要比未接种根的短得多。同时，从根际土壤、根表到内根际，联合固氮菌在总 微生物区系中所占比例逐渐增加，这表明植物根分泌物的扩散影响了根际微生物的分布 ( r e i n h o l de ta 1 ，1 9 8 6 ) 。根分泌物中易于扩散的小分子物质诱导联合固氮细菌的趋根行为， 在联合固氮体系形成过程中可能起先导作用。不同菌株对有机酸的趋化性表现出一定的 差异。r e i n h o l d 等( 1 9 8 5 ) 报道不同来源的固氮螺菌在趋化行为上具有菌株特异性，c 3 植物 小麦分泌物中草酸含量高，从小麦根际分离的菌株对草酸的趋化性最强；而c 。植物玉米 分泌的苹果酸含量较高，从其上分离到的菌株对l 苹果酸趋化性最强。对粪产碱菌的研 究也发现该菌对水稻根分泌物中含量较高的有机酸组分显示出较强的趋化性，对某些氨 基酸组分虽能较好地用作碳源或氮源，却无趋化性( 林敏，1 9 9 2 ) 。 ( 2 ) 结合( a t t a c h m e n t ) 联合固氮细菌能通过各种途径如胞外多糖、纤毛、纤维丝等不 同机制结合到宿主植物根上，进而侵入内根际。与结合过程相关的因素有： 植物粘质：植物粘质含多种多糖组分，覆盖于根冠或根表外，为联合固氮细菌提 供适宜的生存环境。因此，联合圃氮细菌大多聚集在根表粘质部位，并刺激植物分泌更 多的粘质( v o s e e ta t ，1 9 8 1 ) 。 根表糖基的分布：v e r m e e r 等采用果糖专一性凝集素定位测定，发现该凝集素仅 结合在根冠或成熟根毛间的表皮组织上，表明果糖在玉米根上是呈定位分布的。从高梁 根上还发现两种类型的粘质，种粘质靠近根毛尖端，一种分布在根毛和初生根皮层细 胞壁上。根毛糖基的分布对联合圆氮菌在根表的分布产生何种影响目前尚不清楚，但对 糖基分布的认识有助于阐明联合固氮体系形成过程中的识别与结合机理。 植物凝集素：植物凝集素可能参与识别和结合过程。t a b a r y 等( 1 9 8 4 ) 用h c 乙酸 酐标记稻胚凝集素，发现水稻根际固氮细菌拜叶林克氏菌和产脂固氮螺菌4 b 能特异识别 并结合标记的稻胚凝集素，而玉米根际固氮细菌及对照大肠杆菌( e c o l i ) k 1 2 均无明显 的结合作用。结合试验还证明在细菌表面存在一组单一类型的凝集素结合位点。其它的 研究也发现联合固氮菌与麦胚凝集素的结合与细菌胞外多糖有关( y a g o d a e ta 1 ，1 9 8 8 ) 。 细菌胞外多糖：联合固氮菌胞外多糖成份多样，可能与结合特异性有关。t r o t h ( 1 9 9 0 ) 报道巴西固氮螺菌菌株s p 7 的胞外多糖含葡萄糖、半乳糖、果糖和鼠李糖，分子 摩尔比为3 ：2 ：2 ：1 。菌株s p 2 4 5 的胞外多糖含葡萄糖、鼠李糖、半乳糖，分子摩尔比 7 ：4 ：l 。另有报道固氮螺菌胞外多糖含两种有机酸。在粪产碱菌胞外多糖组份中还检 璺i i 到氨基酸残基( 林敏，1 9 9 2 ) 。互补试验还证明联合固氮细菌与共生固氮细菌的胞外多糖基 因( e x o ) 在遗传上具有高度同源性( e y e r s e ta t ，1 9 9 0 ) 。然而，在联合回氮体系形成过程 中细菌胞外多糖是否具有结合功能，相关报道说法不一。利用胞外多糖突变株的研究发 现突变株结合宿主植物根的能力与野生型相同( a r u n k u m a r i e ta 1 ，1 9 9 0 ) ，e y e r s 等( 1 9 9 0 ) 则 0 证明突变株与小麦根的结合能力减弱了4 1 0 倍。 细菌纤毛：研究表明纤毛在结合过程中起重要作用。电镜观察发现固氮肠细菌如： e n t e r o b a c t e r s p 和k l e b s i e l l as p 与根表结合时首先通过数目不详的纤毛与根相迪 ( k o r h o n e ne ta 1 ，1 9 8 6 ) 。纤毛在结合过程中起作用的相关证据还有：带有纤毛的细菌与植 物根结合更有效；应用放射性标记纤毛证明细菌结合到植物根毛；对纤毛专一的免疫球 蛋白g 的f a b 片段抑制细菌的结合( k o r h o n e ne t 口，1 9 8 6 ) 。