（病理学与病理生理学专业论文）左旋肉碱对大鼠缺血性脑损伤的神经保护作用.pdf

目录 中文摘要 l 英文摘要 4 研究论文左旋肉碱对大鼠缺血性脑损伤的神经保护作用 前言 7 日i j 舌 。 材料与方法 8 结果 13 附图 15 附表 20 讨论 2l 结论23 参考文献 23 综述缺血性脑血管疾病的研究进展26 致谢3 4 个人简历 - 3 5 中文摘要 左旋肉碱对大鼠缺血性脑损伤的神经保护作用 摘要 目的：缺血性脑血管疾病是严重危害人类健康的常见病和多发病，已 成为国家、社会和家庭的沉重负担，对缺血性脑损伤防治的研究具有重要 的现实意义。文献报道左旋肉碱( l c ) 具有显著的神经保护作用，可用 于缺血性脑损伤和神经退行性疾病的治疗，但确切作用机制尚不清楚。本 文研究目的在于观察l c 对大鼠缺血性脑损伤的保护作用，并探讨其可能 的机制。 方法： 1 观察l c 对局灶性大鼠脑缺血的保护作用：采用改良的线栓大鼠 大脑中动脉的方法制作大鼠缺血模型，计算脑梗死体积百分比，观察l c 对此模型的脑缺血保护作用。 2 m t t 法检测l c 预作用2 4h 后对低糖低氧损伤p c i 2 细胞活力的 改变：p c i 2 细胞培养于含r p m i1 6 4 0 完全培养基的培养瓶，置于3 7 ， 5 c 0 2 ，9 5 空气饱和湿度的c 0 2 培养箱内培养。在离体培养的p c i 2 细胞用连二亚硫酸钠合并低糖培养基建立体外细胞低糖低氧损伤模型。9 6 孔板中的各组细胞每孔加入m t t ( 5m g m l ) 1 0 0 肛l ，3 7 孵育4h ，每 孔各加d m s o2 0 0 t l ，然后在酶标仪上于5 7 0n m 波长处测吸光度( o d 值) 。 3 采用s y t o x 染色观察细胞的凋亡：低糖低氧损伤的p 1 2 细胞凋 亡细胞百分比用凋亡细胞数占总细胞数比值求得。 4 用酶化学法测定l c 预作用2 4h 后低糖低氧诱导的p c i 2 细胞丙二 醛( m d a ) 的变化：观察l c 对低糖低氧损伤的p 1 2 细胞的保护作用。 5 测定l c 预作用2 4h 后低糖低氧诱导的p c i 2 细胞超氧化物歧化酶 ( s o d ) 活性的改变：研究l c 对低糖低氧损伤的p 1 2 细胞的保护作用。 结果： 1 l c 能明显降低局灶性脑缺血大鼠的脑梗死体积百分比。 脑组织切片染色结果表明，大鼠大脑中动脉缺血模型后6h ，模型组 的大鼠患侧半球大脑中动脉供血区软化、苍白。l c 组的患侧半球软化、 中文摘要 苍白区缩小。线栓法致大鼠局灶性脑缺血模型组脑组织脑梗死体积百分比 明显高于假手术组( o ) ，l c 组脑梗死体积百分比为1 6 4 7 4 - 4 1 2 ，与 模型组2 3 5 3 4 - 2 5 6 l k 较，差异有明显统计学意义( 尸 o 0 1 ，n = 6 ) ， 表明l c 能明显降低缺血大鼠的脑梗死体积百分比。 2 l c 对低糖低氧所致的p c i 2 细胞损伤具有保护作用。 与正常细胞相比，连二亚硫酸钠合并低糖培养基诱导p c i 2 细胞2 4h 后损伤组细胞活力下降。损伤细胞对m t t 的摄取能力明显降低，即在5 7 0 n m 处的光密度显著降低。经1 0 0 6 0 0 肛ml c 预作用2 4h 后细胞的活力增 加，连二亚硫酸钠造成低糖低氧损伤模型的细胞m t t 光密度值不同程度 提高。 3 l c 抑制低糖低氧所致的细胞凋亡。 s y t o x 染色结果表明模型组凋亡细胞数明显多于正常组，模型组凋 亡细胞所占正常细胞的百分率为1 9 5 0 4 - 3 3 4 ，与正常组1 2 1 4 - o 7 3 相比，具有明显统计学意义( 尸 0 0 1 ，n _ 4 ) 。2 0 0 “m ( l c 2 0 0 ) 和4 0 0p m ( l c 4 0 0 ) 的l c 预作用2 4 h 后能分别明显减少凋亡细胞百分率 至2 4 4 4 - 0 9 3 和2 3 9 4 - 1 2 7 ( p 0 0 1 ，n = 4 ) 。 4 l c 降低低糖低氧损伤p c i 2 细胞的m d a 含量。 低糖低氧损伤的p c i 2 细胞匀浆m d a 活性为1 0 44 - o 2 0n m o l m g p r o t e i n ，与对照组0 4 94 - 0 1 0n m o l m gp r o t e i n 相比明显升高( 尸 0 0 5 ， n = 6 ) 。2 0 0 肛m 的l c 可明显降低细胞匀浆中升高的m d a 含量( o 2 04 - 0 0 4 n m o l m gp r o t e i n ) ，与模型组相比具有明显统计学意义( 户 o 0 1 ，n = 6 ) 。 5 l c 增强低糖低氧损伤p c i 2 细胞的s o d 活性。 p c i 2 低糖低氧损伤细胞s o d 活性为7 1 74 - 1 1 4u m gp r o t e i n ，与对 照组1 0 1 34 - o 0 3u m gp r o t e i n 相比明显下降( p 0 0 5 ，n = 6 ) 。