（物理化学专业论文）抗体单分子膜的制备及传感性能的研究.pdf

抗体单分子膜的制备及传感性能的研究 抗体单分子膜的制备及传感性能的研究 指导教师：冯春梁教授 研究生：孙越 学科专业：物理化学 研究方向：生物传感器 中文摘要： 利用自组装单分子膜( s a m s ) 技术，以碳二亚胺和戊二醛为偶联剂和交联剂在金等基 础电投上固定羊抗小鼠i g g 抗体，制备电位型无标记免疫传感器。主要进行了如下几方亟的 研究： 1 基础电极的选择 首先分别测定了真空蒸镀的金片电极、金圆盘电极、银圆盘电极的电位随时间变化曲线， 结果证明电位信号比较稳定，这些电极可作为电位型免疫传感器的基础电极。然后在上述电 极表面通过自组装单分子膜技术固定抗体，制备免疫传感器，从传感器的检测下限、检测范 围、工作曲线的斜率等角度对传感器进行评价比较，真空蒸镀的金片电极实验结果最好，所 以选择真空蒸镀的金片电极作为本实验的基础电极。 2 自组装单分子膜体系的选择 将s h ( c h 2 ) 1 0 c o o h 和e g 6 0 c h 2 c o o h 以及半胱氮酸分别组装在真空蒸镀的金片电极表 面，制成单分子膜电极，测定它们在醋酸盐缓冲溶液中的平衡电位，与裸金电极相比，平衡 电位变化很大，说明三种巯基化合物在金片电极表面上形成了自组膜。通过碳二亚胺偶联剂 在三种自组膜上固定抗体制备免疫传感器，发现巯基十一酸自组膜免疫传感器的灵敏度较 好，检测范围最宽。所以选择巯基十一酸作为碳二亚胺法制各免疫传感器的自组膜体系。又 分别使用碳- - w 胺偶联法和戊二醛交联法在半胱氮酸自组膜上固定抗体制各免疫传感器。对 比发现，使用戊二醛交联法时，传感器的检测范围较宽。所以对于半胱氨酸自组膜体系使用 戊二醛交联法固定抗体的效果较好。 3 抗体( 抗原) 分子的最佳固定化条件 通过查阅文献及实验室前期j 作确定抗体的固定化条件为3 0 0 c ，p h = 5 5 。 抗体单分子膜的制备及传感性能的研究 4 最佳测试条件的确定 选定2 5 5 5 c 的温度范围，p h 4 ，0 p h 7 0 的酸度范围进行免疫反应通过实验结果确 定3 0 。c ，p h5 5 作为免疫反应的最佳实验条件。 5s h ( c i - 1 2 ) 1 0 c o o h 自组膜免疫传感器的性能研究 本实验系统研究s h ( c h z ) t 。c 0 0 h 自组膜免疫传感器性能，电极的检测下限可达0 4 n g m l ， 检测范围0 4 1 2 n g m l 相关系数为0 9 9 1 2 。响应时间为1 4 m i n ，重现性较好，使用0 0 4 m o l l h c l 可使其再生，电极寿命可达1 6 天。 6 半胱氮酸自组膜免疫传感器的性能研究 系统研究半胱氨酸自组膜免疫传感器的性能，得到电极的检测下限为o 0 5 n g m l ，检测 范围为0 0 5 5 n g m l ，相关系数为0 9 9 3 1 。电极的响应时间为1 4 r a i n ，使用甘氨酸盐酸缓冲 溶液可使其再生。 关键词：自组装单分子膜；免疫传感器：抗体：抗原 2 抗体单分子膜的制备及传感一| 生能的研完 1 前言 传感器是一种信息获取与处理的装置。比如人体的感觉器官就是套完美的传感系 统，通过眼、耳、皮肤来感知外界的光、声、温度、压力等物理信息，通过鼻、舌感知气味 和味道等化学刺激。生物传感器与此类似，是一类特殊的传感器，是一门由生物、化学、物 理、医学、电子技术等多种学科相互渗透成长起来的高新技术“。1 。 自1 9 6 2 年a a r k 和l y o n s 提出生物传感器的设想以来，随着生物感觉系统作用机制的进 一步阐明，以及近代生物技术、电化学分析技术及微电子技术的飞速笈展，生物传感器的研 究和应用开发取得了长足的进步”。生物传感器具有选择性好、灵敏度商、分析速度快、 成本低、能在复杂的体系中进行在线连续监测等的特点。生物传感器的高度自动纯、微型化 与集成化，减少了对操作环境和使用者技术的要求，适合野外现场分析的需求，在生物、医 学、环境监测、食品、医药及军事医学等领域有着重要的应用价值，己引起世界各国的极大 关注。 1 1 生物传感器简介 1 1 1 生物传感器的工作原理 干扰物质 特异性生物敏感膜 图卜1 生物传感器的工作原理 3 抗体单分子膜的制备及传感性能的研究 生物传感器由两部分组成：其一是敏感元件，由具有分子识别功能的生物活性物质( 如 酶、微生物、动植物组织切片、抗原或抗体等) 构成，其二是信号转换器，通常为电化学电 极、热敏电阻、压电器件、场效应晶体管、光纤等。当分子识别元件与待测物特异反应后， 将引起质量、电荷密度、光强度、热等信号变化，信号转换器可将这些信号转变为可以输出 的电信号，监测反应前后的信号变化，就可以达到分析检测的目的“4 1 。 1 1 2 生物传感器的分子识别元件 作为生物传感器，首先必须具备良好的选择性，这就要求构成生物识别元件的生物活性 物质对待测物有特异的识别功能，即显示出选择的亲和性。分子识别机理直接决定了后续信 号转换器的类型，是决定生物传感器性能的关键因素，生物活性物质的分子识别主要与以下 生化过程有关： ( 1 ) 酶促反应“：酶是由生物体内产生并具有催化活性的一类蛋白质。在反应过程中 酶与底物形成了酶一底物复合物，此时，酶的构象对底物分子显示识别能力。 ( 2 ) 免疫化学反应“1 ：抗原( a n t i g e n ，a g ) 是外界入侵到体内的异物，而抗体 ( a n t i b o d y ，a b ) 是该异物入侵后体内生成的一种蛋白质。抗体与抗原特异结合形成复合物， 抗体与相应抗原的反应可表示为； a g + a b ；= a g a b 与酶促反应不同，通常酶只对低分子量物质有识别能力，而抗体则对高分子量物质有很强的 识别能力，即使是微小的结构差异也能做出明确的判断。 ( 3 ) 离子在膜上的选择传输“：通常做法是将生物活性物质固定在某种膜上，形成 响应特定离子的选择性膜。在检测过程中，生物活性物质作为载体，承担了目标离子的传送 t 作。 ( 4 ) d n a 杂交反应“：其理论基础是碱基配对原理，在其检测过程中，形成的杂交体 通常置于电化学活性指示剂中( 如氧化一还原活性阳离子金属络合物溶液中) ，指示剂可以 强烈同时又可逆地结合到杂交体上，产生的信号可以用电化学方法检测。 i 1 3 生物传感嚣的分类 4 抗体单分子膜的牵l 备及传感性能的研克 生物传感器依据传感器的生物识别元件及信号转换器不同可进行如下分类”4 1 。 生物传感器的生物识别元件主要有：酶、微生物、抗原抗体、动植物的细胞组织等。 因此相应的可以将生物传感器分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、组织传感器等 如图卜2 。 图l _ 2 按分子识别元件划分的各类生物传感器 图卜3 按信号转换器划分的各类生物传感器 生物传感器所用的信号转换器主要有：电化学电极、热敏电阻、场效应管、压电零件和 光换能器等。相应的生物传感器可分为：电化学生物传感器、热敏型生物传感器、场效应管 5 抗体单分子膜的制备及传感一l 生能的研究 生物传感器、压电晶体生物传感器、测光型生物传感器和等离子体共振i ! 生物传感器，其中 电化学生物传感器可分为电位型、电流型和电导型，测光型生物传感器包括吸光型、反光型 和发光型，场效应管生物传感器则可细分为离子敏感型、酶敏感型、免疫敏感型，声波生物 传感器可细分为声板波、声表面波、声体波生物传感器，热敏型生物传感器可按材料及作用 原理分为玻璃热敏电阻、塑胶热敏电阻、高温用热敏电阻、极低温用热敏电阻、临界温度热 敏电阻等等，如图卜3 。 1 1 4 生物传感器的应用 有人把2 1 世纪称为生命科学的世纪，也有入把2 1 世纪称为信息科学的世纪。生物传感 器正是在生命科学和信息科学之问发展起来的一门交叉学科。生物传感器研究的全面展开 是在2 0 世纪8 0 年代，2 0 多年来发展迅速，在食品工业、环境监测、军事领域、医学等方 面得到了高度重视和广泛应用。 ( 1 ) 食品工业 生物传感器在食品工业中的应用包括对食品成分、食品添加剂、有害毒物及食品鲜度等 的测定分析。如：葡萄糖的含量是衡量水果成熟度和贮藏寿命的一个重要指标，已开发的酶 生物传感器“”可用来允析白酒、苹果汁、果酱和蜂蜜中的葡萄糖等。亚硫酸盐通常用作食品 工业的漂白剂和防腐剂，采用亚硫酸盐氧化酶为敏感材料制成的电流型二氧化硫酶电极“” 可用于测定食品中的亚硫酸盐含量。 ( 2 ) 环境监测 环境监测对于环境保护非常重要。传统的监测方法有很多缺点：分析速度慢、操作复杂 且需要昂贵仪器，无法进行现场快速监测和连续在线分析。生物传感器的发展和应用满足了 人们的要求。如：在河流中放入特制的传感器及其附件可进行生化需氧量( b o d ) 的现场监 测，传统方法需5 天，b o d 的微生物传感器只需1 5 m i n 即能测出结果“”。二氧化硫( s 如) 是 酸雨酸雾形成的主要原因，传统的检测方法很复杂，m a r r y 等人“8 1 将亚细胞类腊固定在醋酸 纤维膜上，和氧电极制成电流型生物传感器，可对酸雨酸雾样品溶液进行检测。 ( 3 ) 军事领域 现代战争往往受核武器、化学武器、生物武器的威胁。侦检、鉴定利测验是整个“三防” 医学中的重要环节，是有效防护化学战和生物战的前提。由于具有高度特异性、灵敏性和能 快速地探测化学战剂和生物战剂( 包括病毒、细菌和毒素等) 的特| 生，生物传感器将是最重 6 抗体单分子膜的制备及传感性能的研究 要的一类化学战剂和生物战剂的侦检1 具。如：近年来，美国陆军医学研究和发展部研制的 酶免疫生物传感器具有初步鉴定多达2 2 种不同生物战荆的能力，美国海军研究出d n a 探针 生物传感器，在海湾沙漠风暴作战中用于检测生物战剂。 ( 4 ) 医学领域 医学领域的生物传感器发挥着越来越大的作用。借助子这一技术可动态观察抗原、抗体 之间结合与解离的平衡关系，可较为准确地测定抗体的亲和力及识别抗原表位，帮助人们了 解抗体特性，有目的地筛选各种最具潜力的抗体药物。在临床医学中，酶电极是最早研制且 应用最多的一种传感器利用具有不同生物特性的微生物代替酶，可制成微生物传感器，在 军事医学中，对生物毒素进行及时快速检测。国内沈冒励“”研究小组应用自组装单分子膜技 术固定日本血吸虫抗体对日本血吸虫抗原进行检测，与传统的检测方法相比速度更快，且电 极的稳定性和重现一眭都较好。将不同的抗体作为识别元件刮成免疫传感器就可对其相应的抗 原进行检测，对各种传染病、癌症、自身免疫性疾病的快速诊断具有重要意义。 1 1 5 生物传感嚣的发展过程及现状 生物传感器是化学传感器的一个分支。