细菌纤毛的结合部位主要在根 毛区、伸长区和粘质层。这种结合缺乏严格的宿主专一性。 细菌表面蛋白性多束纤维丝：有些联合固氮细菌不具备纤毛，但在其细胞表面有 种与纤毛功能类似的蛋白性多柬纤维丝，这种结构被称为“蛋白桥”( 甜o t e i nb r i d g e ) ( b a s h a n ，1 9 9 1 ) 。l e v a n o n y ( 1 9 9 0 ) 报道巴西固氮螺菌通过这种束纤维丝结构与根表或土壤 团粒连接。通过遗传手段获得的纤维丝缺陷型，加e d t a 或蛋白酶使纤维丝合成终止或 将其降解，菌体均丧失结合能力。b a s h a n ( 1 9 9 1 ) 通过电镜还清晰地看到细菌与根表及细菌 闻连结着一种多束纤维丝状物，推测这种纤维丝可能有类似于胞外多糖的组成与结构。 ( 3 ) 侵入( i n v a s i o n )联合固氮细菌能通过已退化的根毛、分生组织空隙、侧根初生 空隙或果胶酶轻度水解及机械损伤等造成的通道侵入植物根组织内，侵入部位包括：皮 层细胞或细胞间隙、通气组织、分生组织、空泡及维管。大量的基因标记技术和酶链免 疫检测技术已证明联合固氮细菌能够侵入宿主植物根内并在植物组织内正常存活( h u r e k e la 1 ，1 9 9 0 y o ue la 1 ，1 9 9 1 ) 。 3 2 联合固氮菌对植物的促进作用 根际的早期概念是指植物分泌有机物使土壤微生物得以生存的地方。同时微生物在 根际的活动又使得根际土壤在化学组成、物理结构及生物学性质等方面不同于原土体。 在根际中植物和细菌是相互作用、相互依附的关系。从许多田间观察结果及接种试验研 究也表明，禾本科植物根际或体内的联合固氮菌对植物的生长起着积极的促进作用。这 种作用可归功于以下几个方面： ( 1 ) 为植物提供氮源：一方面，联合固氮菌通过固氮酶的作用固定大气中的氮气，大 部分的氮为自身利用，而相对于植物来说，细菌的生命周期远小于植物，当细菌死亡矿 化后，释放出的氮可直接为植物吸收利用”n 气体吸收法等的研究表明联合共生固氮菌 为植物提供的氮多数是以这种方式提供f l q ( b r e m e r e la 1 ，1 9 9 5 ) ；另一方面，也有研究发现 有些联合固氮菌能将固定的氮素直接供给植物吸收同化。c o j h o ，r e i s 等( 1 9 9 3 ) 利用醋酸 固氮菌与淀粉水解酵母混合培养模式系统研究发现细菌至少能将其固氮总量的4 8 释放 到培养液中供酵母( 摸拟植物) 吸收利崩，c r u z ，t e i x e i r a 等( 也证实了铵是醋酸幽1994) 氮菌在固氮作用下分泌的产物，这表明细菌可能从体内分泌部分n h 。+ 而使宿主受益。另 外，运用基因工程改良的泌铵型固氮菌株，可将固氮产物快速转运给植物吸收，近年来 已分离筛选到多个性能稳定的泌铵突变株。 ( 2 ) 产生植物激素类物质：大量的研究表明，接种根际联合固氮菌在不同的环境和土 壤条件下对植物的生长，尤其是在幼苗期有明显的促进作用。主要原因在于细菌产生的 槛物激素影响了宿主根的呼吸速率和代谢，并刺激根毛和次生根的形成，h u s s a i n ( 1 9 8 7 ) ， f a l l i k ( 1 9 8 9 ) 等都发现接种固氮菌、固氮螺菌于玉米后产生i a a 、a b a 等植物生长调节物 质。也有研究报道接种联合固氮菌增加了宿主植物内源激素的代谢。 ( 3 ) 微生态调节，当联合固氮菌在根际微域或植物体内部形成优势菌群后，可以起到 调节植物根际及体内生理生念平衡的作用，即在植物根或体内形成生物屏障，阻止有害 菌的入侵和定殖，起到生物屏障的保护作用( 占新华等，1 9 9 9 ) 。 ( 4 ) 其它：如联合固氮菌在植物根部定殖可使宿主根的质子流增加而刺激植物对矿物 质的吸收( b a s h a n e ta 1 ，1 9 8 9 ) ，也有研究报道联合固氮菌增加硝酸盐还原酶的活性而有助 于植物吸收同化土壤中的氮素( d 6 b e r e i n e e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 4 联合固氮菌的农业应用及存在问题 4 1 联合固氮菌在农业上的应用现状 近年来，利用联合固氮菌作为田间接种剂的研究已在世界各国广泛丌展，并取得一 些可喜的成绩：o k o n ，c o n j a l e j ( 1 9 9 4 ) 评价了2 0 多年来很多国家采用野生型固氮螺菌作 为菌剂在用间接种，以统计学上有意义的增产率5 3 0 计算，认为6 0 一7 0 的接种试 验是成功的，但主要作用应归功于固氮菌产生的植物激素。近十多年来，许多研究报道 相继证实了植物内生固氮菌的存在及其对宿主植物的显著的氮营养贡献。巴凶种植目赋 有上百年的历史，蔗田施氮量一直不高但持续高产，而土壤氮储量并不下降，用n 稀释 法和氮素平衡法研究表明，感染内生固氮菌的甘蔗可从生物固氮获得总氮量6 0 的氮素， 有些品种甚至可达8 0 ( b 0 0 d e yp ，a 1 ，1 9 9 5 ；c a v a l c a n t ee ta 1 ，1 9 8 8 ；d 6 b e r e i n e re ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 更多的报道也证实了渍水水稻中内生菌有明显的固氮作用( b o d d e y e ta 1 ，1 9 9 1 ；s u b h a s h 口， a 1 ，2 0 0 1 ) 。我国自“七五”起就开始了水稻联合固氮的研究，随后进行了大规模的联 合固氮菌剂的试验研究和示范推广应用。据中国农科院1 9 9 3 1 9 9 4 年向全国2 0 个省、市、 自治区所作的调查结果显示，小麦、水稻、玉米使用相应的根际联合固氮菌剂可增产1 0 左右( 林凡等，1 9 9 8 ) 。之后，国家“8 6 3 计划课题组开始采用生物技术方法构建基因工 程固氮菌株，并将通过鉴定的三株耐铵工程菌：粪产碱菌( a l c a l i g e n e s f a e c a l i s ) a 1 5 2 3 、 阴沟肠杆菌( e n t e r o b a c t e rc l o a c a e ) e 2 6 1 3 、催娩克氏杆菌( k l e b s i e l l ao x y t o c a ) n g l 3 9 0 ， 在全国南北方1 2 个省、市、自治区进行试验、推广应用，面积达3 2 万h m 2 ，各地资料汇 总分析表明水稻以0 3 0 7 5 k g h m 2 铀剂浸种均有不同程度的增产效果，增产幅度为 5 1 一7 4 ( 林凡等，1 9 9 8 ) 。李永兴等( 2 0 0 0 ) 通过3 年f f | 问小区试验证明在玉米上接种导 有n i f a 基因的耐铵工程菌产气肠杆菌( e n t e r o b a c t e rg e r g o v i a e ) e 7 与接种野生型及无菌载体 相比在增产和节肥上有明显效益，在肥力较低的白浆土、砂壤土中增产幅度可达1 2 3 ， 且这个结果有较好的规律性和重现性。然而，相当多的试验研究也得到不一致的结果， 施振云等( 2 0 0 0 ) 对2 年3 个试验点产量进行多年多点试验结果联合分析发现联合固氮菌在 习惯用肥量下能有效提高玉米苗期素质，明显增加玉米每穗数6 1 而获得7 5 的增产率， 而在不施肥条件下，增产效果不显著。另外的研究也报道在水稻、小白菜、莴苣上接种 根际联合固氮菌有明显的增产趋势，但多数性状的差异未达5 的显著性水平，因此他们 认为，在生产上用联合固氮菌剂完全替代氮素肥料是不切实际的，但可作为一种辅助的 农业措施( 张英等，2 0 0 0 ) 。固氮螺菌n 0 4 0 在红壤性水稻上的接种应用也得到类似的结 粜，接种后水稻新展开叶的叶绿索含量、株高及秸杆干物重有显著提高，但水稻的增产 作用未达到显著水平( 方萍等，2 0 0 1 o 4 2 联合固氮菌接种剂在农业应用中存在的问题 综上所述，普遍的结果显示接种联合固氮菌剂后都有促进植物生长的趋势，并伴随有 一定的增产效应，但这种增产效果不稳定，所见报道增产率在5 - 3 0 之间，还有相当多的 试验结果表明在中低肥力下，接种处理可提高产量5 8 ，但在高肥水平下接种增产效 应不明显，或增产低于正常施肥接种等。