2 0 0 肛m 的 l c 可明显升高低糖低氧损伤p c i 2 细胞的s o d 活性( 2 0 0 04 - 2 7 8u m g p r o t e i n ) ，与模型组相比具有明显统计学意义( 尸 o 0 1 ，n = 6 ) 。表明l c 可增强低糖低氧损伤p c i 2 细胞的s o d 活性。 结论：l c 能明显减轻大鼠大脑中动脉缺血模型脑损伤，对低糖低氧 所致的p c i 2 细胞损伤也具有保护作用，其机制可能与增强s o d 活性、 降低m d a 等过氧化物水平有关。 中文摘要 由基 关键词：左旋肉碱；缺血性脑损伤：神经保护；超氧化物歧化酶；自 英文摘要 n e u r o p r o t e c t i v ee f f e c t so fl c a r n i t i n ei ni s c h e m i cb r a i ni n ju r yo f r a t s a b s t r a c t o b je c t i v e ：i s c h e m i cc e r e b r o v a s c u l a rd i s e a s ei sac o m m o na n df r e q u e n t d i s e a s et h a ts e r i o u s l yh a r mt h eh u m a nh e a l t ha n dh a sb e e nah e a v yb u r d e n b o t hf o r t h ec o u n t r ya n dt h eo w n f a m i l y t tp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei ns t u d y i n g t h ep r e v e n t i o na n dt h et r e a t m e n to ft h i sd i s e a s e p r e v i o u ss t u d i e sh a v es h o w n t h a tl c a m i t i n eh a sa no b v i o u sn e u r o p r o t e c t i v ee f f e c t sa n dc a nb eu s e di nt h e t r e a t m e n to fi s c h e m i cb r a i ni n ju r ya n dn e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e s ，b u tt h e m e c h a n i s m sa r ey e tn o tk n o w n t h em a i na i mo ft h i ss t u d yw a st oo b s e r v et h e n e u r o p r o t e c t i v ee f f e c t so fl - c a r n i t i n ei ni s c h e m i cb r a i ni n j u r ya n de x p l o r et h e p o s s i b l er e a s o n s m e t h o d s ： 1 s t u d yt h ep r o t e c t i v ee f f e c t so f l c a m i t i n eo nf o c a lc e r e b r a li s c h e m i a ： w eo b s e r v e dt h ep r o t e c t i v ee f f e c t so fl c a r n i t i n eo nf o c a lc e r e b r a li s c h e m i a ， u s i n ga ni m p r o v e dm i d d l ec e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o nm o d e la n dc a l c u l a t i n gt h e p e r c e n t a g eo f t h ei n f a r c tv o l u m ei nr a t s 2 e v a l u a t et h ec e l la c t i v i t yi nl c - p r e t r e a t e d2 4hi s c h e m i a - h y p o x i a i n j u r i e dp 12c e l l sb vm t ta s s a y ：p c12c e l l sw e r ec u l t u r e di ni 冲m i16 4 0 m e d i u ma n di n c u b a t e di nc 0 2i n c u b a t o ri n3 7 ，5 c 0 2 ，a n d9 5 s a t u r a t i o nh u m i d i t y c u l t u r e dp c12c e l l sw e r et r e a t e dw i t hl o w - o x y g e nb y n a 2 s 2 0 4a n dl o w g l u c o s et os e tu pt h ei s c h e m i a - h y p o x i ai n j u r ym o d e l e a c h h o l eo f9 6 h o l ep l a t ew a sa d d e db y5m g m lm t t10 0 肚a f t e ri n c u b a t i o na t 37 。