t 9 6 2 年c l a r k 和l y o n s 提出酶电极的设想1 ， 他们把酶溶液夹在两层透析膜之间形成一层薄的液层，再紧贴在p h 玻璃电极、氧电极或电 导电极上，用于监测液层中的反应。1 9 6 7 年u p d i k e 和h i c k s 最先“研究固定化酶，井制作 出葡萄糖传感器( g o d 氧电极) 对血糖进行检测，也是他们创建了“酶电极”这一名称。7 0 年 代末j a n a t a 首先提出免疫传感器的概念。8 0 年代以后，生物技术和微电子技术的发展大 犬促进了生物传感器的发展，1 9 8 4 年( b i o s e n s o r s 生物传感器杂志在英国创刊。1 9 8 7 年 b i o s e n s o r sf u n d a m e n t a la n da p p l i c a t i o n 生物传感器基础及应用由牛津出版社出版； 从此，生物传感器便进入了蓬勃发展的阶段。 到目前为止，生物传感器大致经历了3 个发展阶段：6 0 年代初产生了第一代生物传 感器，这个时期是生物传感器的摇篮期，这一代生物传感器是直接将生物成分截留或结合在 膜上，酶电极研究是这一时期的主要特征。第二代生物传感嚣是将生物活性成分直接吸附或 共价键合到转换器的表顽，无需非活性的基质膜测定时不必向样品中加入其他试剂，利用 自组装单分子膜技术固定酶或抗体等制作的传感器就是第二代生物传憋器。第二代生物传感 器”“是指在无媒介体存在下利用生物活性成分与电极间的直接电子传递制作的生物传感 器。即把生锈成分直接固定在电子元什上，直接感知和放大界面物质的变化，从而把生物识 7 抗体单分干膜的制备厦传感性能的研究 别和信号的转换处理结合在一起，炅霞琴。”等利用纳米金技术加强葡萄耱氧化酶的固定，由 于纳米颗粒的特性，金纳米颗粒可作为导线，使酶的氧化还原中心与铂电极之间的直接电子 传递成为可能，从丽为直接电子传递的第3 代生物传感器的研制提供了技术信息。 近年来，在生命科学、信息科学和材料科学发展的推动下，生物传感器技术飞速发展。 可以预见，未来的生物传感器将具有以下特点【1 5 l ： 功能多样化：未来的生物传感器将进一步涉及医疗保健、疾病诊断、食品检测、环境篮 测、发酵工业的各个领域。目前，生物传感器研究中的重要内容之就是研究能代替生物视 觉，听觉和触觉等感觉器官的生物传感器，即仿生传感器。 微型化：随着微加工技术和纳米技术的进步，生物传感器将不断地微型化，各种便携式 生物传感器的出现将使人们在家中就能进行疾病诊断，在商场中就能直接检测食品。 智能化与集成化：未来的生物传感器必定与计算机紧密结合，自动采集数据、处理数据， 更科学、更准确地提供结果，实现采样、进样、结果一条龙，形成检测的自动化系统。同时， 芯片技术将越来越多地进入传感器领域，实现检测系统的集成化、一体化。 低成本、高灵敏度、高稳定性和高寿命：生物传感器技术的不断进步，必然要求不断降 低产品成本，提高灵敏度、稳定性和延长寿命。这些特性的改善也会加速生物传感器市场化、 商品化的进程。 1 2 免疫传感器简介 免疫传感器是生物传感器的一种，将高灵敏度的传感技术与免疫反应的特异性结合起来， 用以监测抗原、抗体反应的生物传感器称作免疫传感器。免疫传感器和传统的免疫测试方法 相似，都属于固相免痰测试法，即把抗原或抗体固定在固相支持物表面，来检测样品中的抗体 或抗原。不同的是，传统免疫测试法的输出结果只能定性或半定量地判断，且一般不能对燕个 免疫反应过程的动态变化进行实时监测。免疫传感器不但能实现定量检测，还可以在抗原、 抗体反应同时就把信号动态而连续的记录下来，有利于抗原、抗体反应的动力学分析，另外 它还可以使免疫检测手段向自动化、简便化和快速化方向发展。 1 2 1 免疫传感嚣的分子识别元件一抗原膜、抗体膜 l2 1 1 抗原 8 抗体单分子膜的制备及传感性能的研究 抗原( a n t i g e n a g ) ”是指能刺激机体的免疫系统、诱导免疫麻答并能与应答产生的如 抗体或致敏淋巴细胞发生特异反应的物质。一个完整的抗原应包括两方面的免攫性能：免 疫原性( i m m n n o g e n i e i t y ) ：指诱导生扬体产生免疫应笞豹能力，具有这种能力的物质称为免 疫原( i m m u n o g e n ) ；免疫反应性( i m m u n o r e a c t i v i t y ) ：指抗原与抗体发生特异性结合的能 力，亦称为反应原性。有些物质在独立存在时只具有反应原性而无免疫原性，称为半抗原 ( h a p t e n ) 。抗原是免疫应答的始动因子，机体免疫应答的类型和效果都与抗原的性质有密切 的关系。 1 2 1 2 抗原的特异性 抗原的最大特点之一是其免疫效应具有特异性( s p e c i f i c i t y ) ，这种特异性在其免疫原 性和反应原性两方面都表现得非常突出。例如大肠杆菌诱导的免疫应答只能针对大肠杆菌； 流感病毒不能诱导出对大肠杆菌的免疫力，与抗大肠杆菌抗体也不发生反应。这就是传统免 疫学进行免疫预防和免疫诊断的基本依据。抗原的特异性“1 与其蛋白质分子中的氨基酸种 类、排列顺序、空间构形等因素有关，甚至与其电荷性质及亲水性也有关系。