（农药学专业论文）不同小麦对甲基二磺隆耐药性及安全剂对耐药性的影响.pdf

中国农业大学硕士学位论文中文摘要 摘要 本文采用温室试验方法研究了6 个小麦品种对磺酰脲除草剂甲基二磺隆的敏感性，研究了耐 性品种( r - 6 ) 和敏感品种( s 1 8 ) 之间的生理生化差异。 甲基二磺隆( 剂量为1 6 o g h a 1 ) 与安全剂吡唑解草酯( a ef 1 0 7 8 9 2 ) ( 剂量为6 0 0 m l h a - ) 一起使用可以相应地抑制小麦的株高生长。生测结果表明，抗6 号耐药性最强，敏1 8 号最敏感， 其株高抑制率l c 5 0 值前者是后者的5 倍。陇春0 1 5 、民和8 5 3 、徐州8 7 6 3 3 、扬麦1 1 号为中等耐 药性品种。 以丙酮酸钠为底物，靶标酶a l s 离体研究表明不同小麦a l s 含量和活性有一定的差异。 抗6 号a l s 含量最高，敏1 8 号最低。抗6 号的a l s 活性是敏1 8 号的2 5 倍，对甲基二磺隆的 敏感性后者则是前者的5 倍。可见，不同小麦对甲基二磺隆的敏感性差异可能与其靶标酶a l s 的敏感性有关。 测定了安全剂对小麦生长及a l s 活力、g s h 含量和g s t 活性的影响，结果表明：低浓度安 全剂刺激敏1 8 号小麦的生长，对抗6 号的影响则较小，高浓度则都抑制了小麦幼苗的生长。安 全剂提高小麦的a l s 活性：吡唑解草酯4 0 0 p _ m o l l 处理后抗6 号的a l s 活性提高1 5 8 ，敏 1 8 号的提高2 5 。安全剂对g s h 含量没有显著影响，却增加了敏感、耐性小麦的g s t 活性：吡 唑解草酯处理后抗6 号g s t 活性提高了8 3 ，敏1 8 号提高了1 0 2 。 本研究认为不同小麦对甲基二磺隆的敏感性不同，其敏感性可能与靶标酶a l s 有关安全剂 提高了小麦a l s 活力，也提高了g s t 的活力，增强了除草剂的代谢，从而增加了小麦对甲基二 磺隆的耐药性。 关键诃：甲基二磺隆；安全剂：乙酰乳酸合成酶；谷胱甘肽；谷胱甘肽s 转移酶 a b s t r a c t s e n s i t i v i t y o fs i xw h e a tc u l t i v a r st o s u l f o n y l u r e ah e r b i c i d e m e s o s u l f u r o nw a ss t u d i e di nt h e g r e e n h o u s e b i o c h e m i c a l d i f f e r e n c e sb e t w e e nt h e m e s o s u l f u r o n t o l e r a n c e ( r - 6 ) a n dm e s o s u l f u r o n - s e n s i t i v e ( s - 1 8 ) c u l t i v a r sw a s a l s oe x a m i n e d m e s o s u l f u r o nc a t1 6 o g - h a “) p l u ss a f e n e ra ef 1 0 7 8 9 2 ( a t6 0 0 m lh a “) r e d u c e dt h es h o o th e i g h to f t h ew h e a tc u l t i v a r s a c c o r d i n g l y r 6 w a st h em o s tt o l e r a n ta n ds - 1 8w a st h em o s ts e n s i t i v et o m e s o s u l f u r o n t h em e s o s u l f u r o nc o n c e n t r a t i o nr e q u i r e dt or e d u c es h o o tl e n g t hb y5 0p e r c e n t a g e c o m p a r e d w i t ht h ec o n t r o lw a sa b o u t5 - f o l d h i g h e r w h e a tc u l t i v a r s o fi o n g c h u n 0 1 5 ，m i n h e 8 5 3 ， x u z h o u 8 7 6 3 3a n d y a n g l 1w e r ea l lm o d e r a t e l yt o l e r a n c et om e s o s u l f u t o n nv i t r os t u d i e s ，a c e t o l a c t a t es y n t h a s e ( a l s ) ，t h et a r g e te n z y m eo fs u l f o n y l u r e ah e r b i c i d e sw a s e x t r a c t e df r o mr - 6a n ds - 1 8 a n dt h es p e c i f i ca c t i v i t yw a sa s s a y e