（生物化学与分子生物学专业论文）低温脂肪酶的筛选、纯化及特性研究.pdf

摘要 摘要 脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解 为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸，催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛 应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业，是重要的工业用酶之一。低温脂肪酶 可在低温与常温下较好地发挥活性，在环境治理、敏感化合物合成、生物医药领域 等有良好的应用前景，近年来在手性化合物的有机合成中应用日趋增多，已引起人 们的广泛关注。 作者从福州某农场取样，经三丁酸甘油酯平板分离筛选共获得8 株脂肪酶产生 菌。基于1 6 s r d n a 序列分析，运用c l u s t a l x 与m e g a 4 0 构建1 6 s 进化树，初步将 这8 株菌分为两大类：r t l 、r t 3 、r t 7 、r t l 9 、l t 4 为假单胞茵属，r t 4 、r t 6 、 r t 9 与醋酸不动杆菌属分类地位相近。 r t 7 是一株碱性脂肪酶产生菌，对其产酶培养基碳氮源成分进行优化，其产碱 性脂肪酶的能力从原来的1 4 1 u m l 提高到3 1 u m l ，获得适宜该菌产酶及纯化的培 养基配方。采用硫酸铵沉淀、d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o w 及s e p h a c r y ls 1 0 0 等层析技 术对i 玎7 脂肪酶进行了分离纯化，获得了纯化的脂肪酶( 简称p l 7 ) ，初步研究了 盈度、p h 对该酶的影响，酶的稳定性，酶的抑制剂和激活剂，酶的催化必需基团， 酶的底物特异性等理化性质，结果表明该脂肪酶表观分子量为4 4 k d ，其产生的脂肪 酶在低温及碱性条件下有较好的活性，该酶在6 0 下保温半小时仍保留有9 3 的活 陛，是一株低温碱性脂肪酶并具很强的耐高温性。 关键词：筛选，1 6 s r d n a ，假单胞菌，低温脂肪酶，耐高温，纯化，酶学特性 中文文摘 中文文摘 脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它能催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸甘 油和甘油单酯或二酯。共有6 0 多个属1 0 0 多种( 细菌有2 8 个属、放线菌4 个属、 酵母菌1 0 个属、其它真菌2 3 个属等6 5 个属) 的微生物可以产生脂肪酶。但不同微 生物来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。 低温脂肪酶在低温下有很好的催化活性，在工业和生物技术领域有巨大的应用 前景，如做为有机合成敏感化合物的催化剂，在低温环境下有效催化有机合成，在 低温环境修复也有很好的作用等。低温脂肪酶在洗涤业、食品工业、药物合成、生 物转化、分子生物学应用等领域有广泛应用前景。 作者从福建某农场取样，样品经4 c 预处理样品一周后稀释涂布于三丁酸甘油 酯平板筛选脂肪酶产生菌。经过摇瓶复筛获得8 株脂肪酶产生菌。通过分析1 6 s r d n a 序列然后构建1 6 s 进化树对菌株进行属种鉴定。结果显示r t l 、i h 3 、r t 7 、r t l 9 、 l t 4 为假单胞菌属，而r t 4 、r t 6 、r t 9 与u n c u l t u r e da c i n e t o b a c t e rs p ( a m l5 7 4 4 8 1 ) 分类地位相近，为醋酸不动杆菌属。 8 株脂肪酶都在碱性条件下有较高的酶活，r t l 、r t 3 、r t 4 、r t 7 、r t 9 、l t 4 等脂肪酶适宜温度为2 5 左右，r t 6 、r t l 9 两株脂肪酶适宜温度为3 5 。