cf o r4h ，2 0 0 肛ld m s ow a sa d d e dt oe a c hh o l ea n do p t i c a ld e n s i t y ( o d ) v a l u e sw e r em e a s u r e da t5 7 0n n lw a v e l e n g t hb ym i c r o p l a t er e a d e r 3 s y t o xs t a i n i n g ：c e l la p o p t o s i sw e r ea n a l y z e db ys y t o xs t a i n i n gi n i s c h e m i a - h y p o x i ai n j u r i e d p c12 c e l l s a p o p t o s i s c e l l p e r c e n t a g e w a s c a l c u l a t e db yt h er a t i oo ft h en u m b e ro fa p o p t o s i sc e l l sd i v i d e db yt h et o t a l e e l ln u m b e r s 4 m d ac o n t e n t ：m d ac o n t e n tw e r em e a s u r e df o l l o w i n gt h ep r o c e d u r e 4 英文摘要 o fk i tf r o mt h ef a c t o r yt os t u d yt h ep r o t e c t i v ee f f e c t so fl cp r e t r e a t e d2 4hi n i s c h e m i a h y p o x i ai n j u r ym o d e l 5 s o da c t i v i t y ：s o da c t i v i t yw e r em e a s u r e df o l l o w i n gt h ep r o c e d u r eo f k i tf r o mt h ef a c t o r yt os t u d yt h ep r o t e c t i v ee f f e c t so fl cp r e t r e a t e d2 4hi n i s c h e m i a - h y p o x i ai n j u r ym o d e l r e s u l t s ： 1 l c a r n i t i n ec a ns i g n i f i c a n t l yd e c r e a s et h ep e r c e n t a g eo ft h ei n f a r c t v o l u m eo ff o c a lb r a i ni s c h e m i ai nr a t s b r a i nt i s s u es l i c e sa n ds t a i n i n gr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei p s i l a t e r a lb r a i n a r e as o f ta n ds h o w e dp a l ec o l o r6ha f t e rt h em i d d l ec e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o n m o d e l s e t u p i nc o n s t r a c t ，l - c a r n i t i n e c o u l d s i g n i f i c a n t l yr e l i e v e t h e i m p a i r m e n tc a u s e db ym i d d l ec e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o n t h ep e r c e n t a g eo f t h e i n f a r c tv o l u m eo ft h em o d e lg r o u p ( 2 3 5 3 4 - 2 5 6 ) w a ss