dw i t hp y r u v a t ea ss u b s t r a t e ，a l sl e v e l o f r - 6w a st h em o s th i g h e s ta n ds - 1 8w a st h el o w e s t t h es p e c i f i ca c t i v i t yo f a l si nr - 6w i t hc o n t r o lw a s 2 5 - f o l dh i g h e r t h a n t h a to fs - 1 8 t h e l a t t e r a l ss e n s i t i v i t y t o m e s o s u l f u r o n w a s5 - f o l dh i g h e r t h a n t h a t o f t h ef o r m e r ni sh y p o t h e s i z e dt h a td i f f e r e n t i a ls e n s i t i v i t yt om e s o s u l f u o ni nw h e a ti sm o s t l yd u et oa l e s ss e n s i t i v ea l s t h ee f f e c t so fs a f e n e ro nt h eg r o w t ha n da l sa c t i v i t yw e r ea l s oe x a m i n e d i ts h o w e dt h a tl o w c o n c e n t r a t i o n o f a ef 1 0 7 8 9 2c o u l ds t i m u l a t e t h e g r o w t ho f s - 1 8c u l t i v a r s b u th a d l i t t l ee f f e c to n t h er - 6 c u l t i v a r s h i 【曲c o n c e n t r a t i o no f a e f 1 0 7 8 9 2c o u l di n h i b i tt h eg r o w t ho f b o t ho f t h et w oc u l t i v a r s a f i e r t r e a t e dw i t h4 0 0 p m o l ，la ef 1 0 7 8 9 2a l sa c t i v i t i e so fr - 6a n ds 1 8w e r ei n c r e a s e dt o1 5 0 a n d2 5 r e s p e c t i v e l y t h eg s hl e v e lw a sn o ta f f e c t e db yt h es a f e n e r t h eg s ta c t i v i t y i nr - 6a n ds - 18w a s i n c r e a s e d t o8 3 a n d1 0 2 a f t e r t r e a t e d w i t l l4 0 0 p m o l l a e f l 0 7 8 9 2 - i tc a nb ec o n c l u d e dt h a tt h ed i f f e r e n tr e s p o n s e so fw h e a tc u l t i v a r st om e s o s u l f u r o nm a yb ep a r t l y d u et ot h et a r g e ts i t es e n s i t i v i t y s a f e n e ri n c r e a s e dt h ea l sa c t i v i t ya n di ta s oi n c r e a s e dt h eg s t a c t i v i t yo ft h et w oc u l t i v a r s ，w h i c hm a ye n h a n c et h em e t a b o l i s mo f t h eh e r b i c i d e ，t h u si n c r e a s e dt h e t o l e r a n c et om e s o s u l f u r o n k e y w o r d s ：m e s o s u l f u r o n ；s a f e n e r s ；a c e t o l a e t a t es y n t h a s e ( a l s ) ；g l u t a t h i o n e ( g s h ) ；g l u t a t h i o n e s - t r a n s f e r a s e ( g s t ) 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导f 进行的研究l 作及取得的研究成果。