但是其特异性 不是平均地决定于整个分子，而是取决于分子表面几个氨基酸残基组成的特殊序列及其空间 结构，这种特殊序列或空间结构称为袭位( e p i t o p e ) 或抗原决定簇( a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t ) 。 正是这些表位被生物体的淋巴细胞识别而诱导免疫应答，被抗体分子识别而发生免疫反应， 这是抗原特异性的基础。 ( i ) 袁位的构成 表位是抗原分子中几个氮基酸残基组成的特殊结构，在免疫反应中能全方位地与淋巴细 胞或抗体分子接触。表位的构成方式o ”至少有两种：由某些氨基酸残基按一定顺序连续排 列组成的线状序列，称为顺序( s e q u e n t i a l ) 表位或线性( 1 i n e a r ) 表位。顺序表位是蛋白质 分子的一级结构，比较稳定，不受蛋白质加热变性和空间构形改变的影响。由分子内不连 续的2 3 个氨基酸残基折叠排列所形成的三维结构构成，称为构象( c o n f o r m a t i o n a l ) 表位。 有时候，呈a 螺旋式排列的连续肽链序列也可起到构象表位的作用。对构象表位识别的抗 体可用来研究蛋白分子在生理或病理过程中三维结构的变化，但是构象表位是蛋白质的二级 或二级结构，不太稳定，在蛋白质受热或酶解交性后会彻底破坏，不能恢复，因此分离和研 究比较困难。 9 抗体单分子膜的制备及传感性能的研究 ( 2 ) 表位的数目和定位“ 抗原分子上表位的数目可以用饱和情况下能够结合多少个抗体分子来测定，一般情况f 表位数目与抗原的分子量呈正相关。例如鸡卵蛋白的分子量为4 2 千道尔顿( k d ) ，有5 个表 位；甲状腺球蛋白的分子量7 0 0 k d ，有大约4 0 个表位。一个表位能结合抗体分子上的一个 抗原结合点所以可将抗原分子表位的数目称为抗原的结合价。虽然一个抗原分子上可以有 多个表位，但在诱导生物体免疫应答时可能只有种或一个表位起主要作用，使生物体产生 以该特异性为主的免疫应答，这种现象称为免疫显性或免疫优势( i m m u n o d o m i n a n e e ) ，起关 键作用的表位称为显性表位，这个原则也适用于一个表位中不同的氨基酸残萋，在表位中也 有所谓的显性基团存在，如被置换会明显改变表位特异性。这种现象可能与表位在抗原分子 中的位置或显性基团在表位中的位置有关。 1 2 1 3 抗体 抗体“是在对抗原刺激的免疫应答中，b 淋巴细胞产生的一类耱蛋白，亦称作“免疫球 蛋白”，以i g ( i m m u n o g l o b u l i n ) 表示，现已发现的免疫球蛋白有5 种，分别命名为i g g ，i g a ， l g m ，i g d 和l g e ，无脊椎动物不产生免疫球蛋白。鱼有l g m ，两栖类有i g m 和l g g 。除人 类有5 种免疫球蛋白外，大多数哺乳动物只有i g g ，i g a ，g m 和i g e 四种免疫球蛋白。抗体 主要分布在体内血清中，“抗血清”即是指含有某种特异抗体的动物血清。由于抗原与抗体 反应具有高度的特异性，因此往往无需纯化抗血清而直接用于检验。 免疫球蛋白具有蛋白质的通性“，能被多种蛋白水解酶裂解，可以在乙醇、三氯乙酸 或中性盐类中沉淀，常用5 0 的饱和硫酸铵或硫酸钠从免疫血清中提取抗体球蛋白。i g 分 子由4 条肽链组成，2 条长链称为重链( h e a v y e h a i n ，h ) ，由大约4 4 0 个氨基酸残基组成， 分子量约5 0 7 0 k d ；2 条短链称为轻链( 1 i g h t c h a i n ，l ) 由大约2 2 0 个氨基酸组成，分子 量约2 2 5 k d 。4 条肽链通过链间二硫键( 一s s 一) 连在一起，其结构模式见图1 4 。i g 分子 肽链的n 端，在l 链1 2 和h 链1 4 处，氨基酸的种类和顺序各不相同，称为可变区( v a r i a b l e r e g i o n ，v 区) ；i g 分子肢链c 端部分的氮基酸，在种类和顺序上彼此间差别不大，称 为稳定区或恒定区( c o n s t a n t r e g i o n ，c 区) 。h 链和l 链还各有3 个高变区( h y p e r v a r i a b l e r e g i o n ) ，其中的氨基酸残基种类和顺序特别多变。这些都与直接识别抗原有关，为i g 分子 的抗原结合部位，故亦称为互补决定区( c o m p e m e n t a r i t y d e t e r m i n i n g r e g i o n ，c d r ) 。可变 1 0 抗体单分子膜的制备及传感性能的研究 区中的氨基酸排列顺序里高度变异性，其高变区对应的v l 和v h 形成袋状，随氨基酸残基的 不同形状各异，以能与多种多样的抗原决定簇相适应，构成抗体特异性的分子基础。 搜基端 图卜4 免疫球蛋白( i g g ) 结构模式图 1 2 2 抗原与抗体的反应 区 抗原抗体反应( a n t i g e n a n t i b o d yr e a c t i o n ) 是指抗原与相应抗体之间所发生的特异 性结合反应。可发生于体内( i n v i v o ) ，也可发生于体外( i n v i t r o ) 。