i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt h o s e i ns h a mo p e r a t e dg r o u p a st h ep o s i t i v e c o m p a r i s o n ， l c a m i t i n ec o u l ds i g n i f i c a n t l yd e c r e a s et h ep e r c e n t a g eo ft h ei n f a r c tv o l u m e ( 16 4 7 4 - 4 12 ) 2 l c a m i t i n eh a sp r o t e c t i v ee f f e c t so ni s c h e m i a h y p o x i ai n j u r yi np c12 c e l l s c o m p a r e dw i t ht h e c u l t u r e dp c12c e l l si nn o r m a l g r o u p ，t h e c e l l a c t i v i t i e sf o rt h o s et r e a t e dw i t h3m mn a 2 8 2 0 4i nc o m b i n a t i o nw i t hg l u c o s e d e p r i v a t i o nd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y t h eo p t i c a ld e n s i t ya t5 7 0n l t it e s t e db y c o l o r i m e t r i cm t t a s s a yd e c r e a s e di nt h el o wo x y g e n ，l o wg l u c o s ei n j u r e d p c12c e l l sa n dl - c a r n i t i n ec o u l da n t a g o n i z et h i se f f e c t sw i t h i nt h er a n g eo f 1 0 0 - 6 0 0 弘m 3 l c a m i t i n ei n h i b i t sc e l la p o p t o s i sc a u s e db yi s c h e m i a - h y p o x i ai n j u r y s y t o xs t a i n i n gr e s u l t ss h o w e dt h a tt h en e c r o s i sa n da p o p t o s i sc e l l si n m o d e lg r o u pw e r em u c hm o r et h a nt h o s ei nn o r m a lg r o u p t h ep e r c e n t a g eo f n e c r o s i sa n da p o p t o s i sc e l l sw a s19 5 0 4 - 3 3 4 ，w h i c hw a sm u c hh i g h e r t h a nt h o s ei nn o r m a lg r o u p ，1 2 1 4 - o 7 3 ( p o 0 1 ，n = 4 ) 2 0 0 肛ma n d4 0 0 弘ml c a m i t i n ec o u l dd e c r e a s et h ep e r c e n t a g et o2 4 4 4 - o 9 3 ，a n d2 3 9 4 - 1 2 7 ，r e s p e c t i v e l y ( p o 0 1 ，n = 4 ) 5 英文摘要 c e l l 4 l - c a r n i t i n er e d u c e st h em d ac o n t e n ti ni s c h e m i a h y p o x i ai n j u r i e dp12 t h em d ac o n t e n ti np c12c e l l st r e a t e db yl o wo x y g e nc o m b i n e dw i t h l o wg l u c o s ew a s1 0 44 - o 2 0n m o l m gp r o t e i n ，m u c hh i g h e rt h a nt h a t i n n o r m a lg r o u p ，o 4 94 - o 10n m o l m gp r o t e i n ( p o 0 5 ，n = 6 ) 2 0 0 肛m l c a r n i t i n ec o u l da n t a g o n i z e dm d ai n c r e a s ei n d u c e db yt h em o d e lt oo 2 04 - o 0 4n m