尽我所 知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：谢艳红时间：2 0 0 4 年5 月1 9 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的 复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：谢艳红 导师签名a ， 时间：2 0 0 4 年5 月1 9 日 时间：斗年6 月l 曰 第一章前言 磺酰脲类除草剂是除草剂进入超高效时代的标志它使除草剂的使用量由以前的l - 3 k g ( a i ) h m 2 ，变为1 - 2 0 0 9 伍i ) h m 2 ，此领域的研究是化学农药最活跃的研究领域之一。由于其活性 高、用量低、杀草谱广、选择性强、对作物安全、在环境中不积累、毒性低等特点，近年来在农 业生产上已广泛应用，发挥了巨大作用。但残留药害和杂草的抗药性问题已经成为此类除草剂发 展的严重障碍，因此，研究磺酰脲类除草剂选择性机理具有普遍意义。 安全剂是一类随除草剂应用而开发的化合物，它们能保护作物免受除草剂的伤害，其开发与 研究已成为除草剂研究中的新领域，在化学除草应用中日益发挥重要作用。除草剂安全剂作用机 制的研究已引起人们的广泛注意，然而确切的作用机制仍未阐明。3 甲基二磺隆油悬浮剂( 世玛) 是b a y e r 公司于2 0 0 2 年推出的新型苗后麦田磺酰脲除草剂该药中含有安全剂毗唑解草酯( a e f 1 0 7 8 9 2 ) 。安全剂能否提高小麦对甲基二磺隆的耐药性以及其作用机理如何，目前国内外都未见 报道。为此，本文研究了小麦对甲基二磺隆的耐药性机制以及安全剂对不同小麦品种靶标酶及代 谢酶( a l s 、g s h 及g s t ) 的影响，以期为不同小麦品种对甲基二磺隆耐药性机理以及安全剂对 耐药性的影响研究提供科学依据，为提高甲基二磺隆使用的安全性、扩大其应用范围等提供理论 基础，并为安全剂作用机制的研究提供更多的例证。 1 1 磺酰脲除草剂研究进展 1 1 1 磺酰脲类除草剂的发展概况 磺酰脲类除草剂首次由美国杜邦公司于1 9 7 4 年研究成功随后被开发成有使用价值的一系 列超高效的内吸传导型选择性除草剂。我国广泛应用的磺酰脲类除草剂主要品种有绿磺隆、甲磺 隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、苄嘧磺隆、吡嘧磺隆等，防治大多数阔叶杂草( 包括对2 ，4 一d 类除草剂产 生抗性的杂草) ，对禾本科杂草也有一定的抑制作用【l “。 磺酰脲除草剂作用机理是抑制乙酰乳酸合成酶( a l s ) ，目前针对这一靶标的除草剂开发异 常活跃，新品种不断问世，新的结构类型不断被发现。现在除了磺酰脲类还有眯唑啉酮类、水杨 酸类等十几种类型的化台物。该类药剂对农药的发展和农业生产都起到了积极的作月= | 。但残留药 害和杂草的抗药性问题已经成为此类除草剂发展的严重障碍，尤其是残留药害更为突出j 。绿磺 隆由于在土壤中的残效期较跃，己危及非靶标作物如玉米、小麦、大豆、棉花和甜菜等，在我国 大部分地区已经被禁用p i 。即使是选择性较好的苄嘧磺隆( 水稻田用) 、氯嘧磺隆( 大豆田用) 、 玉嘧磺隆( 玉米田用) 等使用不当或条件不适也会对相应的作物品种造成伤害。a l s 抑制剂的药 害问题已经成为我国除草剂药害的主要问题。2 0 0 0 年四川南部县市使用含有2 5 甲磺隆绿磺隆复 配的除草剂造成几千亩玉米、红苕发生药害：2 0 0 1 年又有几个县使用扑拿净绿磺隆混剂造成大丽 积后茬玉米、花生、棉花、辣椒、大豆等药害，造成重大经济损失。四川、陕西等省农业厅不得 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 不采取行政干预的方法禁止使用甲磺隆、绿磺隆及其复配产品。网此，迫切需要开发出新的 高效、安全、对环境友好的新药或剂型。 1 1 2 麦田磺酰脲除草剂使用概况 小麦的种植历史悠久，地域广阔，在全世界范围均常见。小麦是我国第二大粮食作物，在国 民经济中占有重要地位。但在小麦生产过程中病虫草害的危害很大，常造成严重的经济损失。 麦田草害的普遍发生，也是世界性的问题。据统计，由于杂草危害，小麦一般减产1 0 - - d 5 ，重 者达2 0 以上卜j 。因此麦田除草倍受重视，除草面积逐年扩大。磺酰脲类除草剂从2 0 世纪8 0 年代开始在小麦田使用，由于小麦栽培技术和机械化程度不断提高，而且小麦对磺酰脲类除草剂 具有高度耐药性，任何生育期均可应用，该类除草削在麦田使用上的推广也在不断扩大，现已成 为麦田主要除草剂品种。目前，国内麦田应用的主要有甲磺隆、绿磺隆、苯磺隆、噻磺隆、酰嘧 磺隆、醚苯磺隆( t d a s u l f u r o n ) 等卜”1 ，还有近期开发的磺胺磺隆、以及拜耳公司开发的新型麦田 超高效除草剂3 甲基二磺隆油悬浮剂( 世玛) ( m e s o s u l f u r o n ) 等。 用于禾谷类作物( 小麦田等) 如大家熟悉的绿磺隆、甲磺隆、苯磺隆、噻吩磺隆( t h i f e n s u l f u r o n ) 、 醚苯磺隆外，还有酰嘧磺隆( a m i d o s u l f u r o n ) 主要用于防除阔叶杂草，对猪殃殃等有特效，使用 剂量为2 0 , - 6 0 9 ( a i ) h m 2 。