究其原因，主要是由于联合固氮菌与根系的联 合只是松散的结合而没有形成稳定的共生结构，使得固氮效率易受外界环境的影响，导 致了接种效果的不稳定。总的说来，影响联合固氮菌接种效果的主要因素有： ( 1 ) 土著微生物的竞争：大量研究表明在自然条件下固氮菌很少能成为根际细菌菌群 的优势部分，数量一般占总数的l 一1 0 ，在有机质丰富的土壤中中土著菌的数量高，会降 低接种菌的定殖和竞争力，只有在的氮素贫乏的土壤中才会表现出竞争的优势( b a s h a he t a 1 ，1 9 8 9 ；李永兴等，2 0 0 0 ；徐继等，1 9 9 7 ) 。一般认为，在新垦土壤上的接种效果好于 熟化土壤。经基因工程改良的泌铵突变株、许多具专一性的内生固氮菌株也面临同样的 问题( k e n n e d y e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 ( 2 ) 植物基因型差异和环境条件的变化：用1 5 n 稀释法和n 自然丰度法的研究表明 甘蔗能通过联合固氮固定相当一部分氮气，但固氮能力因植物基因型和环境条件的差异 而高度可变( w ue t a l ，1 9 9 5 ) 。s h r e s t h a ，l a d h a ( 1 9 9 6 ) 对7 0 个不同水稻基因型研究发现，水 稻的从空气中获得的氮量( n d f a 值) 不相同，在0 到2 0 2 之问变化。u r q u i a q a 等( 1 9 9 2 ) 人也指出巴西甘蔗的生物固氮量也依赖于供水量及磷、钟和微量元素特别是钼的有效性。 ( 3 ) 结合态氮：结合态氮( 氨、亚硝酸盐、硝酸盐等) 会阻遏固氮酶的合成，抑制某 些细菌固氮酶的活性，因此当氮源充足的情况下，联合固氮菌优先利用环境中的氮。一 般土壤中结合态氮的浓度在5 - 5 0 0m g k g 下就能抑制或消除接种后土壤的固氮酶活性( 徐 继等，1 9 9 7 ) 。 ( 4 ) 氧：微生态环境中氧的水平是影响联合固氮菌的固氮效率一个重要因子，氧不可 逆地使大多数固氮菌的固氮酶失活并调节固氮酶的合成，只有在低氧分压下固氮速率才 达到最高水平。 5 发掘和利用禾本科植物的固氮潜力的努力方向 针对长期单一施用化学肥料带来的土壤肥力下降，农产品品质下降和农业环境面源污 染加剧等一系列对农业可持续发展的负面影响，鉴于业已发现的联合周氮菌的宿主植物 大多为具有重要经济价值的作物如甘蔗、水稻、小麦、玉米、牧草等不能自主固氮的禾 本科植物，积极发掘和利用联合固氮作用的潜力对农业可持续发展更具特殊的意义。然 而，联合固氮菌接种剂的应用由于受上述因素的影响，而表现出接种效果不稳定的问题， 从而限制了联合固氮菌在农业中的应用。近年来，世界各地的研究工作者积极地从各个 方向努力，以求获得禾本科植物联合固氮的最大利用。 ( 1 ) 基因工程菌的构建：应用基因工程构建耐铵、泌铵型联合固氮菌。至今已获 得多个含抗铵阻遏基因n i f a 的耐铵固氮菌，如a 1 5 2 3 、e 2 6 1 3 、n g l 3 9 0 ( 林吧等，1 9 9 8 ) ： 含吸氢酶基因h u p 的高吸氢效率的工程菌；能将固定的铵分泌出菌体外的突变型泌铵固 氮菌株，从接种效果来看 ：陛凿的促生作用好于野生型( 李永兴等，2 0 0 0 ) 。但需 进一步解决提高其与土壤微生物的竞争能力和保持高的固氮活性等问题。固氮基因向 非豆科植物的转移。要使非豆科植物获得固氮能力，至少需要1 6 个固氮基因的转移，而 且需要解决固氮酶的氧敏感性，转移基因在真核生物中的表达调控等问题，这需要相当 4 长时间的努力才能取得成功。 ( 2 ) 诱导禾本科植物形成固氮根瘤。用纤维素酶、果胶酶降解根尖细胞壁( c o c k i n g e l a l ，19 9 0 ) 或用植物生长调节剂2 , 4 一二氯苯氧乙酸( 2 ，4 一d ) ( r i d g ee la 1 ，19