o l m gp r o t e i n ( p o 01 ，n = 6 ) 5 l c a r n i t i n ei n c r e a s e ss o d a c t i v i t yi ni s c h e m i a - h y p o x i ai n j u r i e dp 12 c e l l t h es o d a c t i v i t yi np c 12c e l l st r e a t e db yl o wo x y g e nc o m b i n e dw i t h l o wg l u c o s ew a s7 174 - 1 14u r n gp r o t e i n ，m u c hl o w e rt h a nt h a ti nn o r m a l g r o u p ，w h i c hw a s1 0 1 34 - o 0 3u m gp r o t e i n ( p o 0 5 ，n = 6 ) 2 0 0 脚 l c a r n i t i n ec o u l di n c r e a s es o d a c t i v i t yt o2 0 0 04 - 2 7 8u m gp r o t e i n ( p o 0 1 ，n = 6 ) c o n c l u s i o n ：l c a r n i t i n ec a ni m p r o v et h ep a t h o l o g i ci n j u r yi nt h em i d d l e c e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o nm o d e la n dp r o t e c tp c12c e l l sf r o mi s c h e m i ca n d a n o x i ci n j u r y ，w h i c hi sp r o b a b l ya s s o c i a t e dw i t hl o w e r i n gt h ep r o d u c t i o no f m d aa n ds t i m u l a t i o no ft h ea c t i v i t yo fs o d k e yw o r d s ：l c a m i t i n e ；i s c h e m i cb r a i ni n j u r y ；n e u r o p r o t e c t i o n ；s o d ； r a d i c a l 6 研究论文 左旋肉碱对大鼠缺血性脑损伤的神经保护作用 - 上j 一 刖吾 缺血性脑卒中是一种常见的脑血管疾病，其发病率、致残率和病死率 高，严重威胁着人类的健康和生命安全。因此防治脑缺血药物的研究已成 为当今医学研究热点之一。缺血性脑血管病的根本机制和最终结局都是脑 组织缺血缺氧( 1 ) 。目前治疗研究包括以神经保护和改善血流( 抗血小板、 纤溶、抗凝等) 为主的特异性治疗，以及以对症支持和并发症的防治为主 非特异性治疗( 2 ) 。 神经保护剂的作用在于阻止脑缺血后迟发性神经元损伤。主要通过下 列途径发挥作用：抑制谷氨酸的神经传递( 3 ) ，作用于电压敏感性离子通 道的抗癫痫药物( 4 ) ，以及调控g a b a 能突触传递的药物( 5 ) 。近来内源性 a c h 在脑缺血中的神经保护作用日益引起关注，补充肉碱可以明显促进 脑缺血患者的恢复( 6 8 ) 。 肉碱( c a m i t i n e ) 又称肉毒碱、卡尼汀、维生素b t ，化学名为3 羟 基4 三甲基铵丁酸，是一种广泛存在于机体组织中的小分子、水溶性的 氨基酸衍生物，在体内具有重要的生理作用。肉碱有左旋和右旋两种构象， 体内具有生物活性的是左旋肉碱( l c a r n i t i n e ，l c ) ( 9 ) ，而且自然界只有 l c ，右旋肉碱完全无活性而且还可能抑制l c 的利用。由于右旋肉碱的负 效应，美国f d a 在1 9 8 3 年就禁止出售右旋肉碱和右旋、l c 混合体( 1 0 ) 。 l c 临床上主要用于心血管、泌尿、神经与男性生殖系统疾病的治疗 ( 11 1 4 ) 。l c 对新生大鼠缺氧性脑损伤有保护作用( 1 5 ) ，其能抑制缺血后 脑损伤引起的乙酰c o a 游离c o a 比例升高，同时也能抑制谷氨酸、甘氨 酸、超氧化物的增加，以及降低心磷脂( 1 6 ) 。左旋肉碱对谷氨酸及其受体 激动剂，海人酸引起的神经毒性有保护作用，但其确切机制尚不清楚。推 测这种保护作用可能与其抗氧化作用有关，因为在此神经毒性中一个共同 结果是自由基的产生( 1 7 ) 。 实验性动物脑缺血损伤模型较多，大脑中动脉为临床上缺血性脑损伤 的易患部位，故大脑中动脉阻断模型被广泛用于脑梗死的研究。其中线栓 大鼠大脑中动脉缺血模型与人脑缺血病理生理改变最为接近，故为国内外 研究论文 所广泛采用。本实验采用改良的鼠大脑中动脉缺血模型制作方法，观察了 l c 对大鼠大脑中动脉缺血模型的保护作用( 1 8 ) 。 