氟啶嘧磺隆( f l u p y r s u l f u r o n m e t h y l s o d i u m ) 主要用于防除禾本科杂革 和大多数的阔叶杂草，对看麦娘等有特效，使用剂量为l o g ( a i ) h m 2 。磺酰磺隆( s u l f o s u l f u m n ) 对众所周知的难除杂草雀麦有很好的效果，使用剂量1 0 3 5 9 伍i ) h m 。碘甲磺隆钠盐 ( i o d o s u l f u r o n m e t h y ls o d i u m ) 主要用于防除阔叶杂草如猪殃殃和母菊等及部分禾本科杂草如风 草、野燕麦、早熟禾等，使用剂量为l o g 伍i ) h m 2 。氟酮磺隆( f l u e a r b a z o n e - s o d i u m ) 主要用于防 除禾本科杂革和一些重要的阔叶杂草，对抗性杂草如野燕麦和狗尾草等有很好的防效，使用剂量 为3 0 9 ( a i ) h m 2 。丙氧磺隆( p r o c a r b a z o n e ) 主要用丁苗后防除禾本科杂草如看麦娘、雀麦等及某 些重要的阔叶杂草，使用剂量为3 0 7 0 9 a i ) ，h m 2 。环丙嘧磺隆( c y c l o s u l f a m u r o n ) 用于一年生和 多年生阔叶杂草和莎草科杂草，水田除草效果优于吡嘧磺隆和苄嘧磺隆，使用剂量为2 5 - 5 0 9 ( a i 帅m 2 。氯毗嘧磺隆( h a l o s u l f u r o n m e t h y l ) 主要用于防除阔叶杂草和莎草科杂草如苘麻、仓耳、 曼佗罗、豚草、反枝苋、野西瓜苗、蓼、马齿苋、龙葵、决明、牵牛、香附子等，苗前及苗后均 可施用，一般用于水稻和玉米田除草，亦可用丁麦田除草。 磺酰脲类除草剂在不同地区，不同土壤及不同环境条件i - - ，其残留期差异很大，同一作物不 同品种对其活性反应不同8 “。不同的小麦品种对此类药荆的敏感性差异较大，在同样的剂量下， 有的小麦品种出现药害，而有的品种则表现安全。前人的研究结果表明，磺酰脲类除草剂的种类 不同，在土壤中的持效期以及对当茬小麦及后茬作物的安全性不同“j 。若使用不当，则会造成严 重的药害，导致小麦减产甚至绝收。另一方面，由于一些磺酰脲类除草剂品种残效期长，容易对 后茬敏感作物造成不同程度的药害，或者是对间作的敏感作物造成严重药害p 】。我国北方大多是 玉米和小麦等作物轮作，残留的磺酰脲类除草剂往往给下茬作物造成不同程度的药害，而且由于 连年使用已使一些杂草对其敏感性下降，此外还屡屡发生漂移性药害1 8 。”。绿磺隆是磺酰脲类除 草剂中残效期较长的一个，施用量的9 6 在用药后6 0 天内降解，其余的可在土壤中残留一年以 上并会使后茬的敏感作物受害，囡而小麦和玉米轮作地经常出现后茬或间作的敏感作物的药害 2 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 问题”“。另外，这些磺酰脲除草剂主要对双子叶杂草效果好由于多年使用己引起麦田杂草群落 发生了变化，单子叶杂草数量上升。山东莱阳和龙口等地雀麦大量发生，己成为当地恶性杂草， 严重影响小麦产量“l ；浙江部分地区麦田日本看麦娘也有逐年加重危害的趋势；青海省的旱雀 麦、早熟禾、黑麦草等也逐渐演替成为麦田优势杂草种群l l 。j 。因此，如何防除禾本科杂草是当 前麦田化学除草成功与否的关键。 3 甲基二磺隆油悬浮剂( 世玛) 是安万特公司( 现为b a y e r 公司) 于2 0 0 2 年推出的新型苗 后麦田磺酰脲除草剂( 有效成分为甲基二磺隆) 主要用于小麦、黑麦中防除单子叶和部分双子 叶杂草，特别是雀麦、黑麦草、早熟禾、野燕麦、离子草等，是目前防治小麦田单子叶杂草的最 好药剂( 药效好于骠马) 1 1 6 1o 江苏、内蒙、青海等地初步田间试验表明，不同小麦品种对世玛选 择性差异较大l l “。 1 1 3 针对磺酰脲类除草剂的安全剂使用概况 ( 1 )除草剂安全剂简介 除草剂安全剂( s a f e n e r ) ，又称为解毒剂( a n t i d o t e ) 或保护剂( p r o t e c t a n t ) ，是指用来保护作 物免受除草剂的伤害从而增加作物的安全性和改进杂草防除效果，具有独特性能韵化学物质。 作为安全剂的基本概念要求：廉价、低毒、无长期残留、对环境安全：对作物的保护效果好，能 适用于多种作物与除草剂；使用方法简单，用量低等。从6 0 年代起人们开始研究除草剂的安全 剂，随着第一个除草剂安全剂萘二甲酸酐( n a ) 的开发及商品化，人们在此领域己做了许 多工作，目前国际上已商品化的品种有近2 0 种，实验性化合物也有近百种“。对于许多类除 草荆如芳氧基苯氧基丙酸酯、磺酰脲、咪唑啉酮、环己二酮以及异恶唑二酮除草剂安全剂现在都 有许多报道 2 4 - 2 5 1 。而且，现己开发出适用于玉米、水稻、高粱、小麦、大豆、棉花等农作物的几 十个品种。我国在8 0 年代末才关注这一课题，无论是应用还是研究工作都处于起步阶段，迫切 需要研制和筛选出针对a l s 抑制剂的安全剂品种。 除草剂安全剂根据其不同的结构，可分为萘酸酐类、二氯乙酰胺类、肟醚类、杂环类、磺酰 脲( 胺) 类、植物生长调节剂类、杀菌剂类等。