体内反应可引起吞噬、 溶菌、杀菌、中和毒素等作用；体外反应则根据抗原的物理性状、抗体的类型及参与反应的 介质( 例如电解质、固相载体等) 不同，可出现凝集反应、沉淀反应及中和反应等各种不同 的反应类型。 1 2 2 t 抗原抗体反应的原理 抗原与抗体能够特异性结合是基】= 两种分子间的结构互补性与亲和性，这两种特性是由 抗原与抗体分子的一级结构决定的。抗原抗体反应可分为两个阶段。第一为抗原与抗体发生 1 1 抗体单分子膜的制备厦传感性能的研充 特异性结合的阶段，此阶段反应快，但不出现可见反应。第一二为可见反应阶段，抗原抗体复 合物在环境因素( 如电解质、p h 值、温度等) 的影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集、 沉淀、溶解等肉眼可见的反应。此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。实际上这两个阶 段不能严格区分，而且两阶段的反应所需时间亦受多种因素和反应条件的影响，若反应开始 时抗原抗体浓度较大且两者比例适合，则很快能形成可见反应。生物传感器检测的免疫反应 一般只是第一阶段的反应。 ( i ) 亲水胶体转化为疏水胶体“” 抗体是球蛋白，大多数抗原亦为蛋白质，它们溶解在水中皆为胶体溶液，不会发生自然 沉淀。这种亲水胶体的形成机伟是因为蛋白质含有大量盼氮基和羧基残基，这些残基在溶液 中带有电荷，由于静电作用，在蛋白质分子周围出现了带相反电荷的电子云。如在p h 7 4 时， 某蛋白质带负电荷，其周围出现极化的水分子和阳离子，这样就形成了水化层再加上电荷 的相斥，就保证了蛋白质不会自行聚合而产生沉淀。抗原抗体的结合使电荷减少或消失，电 子云也消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。此时，如再加入电解质，如n a c i 。则疏 水胶体会进一步相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。 ( 2 )抗原、抗体间的作用力1 有四种分子闻作用力参与并促进抗原抗体间的特异性结合。 电荷引力( 库伦引力或静电引力) 这是抗原抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间 相互吸引的力。例如，一方在赖氮酸阳离子化的氨基残基( 一n 时) ，另一方在天门冬氨酸电 离后阴离子化的羧基( - - c 0 0 一) 时，即可产生静电引力，两者相互吸引，可促进结合。这种 引力和两电荷间的距离的平方成反比。两个电荷越接近，静电引力越强。反之，这种引力便 很微弱。 范德华力这是原子与原于、分子与分子互相接近时发生的一种吸引力，实际上也是电荷引 起的引力。由于抗原与抗体两个不同大分子外层轨道上电子之间的相互作用，在某一瞬间会 产生电荷，分子受到极化面形成偶极子。偶极予会形成电场，在这个电场中可使其它分子极 化。新产生的偶极子与原来的偶极子之间便形成引力。这种引力与两个分子或原子间距离的 7 次方成正比。 氢键结合力氢键是由分子中的氢原子和电负性大的原子如氮、氧等相互吸引而形成的。当 具有亲水基团( 例如- - o h ，一n 如及c 0 0 h ) 的抗体与相对应的抗原彼此接近时，可形成氢 键桥梁，使抗原与抗体相互结台。氢键作用力较范德华力强，并更具有特异性，因为它需要 有供氢体利受氢体才能实现氢键结合。 抗体单分子膜的制备及传感性能的研究 疏水作用抗原抗体分子侧链上的非极性氰基酸( 如亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等) 在水溶 液中与水分子间不形成氢键。当抗原表位与抗体结合点靠近时，相互间正、负极性消失，由 于静电g l 力形成的亲水层也立郎失去，排斥了两者之阊的水分子，从而促进抗原与抗体间的 相互吸引而结合。这种疏水结合对于抗原抗体的结合是很重要的。 1 2 2 2 抗原抗体反应的特点 ( 1 ) 特异性抗原抗体的结合实质上是抗原表位与抗体上抗原结合点之间的结合。由于两 者在化学结构和空闻构型上呈互补关系，所以抗原与抗体的结合具有高度的特异性。这种特 异性如同钥匙和锁的关系。例如大肠杆菌诱导的免疫应答只能针对大肠杆菌。较大分子的蛋 白质常含有多种抗原表位，如果两种不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、抗体间 构型部分相同，就会出现交叉反应。 ( 2 ) 按比例在抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。无论在一 定量的抗体中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗体，均可发现只有在两 者分子比例合适时才出现最强的反应，早在1 9 2 2 年r a m o n 和1 9 2 6 年d e a n w e b b 就发现了这 种最适比，称为“时最适比”，也就是说，以这样的比例混合反应速度最快。 ( 3 ) 可逆性。”“抗原抗体反应遵循生物大分子热动力学反应原则，其反应式为： a b a g a b a g = k t k z ：k 式中各反应项的单位以m o l 表示，k 。表示正反应速率常数，k ：为逆反应速率常数，k 是反应 平衡时的速率常数。