其中一 株r t - 7 为碱性脂肪酶产生菌，并对其发酵条件碳氮源成分进行了优化，该菌的发 酵液经5 0 硫铵沉淀、透析、除盐，经d e a e s e p h a r o s e 及s e p h a c r y ls 一10 0 等层析 技术方法分离获得纯化的脂肪酶( 简称p l 7 ) 。 ：s d s p a g e 电泳显示p l 7 的纯化己达到电泳纯，初步研究了温度、p h 对该酶 的影响，酶的稳定性，酶的抑制剂和激活剂，酶的催化必需基团，酶的底物特异性 等理化性质。 r t - 7 是一株产酶较高的碱性脂肪酶产生菌，通过对其培养基的优化使得产酶能 力从1 4 1 u m l 提高到3 1 u m l ，提高了约1 2 0 。优化后培养基配方：豆饼粉3 o ， 酵母膏0 2 ，硫酸镁0 0 5 ，磷酸氢二钠o 1 ，磷酸二氢钾o 1 ，三丁酸甘油酯 乳化液1 0 ，p h 自然。发酵液通过5 0 硫铵沉淀、透析、除盐、d e a e s e p h a r o s e 及s e p h a c r y ls 1 0 0 层析技术获得了纯化的脂肪酶( 简称p l 7 ) 。 s d s p a g e 电泳显示该酶表观分子量约为4 4 k d 。 v 中文摘要 酶学特性研究结果表明p l 7 的最适p h 为碱性，在p h 9 0 1 1 o 之间有很好的活 性，在p h 9 0 1 1 0 之间稳定，为碱性脂肪酶；最适温度在1 5 2 0 ，是低温脂肪酶。 该酶经6 0 3 0 m i n 处理后残余酶活高达9 3 3 3 ，9 0 处理1 0 m i n 残余酶活为 6 4 9 8 、3 0 m i n 后残余酶活仍有3 5 1 9 ，显示出极好的耐热特性。 2 5 的正己烷、乙醇、甘油对酶进行处理后，在1 5 ，p h 8 7 5 的条件下测定残 余酶活，酶活分别为对照组的2 1 7 1 、 9 3 1 5 和1 0 0 5 6 ，说明该酶对有机溶剂 有一定的耐受性。 在1 5 。c ，p h 8 7 5 的条件下，当离子浓度为1 1 0 0 m o l l 时，c a 2 + 对酶的活性明显 有促进作用，酶活力提高了11 5 7 ，m 9 2 + 对酶活则没有明显影响；当浓度为1 0 。3 ( w v 或v v ) 时，变性剂s d s 、t w e e n 8 0 与t r i t o nx 10 0 对酶均有不同程度的抑制作用。 对底物特异性的测定表明，该酶对c 【ilu ai蔷_【。-蜒鞋絮乓 吗 魄 嗝 皤 瞄 喁 魄 2 0 8 6 4 2 k蕾科薷，卅苗【椰kw甘匝“n皿* 似l 黼_ 绷罅- 嬖i 勰 帆碱册确册骗勰矾戮兹黧 h=三_i譬o三_l三ol暑誉；一# 第3 章l m 低温脂肪酶的纯化与性质分析 3 3 3 7 酶的抑制剂和激活剂研究 在酶反应体系中加入表4 - 5 所示试剂，于1 5 。c ，p h 8 7 5 条件下测定其酶活力， 以未处理的酶液为对照，结果见表4 5 。 表4 5 不同金属离子及变性剂对酶活性的影响 t a b l e4 - 5e f f e c t so fi o n sa n da c t i v ea g e n t so nl i p a s ea c t i v i t y 金属离子相对酶活力( ) i o n s 浓度( x10 3 )r e l a t i v ea c t i v i t y c o n c e n t r a t i o n 9 8 3 l l o o 5 7 8 2 8 4 3 1 3 9 6 7 0 7 7 8 3 5 o 5 注：c a 、m 9 2 + 、n a * 、a 1 3 + 、e d t a 为1 0 3 m o l l s d s 为l o - 3g l ( w v ) ， t w e e n 8 0 与t r i t o nx1 0 0 为1 0 。( v v ) 从表4 5 可知，在离子浓度为1x1 0 - 3 m o l l 时，c a 2 + 对酶的活性明显有促进作用， 酶活力提高了l1 5 。7 ，而m 9 2 + 和a 1 3 + 则起抑制作用，酶活力分别下降了1 7 和1 7 ， n 矿有一定的促进作用，但作用不明显。