在众多的安全剂中，有的已经商品化，有的正在 研制或开发c a 8 , 2 0 - 2 7 1 。己经商品化的安全剂有n a 、二氯丙烯胺、解草唑、吡唑解草酯等。n a 对 多种除草剂有安全作用，1 9 7 2 年由g u l fo i l 公司商品化，它也是苯磺隆、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆 等磺酰脲类除草制的安全剂。d i c h l o r m i d ，俗称一二氯丙烯胺，是美国原s t a u f f e r 公司开发的安全 剂，用于减轻结构与其相似的各类除草剂对玉米的药害，是乙草胺、异丙甲草胺的安全剂，也是 某些磺酰脲的安全剂。f e n c h l o r a z o l e ，俗称解草唑，由h o e c h s t 公司( 现为安万特公司) 开发， 它与除草剂恶唑来草灵混配的制荆，商品名为p u m a ，是种新型高效的芽后除草剂，用于小麦、 黑麦等防除一年生禾本科杂草。吡唑解草酯( m e f e n p y r - d i e t h y l ) 是由安万特公司开发的吡唑类解 毒剂，和恶唑禾草灵一起使用可使小麦、大麦等免受伤害，也是除草剂碘甲磺隆钠盐的解毒剂， 可用于禾谷类作物如小麦、大麦、燕麦等pj 。喹啉衍生物是一类新型的安全剂，近6 年来对其研 究较多，约有2 0 篇专利文献；该类化台物可作某些嘧啶类和三嗪类除草剂的安全剂，亦可减轻 一些磺酰脲除草剂对小麦、火麦或玉米的伤害，还是麦田中环己二酮类除草剂的安全剂 8 , 2 0 + 2 4 - 2 5 。 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 ( 2 )针对a l s 抑制剂的除草剂安全剂 因为安全剂可拓宽除草剂的使用范围，在新品种开发难度增加的今天，安全剂的开发已成为 一个新的领域。针对a l s 抑制剂易造成后茬药害的问题，氰氨公司开发出安全剂l3 0 4 4 1 5 。使 用后可增强玉米对昧草烟和其它咪唑啉酮类除草剂的代谢。盖山都公司开发了呋喃解草唑 ( f u r i l a z o l e ) ，该药对减轻磺酰脲类如氯吡嘧磺隆等和咪唑啉酮类除草剂造成的玉米生长停滞特别 有效。德国巴斯福公司开发的b a s1 4 5 1 3 8 也是一种有效的安全剂，能显著增强磺酰脲类除草剂 在玉米体内的代谢口瑚l 。a d - 6 7 ( n 一二氯乙酰基一卜氧杂一4 一氮杂唑( 4 、5 ) 癸烷) 是一种新型安全 剂，由于其结构中独特的唑环显示能保护某些作物免受磺酰脲类除草剂的伤害1 2 。绿磺隆 ( c h l o r s u l f u r o n ) 是用于小麦与旺麻田的超高效除草剂，它最大缺点之一是在土壤中残留期较长， 易使后茬敏感作物( 如甜菜、玉米等) 受害，而安全剂a d - 6 7 对绿磺隆有一定的解毒作用，能在一 定程度上保护玉米免受绿磺隆的药害1 2 2 2 8 】。吡唑解草酯是1 9 9 9 年英国br i g h t o n 植保会议公布的 新的除草剂安全剂，是恶唑禾草灵用于小麦、大麦等的安全剂，也是除草剂碘甲磺隆钠盐的解毒 剂，3 甲基二磺隆油悬浮剂( 世玛) 中含有安全剂吡唑解草酯，可用于禾谷类作物如小麦、大麦、 燕麦等口1 。 1 2 磺酰脲除草剂作用机制及靶标酶研究概况 1 2 1 磺酰脲除草剂作用机制 l a r o s s a 和s c h l o s s 等口9 1 首先研究了磺酰脲类除草剂的作用机制，他们发现甲嘧磺隆可以抑制 鼠伤寒沙门氏菌( s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m ) 的生长，这一抑制作用可被含少量支链氨基酸 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的培养基完全逆转。进一步研究表明，磺酰脲除草剂抑制鼠伤寒沙门 氏菌支链氨基酸的生物合成是抑制乙酰乳酸合成酶( a l s ) 的结果。r a y p o t 将微生物的研究延伸 到植物体，发现绿磺隆对离体豌豆根尖组织和整体植株的生长抑制作用也可通过添加含有支链氨 基酸的培养基完全逆转。另外，从耐磺酰脲的烟草愈伤组织培养基中再生的一些突变烟草植株对 绿磺隆的抗性呈半显性单基因控制，高抗烟草植株含有对磺酰脲极不敏感的a l s 。c h a l e f f 等” 进一步的研究显示，磺酰脲化合物的除草活性与a l s 的抑制作用警明显的正相关关系，几种磺 酰脲除草剂的植物代谢产物均无a l s 抑制作用和除草活性，证明磺酰脲除草剂的作用靶标是植 物体内的a l s ，且再无第二个作用靶标。由于动物中缺乏支链氨基酸的合成能力，即无a l s ，所 以其专一性与之对哺乳动物的低毒相一致。 生物和遗传学的研究表明，乙酰乳酸合成酶是磺酰脲类除草剂的唯一作用靶标p ”。许多研 究认为乙酰乳酸合成酶对磺酰脲类除草剂的敏感性差异在作物和杂草之间的选择性上贡献不 大，同一作物不同品种之间对磺酰脲类除草剂敏感性差异的原因也不在a l s 靶标酶上，代谢降 解速度的差异才是两者的基础【2 ”。但抗性杂草或作物与其相应的敏感型不仅在代谢速度上存在差 别，而且这一差异也表现在a l s 酶的敏感性上，抗药生物型由于a l s 酶中氨基酸位点的突变丽 更不敏感b ”。