由上式可知，k 值是反映了抗原抗体间的结合能力，所以抗体亲和力通 常以k 值表示。抗原抗体复合物解离取决于两方面的因素，一是抗体对相应抗原的亲和力； 二是环境因素对复合物的影响。高亲和性抗体的抗原结合点与抗原表位的空间构型上非常适 合，两者结合牢固，不容易解离，反之，低亲和性抗体与抗原形成的复合物较易解离。解离 后的抗原或抗体均能保持来结合前的结构、活性及特异性。在环境因素中，凡是减弱或消除 抗原抗体亲和力的因素都会使逆向反应加快，使复合物的解离增加，如p h 值改变，过离或 过低的p h 值均可破坏离子间电引力消失。对亲合力本身较弱的反应体系而言，仅增加离子 强度即可达到解离抗原抗体复合物的目的，增加温度可增加分子的热能提高分子运动速率， 加速已结合的复合物的解离，但由于温度变化易致蛋自质变性，所以实际工作中极少应用。 改变p h 值和离子强度是最常用的促解离方法，免疫技术中的亲和层折就是以此为根据来纯 化抗原或抗体的。 1 3 抗体单分子膜的制备及传感性能的研究 1 2 3 电化学免疫传感器 根据检测信号的不同，电化学免疫传感器可分为三种类型：电位型、电流型和电导型免 疫传感器。 1 2 3 l 电位型免疫传感器 ( 1 ) 电位型无标记免疫传感器它是利用抗原或抗体在求溶液中解离带电的特性，将其中一 种固定在电极表面或膜上，当另一种与之结合形成抗原抗体复合物时，原有的膜电荷密度将 发生改变，从而引起膜的唐南( d o n n a n ) 电位和离子迁移的变化，最终导致膜电位改变。早 期的研究者利用此原理测定了人血清中的梅毒抗体、人血清白蛋白，并完成了血清鉴定。 y a m a n o 等。“分别将人绒毛膜促性腺素( h c g ) 抗原或其抗体固定在钛金属电极表面，检测了 h c g 及其抗体。袁若1 等利用吸附在铂电极表面的高氟化( 离子交换) 树脂( n a f i o n ) 膜中 负电性的磺酸基与乙型肝炎表面抗体分子中的氨基阳离子之间的静电作用实现抗体结合，制 得的高灵敏度电位型免疫传感器可对乙型肝炎抗原进行检测，检测下限可达3 1 n g m l 。这 种电位型无标记免疫传感器制作及其所需设备相当简单，只需2 支电极、l 台电位计，而且 抗原、抗体不需标记，方便在体连续检测，并且随着各种敏感膜的问世，以及固定化技术、 膜电极制各技术的提高，这一领域的发展有望发生较大突破。 ( 2 ) 电位型非酶标记免疫传感器在这种类型传感器中所使用的标记剂不是酶而是其它标 记剂。如s m b a 等“1 以t p a ( 四苯基铵离子) 为标示物检测了类脂抗原和相关抗体，他们将t p a + 和类脂抗原 ( e 一二硝基苯氨基乙酰基) 一磷脂酰乙醇胺 包埋在微腊粒中，当将此微脂 粒与相应抗体和补体( 存在于正常人和动物血清中不耐热、非特异、能补充抗体作用的蛋白 质体系) 一起温育时，由于特异的抗体和补体的作用产生免疫溶解，从微腊粒中释放出大量 的t p a + ，这个变化起到了放大作用，释放出的t p a + 用t p a 。离子选择性电极和板形a g a g c l 电 极，采用薄层电位法进行测定，从而实现对类脂抗原的检测。因为没有酶的放大作用，又多 了标记步骤。所以这类传感器优势不大。 ( 3 ) 电位型酶标记免疫传感器它是将免疫化学的专一性和酶化学的灵敏性融为一体，在 对低含量物质的检测中发挥着重要作用。标记酶通常为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱 - | 生磷酸酶和脲酶等，这些酶或结合在敏感膜上，或标记在抗原( 或抗体) 上，或游离在测定液 1 4 抗体单分子膜的剐备及传感- | 生能的研究 中，它们的底物或产物可以通过电位的变化检出。m f y u l a e v 等”“将辣根过氧化物酶标记 在由西马三嗪( 种农药) 制备的抗原上，通过酶标抗原和未标记抗原与固定在电极上的抗 体的竞争反应，对西马三嗪进行检测，检测下限可达3 n g m l ，全部的免疫反应分析过程只 需1 4 m i n ，与传统酶联免疫分析( e l i s a ) 方法所需1 5 2 h 相比，大大节省了人力物力和 财力。 1 2 3 2 电流型免疫传感器 电流型免疫传感器是在恒定电压的情况下监测由于抗原抗体结合或继后反应中电流的 变化，有持久和广阔的发展空间。 ( i ) 电流型非酶标记免疫传感器用作标记的电插性物质有f e ( c n ) e “f e ( c n ) 。“、二茂铬 铁、p b ”、z n 等，采用电活性物质标记抗原而进行的均相电化学免疫测定主要是根据抗原、 标记抗原对定量抗体进行的竞争结台。s u s m a l 等。”制作了测定食品中病原菌的非酶标记电 流型免疫传感器，在铁氰化钾溶液中，当待测抗原与固定的抗体结合时阻碍了铁氰根离子向 电极表面的扩散，依据测定一定时间内通过的电囊来确定扩教系数的变化，从而测定待测物。 ( 2 ) 电流型酶标记免疫传感器这种传感器是以酶免疫测定为基础，采用电流型电极将酶 底物的浓度变化或其催化产物的浓度变化转变成电流信号的测定装置。