p c i 2 来自大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系，它与神经细胞在发生学上 均来源于神经嵴，在结构、功能上与神经元有很多相似之处，与神经元比 较又相对容易培养，故普遍将p c i 2 细胞用作研究神经的细胞模型( 1 9 ) 。 研究表明，脑低糖低氧后细胞膜通透性增高，n m d a 受体门控c a 2 + 通道 开放，k + 大量外流，c a 2 + 、n a + 、c 1 。、h 2 0 进入胞内，引起急性神经元肿 胀坏死，细胞内钙超载，继而又触发一系列病理反应：如花生四稀酸代谢 瀑布，黄嘌呤氧化酶系统活化产生自由基，使膜脂质发生过氧化损伤，造 成神经元迟发性死亡。 本研究通过测定细胞匀浆中丙二醛( m a l o n d i a l d e h y d e ，m d a ) 、超氧 化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 含量，观察l c 对神经细胞的 保护作用，并探讨其抗脑缺血作用的可能机制。结果显示，低糖低氧培养 的p c i 2 细胞中膜脂质过氧化产物m d a 生成增多，细胞存活率、s o d 活 性下降，这表明在神经元低糖低氧损伤过程中，有氧自由基产生。l c 能 不同程度地减少m d a 生成，降低细胞死亡率，提高s o d 活性，减轻神 经细胞低糖低氧性损伤，表现出较强的保护作用。 1 仪器、药品和实验动物 1 1 仪器 f a 2 0 0 4 电子分析天平 s z 9 3 自动双重纯水蒸馏器 p h s 3 c 数字酸度计 微量进样器 y x j 1 型离心机 c 0 2 培养箱 s w 2 c j 2 1 f 型净化工作台 d g 3 0 2 2 a 型酶联免疫检测仪 7 2 2 型分光光度计 材料与方法 上海良平仪器仪表有限公司 上海亚荣生化仪器厂 杭州东星仪器设备厂 上海医疗仪器厂 s i g m a 公司 h e r a e u s 公司 苏州安泰空气技术有限公司 华东电子管厂 上海第三分析仪器厂 研究论文 c i 4 1 型倒置显微镜 1 2 药品 o l y m p u s 公司 连二亚硫酸钠( s o d i u mh y p o s u l f i t e ，n a 2 s 2 0 4 )天津市永大 化学试剂有限公司 左旋肉碱( l c a r n i t i n eh y d r o c h l o r i d e ，l c )s i g m a 公司 葡萄糖( g l u c o s e )天津市四通化工厂 无糖d m e m ( n e u r o n b c ) 北京钮因华信科技发展有限公司 高糖d m e m ( d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i u m ) i n v i t r o g e n 马血清( h o r s es e r u m )g i b c o 胎牛血清( f b s )杭州四季青公司 胰酶( t r y p s i n ) 1 ：2 5 0 华美公司 多聚赖氨酸( p o l y l 1 y s i n e )s i g m a 公司 3 ( 4 ，5 二 甲基噻 唑2 ) 2 ，5 二苯基 四唑溴盐 ( 3 一( 4 ，5 - d i m e - t h y l t h i a z - y1 ) 2 ，5 一d i p h e n y l t e r a z o l i u m b r o m i d e ， m t t ) 华美公司 二甲基亚砜( d m s 0 )天津市大茂化学仪器供应站 s y t o xg r e e n ( s y t o x g r e e nn u c l e i ca c i ds t a i n ) i n v i t r o g e n 氯化三苯基四氮唑( t t c )上海试剂三厂 4 ，6 二氨基2 一苯基吲哚( d a p i ) s i g m a 公司 1 3 实验动物 s p f 级s d 大鼠，雌雄兼用，体重2 5 0 3 5 0g ，由河北医科大学河北 省实验动物中心提供。许可证号：s y x k ( 冀) 2 0 0 8 0 0 2 6 。实验期间饲以 该中心提供的饲料，自由饮水。室温1 8 2 5 ，相对湿度6 2 7 2 。 2 方法 2 1 局灶性脑缺血模型的制作及脑梗死体积的计算 应用改良的线栓大鼠大脑中动脉缺血模型的制作方法制备局灶性脑 缺血模型( 18 ) 。 2 1 1 栓子制作 将尼龙线剪成长4 5c m 线段，一端加热呈圆球状( 直径o 2 8m m 左右) 制成栓子。用黑色油性记号笔在圆球头端及距离圆球头端1 8 2 0c m 处各 作一记号备用。 研究论文 2 1 2 改良的线栓大鼠大脑中动脉缺血模型制作 大鼠用1 0 水合氯醛0 4m l 1 0 0 9 体重麻醉，于颈正中偏左2m m 切 开，沿胸骨乳突肌和胸骨舌骨肌肌间隙钝性分离出左侧颈总动脉，再分离 出左侧颈外动脉。穿线后轻轻提起，分离颈内动脉和枕动脉。