以小麦乙酰乳酸合成酶( a l s ) 比活力为研究对象，通过在离体和活体条件f 比较 4 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 其对磺酰脲除草剂的敏感性水平，可以在一定程度上研究小麦对该类药剂的耐药性差异机制。 磺酰脲类除草剂是乙酰乳酸合成酶( a l s ) 乙酸羟酸合成酶( a h a s ) 抑制剂，即通过抑制植 物的a l s a h a s ，阻止支链氮基酸如缬氨酸、亮氨酸、异亮氢酸的生物合成，最终破坏蛋白质的 合成，干扰d n a 合成及细胞分裂与生长。催化支链氨基酸生物合成第一阶段的关键酶是乙酰乳 酸合成酶，它催化两种平行反应：2 分子丙酮酸缩合产生乙酰乳酸以及丙酮酸与a 丁酮酸缩合形 成乙酰羟基r 酸，合成过程的最终产物为缬氮酸亮氨酸和异亮氨酸。任何外源化台物对乙酰乳 酸合成酶的抑制，必将造成支链氨基酸合成停止，进而影响蛋白质合成及植物生长( 图l 1 ) 。磺 酰脲类除草剂是专一化的乙酰乳酸合成酶抑制荆，由于动物缺乏合成这些支链氨基酸( 必需氢基 酸) 的能力，动物体不存在乙酰乳酸合成酶靶标位点，所以磺酰脲类除草剂对动物表现出低毒性。 1 2 2 靶标酶的研究概况 a l s 酶不仅是磺酰腮除草剂的作用靶标，同样也是咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、嘧啶水杨 酸酯类等十多类化合物的作用靶标。由于细菌和植物有许多共同的生物化学途径，面且细菌的生 物化学和遗传途径比植物更易被阐明因而利用细菌试验可为除草剂作用机制的定位提供更为方 便的手段。从微生物到植物，前人已作了许多研究报道，在此仅介绍磺酰脲除草剂对小麦靶标酶 的研究情况。 前人研究表明【”i ，小麦不同品种对绿磺隆的敏感性有差异，n - t 。面喷施绿磺隆后，以小麦地 上部分干重计算，r o n g o t e a 品种比l a n c e r 和k o t a r e 降低更多。由于小麦叶中a l s 含量比根中高 ( 大约四倍) ，但根中蛋白质含量极低，所以，根中a l s 比活力较叶中的高。尽管如此，从叶和 根中提取的a l s 酶水平在三个品种之间无差异，即备品种间酶的含最和活性并无差异。而且小 麦同一品种不同自交系之间对绿磺隆敏感性的差异也与绿磺隆在植物中的持留、吸收和传导的差 异及a l s 的敏感性无关【”1 。所以，不同植物种类自身对磺酰脲除草剂耐药性的主要机制可能是 植物体将除草剂降解为无活性的化台物。同样某些玉米品种的不同自交系对磺酰脲除草剂敏感 性的差异是降解代谢的差异造成的，丽与a l s 敏感性差异不大p “。仅有少最研究发现a l s 酶的 差异是不同磺酰脲除草剂敏感性差异的基础。f o r l a n i 3 5 1 等发现，抗绿磺隆的玉米自交系a l s 酶 含量高，相反，耐苄嘧磺隆的水稻细胞培养基中提取的a l s 活性却很低口“。不仅如此，敏感生 物型和抗性生物型的瑞士黑麦草( l o l i u mr i g i d u mg a u d i n ) 和地肤( k o c h i as c o p a r i a 仁，s c h r a d ) 中可提取a l s 的活性也十分接近”。 小麦a l s 酶活性在发芽后的4 “天达到最大值，此时正是小麦生长需要氨基酸的时候随 后逐渐下降到晟大值的6 0 左右，且叶中a l s 酶活性较根中的高2 q 倍。a l s 酶的最适反应酸 度是p h = 7 ，0 ，在p h 7 0 的缓冲液中酶活力比在p h 6 5 和p h 7 5 时的最大酶活力高9 0 以上t 该酶 不需外加f a d 、t p p 和m g c l 2 于反应混合体系中，但内含f a d 、t p p 和m g c l 2 浓度分别为5 0 u m o i l ，1 m m 0 1 l 1 和2 0m m o l - l 1 时a l s 的酶活性提高，最多可提高t 5 2 0 。采用稀释的方 法以解除这些辅助因子的影响时a l s 酶失去活性，随后再单独添加或同时添加f a d 、m g e l 2 或 t p p 也不能恢复其活性。且a l s 酶并不表现典型的抛物线动力学特征，底物丙酮酸钠的双倒数 誓鼍 i l l w i l l 簟 广 。、 摹蠢：i 似疆坪i j , i x - - i 摹蠢厶 i i ； 雹卜1支链氰基酸生物合成途径中磺酰脲樊除草剂作用位点 f i g1 1 t h et a r g e ts i t eo f s u l f o n y l u r e ah e r b i c i d ei nt h es y n t h e s i sw a yo f b r a n c h e d c h a i n a m i “o ”i d 图是非线性的。丙酮酸钠在4m m o ll 4 时达到最大反应活性的一半。绿磺隆和甲磺隆，i m a z a q u i n ， 普杀特和i m a z a p y r 的1 5 0 值分别为0 6 ，0 3 ，2 5 ，5 和1 0 p m o l l 1a 磺酰脲和咪唑啉酮两类农药 的抑制作用在药剂去除后均可被逆转。