这类传感器又可分为 夹心型和竞争型，夹心型( s a n d w i c h ) 如k r c ) g e r 等”制作的2 ，4 - 滴( 一种农药) 电流免疫 传感器，他们将一定浓度的葡萄糖氧化酶标记的2 ，4 - 滴抗体与抗原溶液混合反应一段时问 后再与固定到电极袭蕊的抗体结合，通过催化产物的电流响应间接测定待测溶液中2 ，4 - 滴的浓度，竞争型( c o m p e t i t i r e ) 型如m o o r e 1 等制作的检测2 ，4 ，6 - - - 氯苯甲醚的电流型 免疫传感器，这种传感器是由于标记抗原和非标记抗原竞争地与固定在传感器上的抗体膜发 生反应而结合到电极表面上，通过检测酶催化底物产生的电流信号，进而达到检测的目的。 1 2 3 3 电导型免疫传感器 电导型免疫传感器是将被测物氧化或还原后电解质溶液电导的变化作为传感器信号的 输出从而实现物质的检测。它是一种经典的电化学分析方法，但选择性却很差，所以电导 法的应剧一直在较小范围内。近些年来国内外一些生物电化学分析家，巧妙的把酶分析法的 特异性干电导分析法的高灵敏度结台起来，成功的用于某些底物的测定和酶活陛的测定，为 电导分沂法开辟了新领域，如s a n d b e r g 等i 将抗体固定在一层导电薄膜上，制作了一种测 1 抗体单分千膜的制备覆传感性能的研完 定莠去津( 一种农药) 的电导型免疫传感器( c o n d u t o m e t r ci m m u n o s e n s o r ) ，利用标记酶催化 产物引起电导变化来定量待测物，检测下限可达到o 0 2 5t tg 几。 1 2 。4 免疫传感嚣发展前景 免疫传感器是生物活性分子( 抗体或抗原) 与电子信号转换元件的结合。一方面，免疫 传感器以抗体一抗原亲和反应为识别基础，所以具有很高的选择性；另一方面，免疫活性单 元是通过一定的基底固定在检测仪器上的，基底和附着在基底上的共存物的引入就可能影响 免疫反应的专一性。这种来自于基底以及与基底共存物质的干扰仍是免疫传感器研究中有待 解决的问题。 抗体与抗原反应的特异性与其可逆性是免疫传感器技术的一个重要问题。免疫反应的可 逆性与高度的敏感性相互制约，这在许多平衡反应中是显而易见的。此外，免疫传感器发展 的另一趋势是供一次性使用的传感器，这就要求把研究的目光放在能大规模、廉价生产，并 且操作简便的技术上。 免疫芯片是免疫传感器技术发展的趋势。芯片分析实际上也是传感器分析的组合。芯片 点阵中每一个微单元都是一个传感器的探头。通过芯片检测可以大大提高检测效率，减少工 作量，增加可比性。如马立人的研究小组”“，他们在石英晶片上先沉积一层8 列6 行的金 膜阵列，用分子自组装及e d c 偶联技术将人i g g 、兔i g g 和鼠i g g 固定在金膜阵列上来制各 免疫芯片，用异硫氰酸荧光素( f i t c ，一种荧光染料) 标记兔抗羊i g g ，夹心法可同时测定 革抗人i g g 、羊抗兔i g g 和羊抗鼠i g g 。利用样点荧光强度与空白的比值作定量指标，在抗 体浓度0 5 l o o mg l 内，比值与抗体浓度的对数成线性关系。最低可检出0 5 mg l 的 革抗兔i g g 。测定仅需样品1 5 0ul ，2 3 h ，适合于快速微量分析。 免疫传感器相对于一般免疫检澳4 方法的主要优势在于它不但能弥补目前常规免疫检测 方法不能进行定量检测的缺点而且还能实时监测抗原抗体反应，不需分离步骤，有利于抗 原、抗体反应的动力学分析，所以它的另一发展趋势是免疫捡澜手段向自动化、简便化和快 速化方向发展。 总之，集生物学、物理学、化学及医学为一体的免疫传感技术发展潜力巨大，它不但能 推动传统免疫测试法的发展，而且将对临床检验和环境监测等领域产生深远影响。 抗体单分子膜的制备及传感性能的研宽 1 3 利用自组装单分子膜技术固定化抗体膜、抗原膜 生物活性物质的固定化是生物传感器得以开发和改进的重要技术背景，固定化的生物分 子除可以保持其原有的识别、结合、催化或药理活性外，还具有易于分离、稳定性好和可重 复使用等突出的优点。生物分子的固定化技术兴起于本世纪五六十年代，为了研制廉价、灵 敏度高、选择性好和寿命长的生物传感器，固定化技术已成为世界各国竞相研究和探索的领 域。经过近二十年的不断努力，国内外学者已建立了对不同功能分子物质的固定化方法，传 统的有吸附法“、包埋法“”、交联法、蛋白质a ( 或g ) 固定法1 等，近年来又有一些新的 方法如；湖南大学沈国励、俞汝勤研究小组”利用等离子体聚合膜、纳米金、静电吸附等固 定方法对压电免疫传感器进行了深入研究；南京大学鞫煜先、陈洪渊研究小组”“”利用t i 映 气相沉积溶胶凝胶技术固定c a l 9 9 ，c a l 2 5 ，h o g 等肿瘤标记物于载体表面以及利用免疫和纳 米组装技术构建高活性的酶一免疫结合物一纳米金胶载体的三维有序膜，发展了一系列肿瘤标 志物免疫传感器；中山大学蔡沛祥研究小组“”利用自组装单分子膜技术，并结合交联技术， 通过双功能试剂把抗体固定在电极表面，制得电位型免疫传感器；国外学者s u 等”利用自 组装单分子膜技术和e d c 、n h s 偶联剂在金基底上固定抗体，制得压电免疫传感器，成功实 现了对大肠杆菌的高灵敏度检测。 这些方法中，金属( 如金) 表面的自组装单分子膜技术的应用越来越广泛“”】。用自组 装单分子膜修饰的电极克服了以前的修饰方法如吸附法、包埋法不能完全控制分子的取向或 排列的缺点，可以在分子水平上按人们预期的目标进行设计，它是传统修饰电极方法的一大 发展，达到了单层化学修饰电极的最高峰。 