烧灼法离断 枕动脉，在颈外动脉下穿线2 根，线一离颈总动脉分叉处3m m 结扎不剪 断，线二不打结以供牵拉备用。动脉夹夹闭颈总动脉、颈内动脉。于2 根线之间的颈外动脉剪一切口，将栓子由此口插入，进入颈内动脉约5 m m ，轻轻提起颈总动脉上动脉夹并往鼠尾方向稍牵拉，用显微镊子轻轻 往鼠头方向拨动颈内动脉，栓子继续前行至大脑中动脉。自颈内动脉起始 部算，栓子插入深度约为1 8 2 0c m 。用线一结扎固定栓子后，松开颈总 动脉上的动脉夹。缝合肌肉和皮肤( 腹腔注射青霉素，4 万单位只，预防 术后感染) ，动物回笼饲养，保持大鼠肛温3 7 5 。 2 1 3 模型成功的标准 制模成功的标准是苏醒后动物出现明确的左侧大脑中动脉缺血的神 经功能症状：右侧肢体疼痛回缩迟钝或消失；提尾倒悬时右上肢向胸 前屈曲；行走时右侧倾倒或向右转圈；左侧出现霍纳氏( h o n e r s ) 征；霍纳氏征也可不出现，但应有右侧肢体瘫痪的体征。 2 1 4 动物分组 大鼠随机平均分为假手术组、模型组、l c 组各6 只。模型组与l c 组制作线栓大鼠大脑中动脉缺血模型，假手术组大鼠同样切开颈部皮肤， 线栓同样进入左侧颈内动脉，但不达到大脑中动脉，其余操作同模型组。 l c 组腹腔内注射给予4 l c ，按照o 5m l 1 0 0g 大鼠体重计算，余2 组 分别腹腔内注射给予同等量p b s 溶液。药物预作用2 4h ，于造模成功后6 h 断头取脑切片染色。 2 1 5 缺血脑组织脑梗死体积百分比的计算 动物迅速断头处死后取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，置于培养皿 中。生理盐水冲洗，滤纸吸干表面水分，入超低温冰箱急冻2 0m i n ，取冠 状面均匀切成2m m 的厚脑片，第l 刀在脑前极与视交叉连线中点处；第 2 刀在视交叉部位；第3 刀在漏斗柄部位；第4 刀在漏斗柄与后叶尾极之 间。迅速放入2 氯化三苯基四氮唑( 2 ，3 ，5 - t r i p h e n y l t e t r a z o l i u mc h l o r i d e ， t t c ) 溶液中，避光3 7 温孵3 0m i n ，其间每隔5m i n 翻动一次，使均匀 研究论文 接触到染色液。经染色后的正常脑组织呈玫瑰红色，而梗塞组织呈苍白色， 界限分明。温孵完毕后将脑片置于1 0 的多聚甲醛中避光固定。选择每 一切片的尾侧面用h p i a s2 1 0 0 0 高清晰度图像处理系统进行图像分析， 测量每片的梗死面积和总面积，每层梗死体积为该层梗死面积和层厚的乘 积，各层的梗死体积之和即为总的梗死体积。计算梗死体积占同侧脑组织 体积的百分比即为脑梗死体积百分比。 2 2 细胞培养 2 2 1p c i 2 细胞复苏、种植及分组 将冷冻于1 9 6 液氮中的p c i 2 细胞( 购自上海细胞所) 迅速置于3 7 温水中，使之迅速融化，并培养其于多聚赖氨酸包被过的培养瓶中，培养 基为d m e m ，含1 0 马血清，5 胎牛血清，置于5 c 0 2 、3 7 细胞培 养箱内培养。细胞复苏后第2 天，细胞换液。培养2 3 天后，用胰酶进行 消化，进行细胞传代。 将生长对数期的细胞传至多聚赖氨酸包被的9 6 孔板中，细胞种植密 度为1 o 1 0 5 ，继续用含1 0 马血清、5 胎牛血清的d m e m 培养基培养。 将细胞分为正常组、模型组、l c 组：将9 6 孔板培养基吸弃，正常组、 模型组加入正常培养基，l c 组加入含相应浓度l c 、的培养基继续培养 2 4h 。每孔均为6 个复孔。 配制l c 的储存液( o 1m ) ：微量天平称取0 1 9 7 6 6gl c ，溶于1 0m l 超纯水中，o 2 2 脚小滤器过滤。 2 2 2p c i2 细胞低糖低氧损伤模型 l c 预作用2 4h 后，将9 6 孔板内原有的培养基吸弃，正常组加入含 糖4 5m g m l 的d m e m 溶液，模型组、l c 组均加入含糖o 5m g m l 、含 连二亚硫酸钠3m m 的d m e m 溶液，l c 组加入含相应浓度l c 、且含糖 0 5m g m l 、含连二亚硫酸钠3m m 的d m e m 溶液，作用3h 。 连二亚硫酸钠的配制：称取1 7 4 1g 连二亚硫酸钠，加入至1 0m lp b s 中，得1m 的连二亚硫酸钠溶液； 低糖溶液的配制：将葡萄糖溶于无糖d m e m 中，终浓度为o 5m g m l ( 正常葡萄糖浓度为4 5m g m l ) 。 2 3m t t 法检测细胞活力 低糖低氧环境作用3h 后，正常组、模型组、l c 组每孔均加入2 0 肛l 研究论文 5 9 l 的m t t 溶液，继续置于5 c 0 2 、3 7 。c 的细胞培养箱内。4h 后，取 出9 6 孔板，将各组的培养基吸弃，每孔各加入1 5 0 肛ld m s o ，振荡混匀 1 0m i n ，酶标仪5 7 0n m 波长测定检测各孔光密度值o d 。每组实验重复 至少3 次。 配制m t t ：微量天平称取m t t 粉末5 0m g ，溶于1 0m lp b s 中，得 到5g l 的m t t 溶液，分装出2m l ，余冻存于一2 0 。