反应产物与时闻进程曲线在除草剂的作用下并非线性，基 于磺酰脲除草剂的慢速、紧密结合假说，稳态的酶抑制剂复合物的解离常数对绿磺隆和甲磺 隆分别为0 1 7 和0 1n m o l l 一1 。 然而，从这类除革剂的指示物中纯化到的同质异构酶由于酶量低、酶极易变性的特点阻碍 了对其生物化学的研究。从露自的大麦种子中提取的a l s 已被净化到相当高的纯度，但a l s 酶 其它理化性质的研究仍然使用相对粗制的酶液“1 。不同米源的a l s 基因已被克隆，来自南芥 ( 4 m 6 j 如m 扫t h 口l i d h a ) 的a l s 已被大肠杆菌表达，但酶朱被纯化”a 6 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 前人研究表明，随着酶的不断提纯其活力逐渐降低比活力逐渐升商，回收率也逐渐下 降。磷酸盐缓冲体系及丙酮酸钠和高浓度的甘油有利于a l s 的稳定。经f m c m g e l - t s k - h w 5 5 ( f ) 色谱柱纯化的酶在含5 0 ( v ，v ) 甘油和5 0m m o l - l 。p h8 0 的磷酸盐缓冲液中于一2 0 ( 2 贮存3 周， 其酶活力损失小于2 5 ，体系内含5m m o l l 。的丙酮酸钠可进一步提高其稳定性，然而，进行动 力学研究的酶不能存储在含丙酮酸钠的介质中。在4 c 时a l s 酶与l “m o l l 。或l m m o l l 。 i m a z a q u i n 在5m m o l l “丙酮酸钠的存在下放置过夜，然后酶液经过由5m m o l l “丙酮酸钠和3 0 ( v v ) 甘油的5 0m m o l l p h 8 0 的磷酸盐缓冲液处理过的e c o n o p a c1 0 d g ( b i o - r a d ) 排除色谱 柱后，酶活力在4 0 m i n 内几乎完全恢复。但是，利用稀释来解除抑制剂的作用并不成功，在稀释 条件下酶不可逆地失去其活性”。 小麦叶中的a l s 粗提酶可被支链氨基酸生物合成途径地最终产物强烈地抑制，lm m o l l “ l 缬氨酸或l 亮氨酸可抑制a l s5 0 - - 6 0 的酶活力两者的混合物可抑制8 0 左右。但部分纯化 的a l s 酶对支链氮基酸的反馈抑制更不敏感，在反应混合体系中单独加入或同时加入l 一缬氨酸， l 亮氨酸或l 异亮氨酸到1 0m m o l l 。时最大抑制率仅为1 0 1 5 。肖底物浓度从5 0 m m o l l 1 降 到1 0m m o l 。或5m m o l l 。1 时，这种抑制作用也不增加。其对反馈抑制剂敏感性的丧失表明该酶 在分离过程中可能发生了结构修饰或改变j 。 1 3 安全剂作用机制的研究概况 安全剂是一类随除草剂应用而开发的化合物，它们能保护作物免受除草剂的伤害。因而安 全剂的开发与研究成为除草剂研究中的新领域。在化学除草应用中日益发挥重要作用。安全剂的 作用机制是降低除草剂达到和抑制它们的靶标位点的能力。通过安全剂与除草剂靶标位点或其它 除草剂活性中包含的受体蛋白之间的互相作用达到这一目的。另一方面，安全剂可以降低到达除 草剂靶标位点的除草剂活性形式的量，通过安全剂与除草剂分子真接发生化学反应，或安全剂诱 导除草剂吸收或转移的降低，或安全剂增强除草剂的代谢速率使活性下降或固化代谢物等途径达 到效果【“i 。由于对除草剂安全剂的研究时间较短，其作用机理目前尚无确切定论，人们提出许多 假说来解释安全剂的作用机理，其主要机理有结构活性理论、谷胱甘肽( g l u t a t h i o n e ) 轭含论及 c y tp 4 5 0 催化的羟基化理论。近年来发现的磺酰脲类安全剂能够保护作物免遭磺酰脲类除草剂的 伤害，也进一步证实了结构活性理论的合理性，与除草荆具有相似结构的物质有较好的安全活性， 安全剂的结构与活性密切相关口“。安全剂对磺酰腮类除草剂可能的解毒途径见图l - 2 。 1 3 1 安全剂对靶标酶a i _ s 活性的影响 一些研究者认为安全剂对磺酰脲类和咪唑琳酮类除草剂的靶标a l s 具有作用【2 5 。7 。“”。a l s 是合成支链氨基酸( 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸) 的第一阶段的关键酶。它诱导2 种平行反应， 其最终产物是该3 种氨基酸。它们反馈抑制a l s ，造成支链氨基酸合成停止，从而影响蛋白质和 植物的生长。但安全剂可提升a l s 的活性，而起到解毒作用。研究者”1 发现在活体条件下，n a 能提高水稻幼苗a l s 的活性达4 0 ，抵消了胺苯磺隆对a l s 活性的抑制，认为n a 减轻胺苯隆 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 图1 _ 2 安全剂对磺酰脲类除草剂可能的解毒途径 f i gl - 2 t h ea n t i d o t a lw a yo f s a f e n e r st os u l f o n y l u r e ah e r b i c i d e s 对水稻药害的作用机制是n a 间接激活靶标酶a l s 。r u b i n 和c a s i d a 等 4 2 4 4 1 观察到用二氯丙烯 胺处理玉米后，其根部和芽中可提取的a l s 分别增加了3 0 0 卿2 4 ，从而部分的抵消了绿磺隆 的毒性。