1 3 1 自组蓑单分子膜的发展过程及现状 自组装单分子膜( s e l f a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ，s a m s ) 是近2 0 年来发展起来的一种新型 有机超薄膜，其制各技术及表征方法己得到巨大发展。翠在1 9 4 6 年z i s m a n 等。“就报道了表 面活性物质在洁净金属表面上吸附而形成单分子膜的现象，不过这项工作的真正兴起始于 8 0 年代，1 9 8 0 年s a g i v 报道了十八烷基三氯硅烷在硅片上形成的s a m s ，1 9 8 3 年n u z z o 等1 成功地制备了烷基硫化物在金表面的s a m s ，从此几种制各s a m s 的体系逐渐成熟和发 7 抗体单分子磋的制备及传感性能的研究 展起来”。 目前，s a m s 技术已经在基础研究和应用研究中取得了突破性的进展和重要成就，主要有 对s a m s 的结构及其自组装机理的认识”“：在分子器件和相关技术如单分子元件、分子开 关、分子电路、分子嫁接等方面的研究。；在纳米尺度上的图案加j 及相关技术的研究“”： 分子设计的灵活性和多样化，超分子及聚合物自组装体系的研究”“；斯表征技术方法的出现 和采用等“。 研究自组装技术可向人们提供进一步认识和控制微观世界的机会，提供从分子、原子水 平上设计分子器件，进行功能表面工程的有效途径，然而s a m s 技术仍处于起步阶段，离应用 还有很大距离，今后发展的方向及需要解决的重点课题有：( 1 ) 设计和制备具有特定功能的薄 膜体系1 。( 2 ) s a m s 的制备一般需要特定的并经过特殊处理的固体表面，其开发应用受到很 大的限制，因此开展对基底表面无依赖性s a m s 的研究显得十分重要，例如可尝试在聚合物膜 表面上进行单分子膜的组装”。( 3 ) 目前对s a m s 的结构及形成机理已经有了较为深入的认 识，但对影响并在一定程度上控制成膜因素的认识还不确定1 ，其规律性还没有被发现，这 方面的研究还有待于进一步深入。 1 3 2 自组装单分子膜的结构 如图i - 5 ，s a m s 从组成结构上可分为三部分：一是分子的头基，它与基底表面上的反 应点以共价键( 如s i 0 键及a u s 键等) 或离子键( 妇c 盼a g + ) 结合，这是一个放热反应， 活性分子会尽可能占据基底表面上的反应点；二是分子的烷基链，链与链之间靠范德华力使 活性分子在固体表面有序且紧密的排列，相互作用能一般小于4 0 k j m o l ，分子链可通过分 子设计引入特殊的基团使s a m s 具有特殊的物理化学性质；三是分子末端基团，如c h a 、一 c o o h 、o h 、n l i ：、s h 、c h = c h 2 及c ；c h 等，其意义在于通过选择末端基团以获得不 同物理化学性能的界面或借助其反应活性构筑多层膜。 1 3 3 自组装单分子膜的分类 自从z i s m a n 等”“开创性的发现和研究了在固舟瘦界面上物质自然地“自组”成高度有序 单分子层的方法以来，已发展了多种类型的自组膜。常见的组装体系主要有：脂肪酸及其j 生物s 心s ，育机硅烷类s a h i s 和烷基硫酵类s a m s 。 1 8 抗体单分子膜的制备及传感性能的研究 尾端基霞 烧基链 头基 基底 图卜5 自组装单分子膜的结构 1 3 3 1 脂肪酸及其衍生物s a m s 在近十几年中，人们对脂肪酸及其衍生物在a l ，a g ，c u 等金属氧化物表面的s a i s 的形 成机理和结构进行了系统的研究，以脂肪酸在铝表面的吸附为例，其自组装机理”为：在空 气中，a l 的表面极易形成一层大约4 6 n m 厚的a l 。醌膜，a l 原子除了直接与0 原子结合外 还可能与羟蒸或水分子结合，此时a l 原子带一个正电荷，吸附时，羧酸电离产生带负电荷 的羧基并与带正电荷的a l 原子键合，以离子键形式牢固地结合在一起，而羧酸电离产生的 h 则可能与a l z o ，表面的0 结合成删或与o h 结合生成h 2 0 。a l l a r a 等”1 研究了末端基团 分别为c h a c h 如，c = c h 的脂肪酸在a l 。0 。表面的s a i s 的结构，对羧基与基底的键 合方式、分子的取向、膜与空气的界面结构进行了探讨。 i 3 3 2 有机磕烷类s a m s 有机硅烷类s a m s 所用单体多采用氯取代或烷氧基取代的长链有机硅烷分子，基底表面 一般多为羟基化的s i 0 2 、a lz o ：、石英、玻璃、云母、金等表面“”。s a m s 中硅烷分子与基底 以共价键结合，分子之间相互聚合，因此较稳定，自抵抗较强的外作用力或侵蚀，在色谱、光 学纤维、微电子装置、防腐及润滑等领域中有较大的应用前景”。其自组装机理现在基本有 了一致的看法”：首先，头基si c l 。吸收溶液中或固体表面上的水发生水解生成硅醇基 一s ( o h ) ；，然后与基底表面0 h 以s 卜悄【共价键结合摹分子膜中分子之同也以s i o 1 9 二=y盎_1 一 苎竺兰坌! 壁竺型鱼垦生壁兰塑箜! 塞 s i 聚硅氧烷链聚合( 溶液中还存在硅烷分子之间的自聚竞争反应) ，x p s 及i r 谱已经证实 了头基- - s