c ，锡箔纸避光。 2 4s y t o x 染色 染色步骤如下： 将9 6 孔板取出培养箱，弃培养液，加入p b s 洗5m i n 弃p b s ，加入s y t o x ( 1 ：1 0 0 0 0 ) ，5 0t t l 孑l ，r t1 0m i n p b s 洗5m i n 选2 行进行核复染，加入h o e c h e s t3 7 2 0m i n p b s 洗1 2 次，5m i 次 s y t o x 的配制：将l 肛s y t o x 加入至1 0 0 肚p b s 中，再从中取 5 0 肚加入p b s 至终体积5m l ，再次稀释1 0 0 倍，得终浓度为1 ：1 0 0 0 0 。 h o e c h e s t 的配制：h o e c h e s t 储存浓度为2 0 0 肛m ，1 0 # l 管，染核时， 按1 ：5 0 0 0 稀释，将此1 0 肛加入至5 0 肛l ，稀释了5 倍，得4 0 肛m ，再将 此液按l ：1 0 0 0 稀释，如将5 0 肛l 加入至5 0m l 。 2 5m d a 及s 0 1 ) 检测 细胞经损伤处理后，去除原培养液，用p b s 洗2 遍，每孔加入0 1m p b s 0 5m m e d t a ( p h8 0 ) 1m l ，再加入5 0 肛ll t r i t o n 1 0 0 ，将2 4 孔培养板置振荡器振荡lm i n 使细胞溶解，加入1 0 0 z l2 5 h 3 p 0 4 以沉 淀蛋白，1 0 0 ，0 0 0 x g 于4 。c 离心1h ，取上清液，按试剂盒说明书测定s o d 活性和m d a 含量。蛋白质定量用b c a 法。 3 图像采集及统计学分析 倒置荧光显微镜采集图像，采用n i s e l e n m e n t sb r 2 3 软件进行细胞 计数，计数3 5 个视野。数据以均值士标准差( m e a n + s d ) 表示。对各组数 据进行正态性检验和方差分析，组间比较采用方差分析，不符合正态分布 或方差不齐者，用秩和检验。 研究论文 结果 1 l c 对局灶性脑缺血模型脑梗死体积的影响 术后约1h 大鼠苏醒，假手术组无神经功能症状。脑缺血模型组和阳 性组大鼠清醒后，提尾悬空时出现左前肢腕屈、肘屈曲、肩内旋，右侧 h o m e r s 征阳性。置于平台时，前进中出现咬尾征( 往左侧划圈) ，证明 造模成功。 脑组织切片染色结果表明，大鼠大脑中动脉缺血模型后6h ，模型组 的大鼠患侧半球大脑中动脉供血区软化、苍白。l c 组的患侧半球软化、 苍白区缩小。提示l c 能明显减轻线栓模型损伤引起的脑组织缺血( 图1 ) 。 线栓法致大鼠局灶性脑缺血模型组脑组织脑梗死体积百分比明显高于假 手术组( o ) ，l c 组脑梗死体积百分比为1 6 4 7 4 - 4 1 2 ，与模型组2 3 5 3 4 - 2 5 6 比较，差异有明显统计学意义( 尸 0 0 1 ，n = 6 ) ( 图2 ) 。表明 l c 能明显降低缺血大鼠的脑梗死体积百分比，有利于脑损伤的修复。 2 l c 对连二亚硫酸钠致p c1 2 细胞缺氧损伤的保护作用 表1 显示了不同浓度的l c 对低糖低氧损伤p c i 2 细胞后细胞活力的 影响。与正常细胞相比，连二亚硫酸钠合并低糖培养基诱导p c i 2 细胞2 4 h 后损伤组细胞活力下降。损伤细胞对m t t 的摄取能力明显降低，即在 5 7 0n m 处的光密度显著降低。经1 0 0 6 0 0 肛ml c 预作用2 4h 后细胞的活 力增加，连二亚硫酸钠造成低糖低氧损伤模型的细胞m t t 光密度值不同 程度提高。 3 l c 对s y t o x 的影响 如图3 所示，s y t o x 染色结果表明模型组凋亡细胞数明显多于正常 组，模型组凋亡细胞所占正常细胞的百分率为1 9 5 0 4 - 3 3 4 ，与正常 组1 2 1 4 - o 7 3 相比，具有明显统计学意义( p 0 0 1 ，n = 4 ) 。2 0 0 x m ( l c 2 0 0 ) 和4 0 0 肛m ( l c 4 0 0 ) 的l c 预作用2 4h 后能分别明显减少凋亡 细胞百分率至2 4 4 4 - 0 9 3 和2 3 9 4 - 1 2 7 ( p 0 0 l ，n = 4 ) 。 4 l c 对m d a 的影响 p c i 2 细胞以3m mn a 2 s 2 0 4 及低糖损伤2 4h 后，损伤细胞大量释放 m d a ，使培养细胞匀浆的m d a 活性( 1 0 44 - 0 2 0n m o l m gp r o t e i n ) ，与 对照组0 4 9 土0 1 0n m o l m gp r o t e i n 相比明显升高( 尸 0 0 5 ，n = 6 ) 。2 0 0 肛m 研究论文 的l c 可明显降低细胞匀浆中升高的m d a 含量( o 2 04 - 0 0 4n m o l m g p r o t e i n ) ，与模型组相比具有明显统计学意义( p o 0 1 ，n = 6 ) ( 图4 ) 。 5 l c 对