n a 、c g a 9 2 1 9 4 和解草安都可增加玉米根中的a l s 活性，其中n a 的效果更好。然而， 也有一些与此矛盾的报道，如二氯丙烯胺处理后，玉米芽中提取的a l s 活性大大降低【4 ”。人们 在对咪唑啉酮类除草剂灭草喹的研究发现mj ，经安全剂处理的植物中a l s 活性未见增强。因此， 安全剂对除草剂靶标活性的影响可能并不完全是其最基本的作用机制。 1 3 2 安全剂对除草剂代谢的作用 ( 1 ) 除草剂的植物代谢 大多数植物以3 个阶段解毒除草剂分子h “。第一阶段，解毒以母体分子氧化反应开始。氧化 反应主要是由细胞色素p 4 5 0 单加酶催化的，它可催化除草剂的分子发生芳基或烷基的羟基化反应， 以及n 域o 原子的去烷基化反应，生成无毒代谢物。第二阶段与天然底物如葡萄糖、氨基酸 或更为常见的谷胱甘肽等结合。除草剂分子或它们在第一阶段的代谢物可与谷胱甘肽反应被谷胱 甘肽s 转移酶所催化。第三阶段的代谢物可能进一步发生结合反应生成不溶性残留物，然后被隔 绝在空泡内或结合在水质素聚合物内。在阶段l 代谢中大多数是氧化反应，如烷基氧化、脱烷基 化、羧基化、环氧化和磺化氧化反应。已知这些反应中许多是因细胞色素p t 5 0 依赖单氧酶催化而 发生的，它们是与光滑内质网有关的血红蛋白，具有结合一氧化碳的能力，在4 5 01 3 m 产生最大 吸收波。在阶段i i 内，除草剂或它们的阶段l 代谢物和内源底物如葡萄糖、氨基酸或更常见的谷 胱甘肽接合。广泛分布在植物组织内的还原型谷胱甘肽( g s h ) 由丁二它在硫的存贮和输导中的作 用，而发挥自由基清除剂的功能，可免除氧化的损害而保护细胞。因活性氧存在可诱发半胱氨酸 合成这三个肽，能使其氧化成为氧化型谷胱甘肽( g s s g ) 。谷胱甘肽- s 转移酶( e c2 5 1 1 8 ) 催 化g s h 和内源底物或生物异源物的接合反应，这些酶是细胞溶质的同质或异质二聚体，其亚单 8 位在2 3 2 9 k d a 范围内，时常面临植物生长素的调节。 ( 2 )除草剂安全剂对代谢的影响 安全剂在阶段i 的氧化代谢反应时。能够增强作物对除草剂的耐性。尤其是n a 、解草胺腈 ( c y o m e t r i n i l ) 、二氯丙烯胺和b s a1 4 5 1 3 8 能保护玉米免遭磺酰脲除草剂的药害，这些研究结果表 明安全剂具有增强氧化酶系统如细胞色素p 4 5 0 的活性功能1 4 1 】。已经证实除草剂安全剂能增强作物 对几种氯乙酰苯胺和硫代氨基甲酸酯类除草剂的耐性，这些除草剂在阶段i 进行谷胱甘肽结合反 应。安全刘对这些除草荆代谢影响的研究结果表明，二氯乙酰胺类安全剂二氯丙烯胺、解草酮和 b a s1 4 5 1 3 8 能增强异丙甲草胺和乙草胺的g s h ( 还原型谷胱甘肽) 结合反应。t a l l 4 “等人观察到 用解草唑处理的小麦和大麦苗内，芳氧基苯氧基丙酸酯类除草剂恶唑禾草灵与g s h 的结合反应 增强。安全剂诱导g s h 含量提升的报道有许多，例如二氯丙烯胺提高玉米、高梁和烟草内g s h 的量，其他发现能提升g s h 含量的安全剂有b s a1 4 5 1 3 8 、解草酮、解草安、解革啶、解草烷和 a d - 6 7 。 从已有的研究结果看，安全剂加速除草剂的代谢是安全剂对作物具有保护作用的基础。安全 剂诱导植物体内代谢酶活性提高，对除草剂的代谢解毒能力增强”“。许多研究表明安全剂可以增 强除草剂的代谢。s w e e t s e r t “1 等人最初研究发现，n a 、二氯丙烯胺和解草胺腈缩短了玉米中绿磺 隆和甲磺隆的半衰期达5 0 以上。用n a 、解草胺腈处理的小麦，磺酰脲类的代谢速率最高。 m i l h o m m e 4 3 “1 观察到n a 提高了玉米中甲磺隆的代谢速翠达1 0 倍以上。b a s1 4 5 1 3 8 对某种甜 玉米中氟嘧磺隆( p r i m i s u l f u r o n m e t h y l ) 和烟嘧磺隆( n i c o s u l f u r o n ) 的代谢均有提高。n a 种子 处理可大大地增加玉米根部和芽中灭草喹的代谢。 正常情况下，植物体内g s t 活性都不高，不能完全代谢除草剂从而有较大的选择性。安全 剂诱导g s t 活性提高，增强对除草剂的代谢是其对作物有保护作用的主要原因。安全荆提高g s t 的活性具有较高的特异性，这种特异性表现在作物除草剂安全剂三者之间具有一定的专 一性。如可用r 2 5 7 8 8 解除丙草丹对玉米的伤害；解草酮可解除甲草胺对玉米的伤害；解草胺解 除甲草胺对高粱的伤害；解草唑解除恶唑禾草灵对小麦的伤害等 4 9 - s lj 。可见植物体内g s t 异构 酶的调节和底物特异性是很复杂的。r2 5 7 8 8 只对玉米保护作用较好，对高粱、水稻、小麦、大 麦、豆类保护性差。吡唑解草酯、解草唑、解草酯主要适于小麦：解革酮、n a 、r2 5 7 8 8 、呋 喃解草唑、b a s1 4 5 1 3 8 是玉米常用解毒剂；解草啶更适于水稻等等。有些安全剂的广谱性好， 如n a 除了可减低绿磺隆对玉米的伤害还能降低绿磺隆对水稻、高粱的伤害，对甲磺隆、油磺隆、 豆磺隆都有一定的解毒作用”“。 r o b e r