当浓度为1 0 刁( w v 或v v ) 时，各种变性剂 对酶均有不同程度的抑制作用。变性剂s d s 、t w e e n 8 0 与t r i t o nx 1 0 0 对酶均有不 同程度的抑制作用，酶活力分别下降了6 9 、3 3 及2 2 。 3 3 3 8d t t 与p m s f 对酶活性的影响 等量酶液加d t t 使得d t t 终浓度分别为4 m m ，6 m m ，1 0 m m ，然后置于2 0 保 温3 0 m i n ，于1 5 ，p h 8 7 5 条件下测定残余酶活。结果表明酶活力随d t t 浓度的 提高而下降，当d t t 达到1 0 m m 时，酶活损失达7 7 ，残余酶活为2 3 0 4 ，见图 4 一1 1 。因为d 1 v r 可还原二硫键，改变酶的空间构象，导致酶活大幅降低。 等量酶液加p m s f 使得p m s f 终浓度分别为2 m m ，4 m m ，6 m m ，1 0 m m ，然后置于 2 0 保温3 0 m i n ，于1 5 ，p h 8 7 5 条件下测定残余酶活。p m s f 在终浓度为2 m m 峭时旷善|一一一 福建师范大学理学硕+ 学位论文 时即使酶活力完全丧失。p m s f 是蛋白侧链s e r 残基的有效修饰剂，故表明丝氨酸 残基是酶催化功能的必需基团。 = 三 p 是 。 三 一 旦 9 一 蜒 避 莨 瑟 o2468l o d t t ( m u ) 图4 11d t t 对p s e u d o m o n a sr 7 脂肪酶的影响 f i 9 4 - 11e f f e c t so fd t to nt h ea c t i v i t yo fp s e u d o m o n a sr l 7l i p a s e 3 3 3 9 酶的底物特异性 配制含不同链长( c 4 ，c 8 ，c 1 2 ，c 1 8 ) 的甘油三酯为底物的检验板，取1 0 t l 的p l - 7 纯化后脂肪酶点板，结果见表4 7 ，显示该酶可在c = 1 2 碳长的甘油三酯检验板 上产生透明的水解圈，在三丁酸甘油酯检验板上透明圈最大，说明该酶在对c = 1 2 碳链长的甘油三酯有较好的水解能力。 表4 - 6 酶的底物特异性 t a b l e4 - 6s u b s t r a t es p e c i f i c i t yo fp s e u d o m o n a sr ，7 第3 章r t 7 低温脂肪酶的纯化与性质分析 3 4 小结 作者对r t 7 的发酵条件进行了优化，获得了适宜该菌产酶以及适宜纯化的发酵 培养基：豆饼粉3 o ，酵母膏o 2 ，硫酸镁0 0 5 ，磷酸氢二钠o 1 ，磷酸二 氢钾0 1 ，三丁酸甘油酯乳化液1 0 ，p h 自然。 通过5 0 锍铵沉淀、透析除盐，d e a e s e p h a r o s e 及s e p h a c r y ls 1 0 0 分离获得 纯化的脂肪酶( 简称p l 7 ) ，纯化倍数和得率分别为1 0 0 3 4 8 和5 6 ，纯化后p l 7 的比活达到2 8 0 1 7 5 u m g 。s d s p a g e 电泳结果显示，分子量约为4 4 k d 。 初步研究了该酶的温度、p h 对该酶的影响，酶的稳定性，酶的抑制剂和激活 剂，酶的催化必需基团，酶的底物特异性等酶学特性。 p l 7 的最适p h 和温度分别为9 o 和2 0 。c ，是低温碱性脂肪酶，有较宽的p h 适应范围，耐碱性良好。这一酶学特性表明在洗涤剂和纺织工业及食品工业和医药 工业有较好的应用前景。该酶非常耐热，在6 0 3 0 m i n 处理后残余酶活高达9 3 3 3 ， 9 0 处理3 0 m i n 残余酶活仍有3 5 1 9 。但该酶在4 0 下不稳定，4 0 3 0 m i n 处理 后残余酶活仅为2 8 2 3 。 2 5 的正己烷、乙醇、甘油对酶进行处理后，在1 5 ，p h 8 7 5 的条件下测定残 余酶活，酶活分别为对照组的2 1 7 1 、9 3 1 5 和1 0 0 5 6 ，说明该酶对有机溶剂 有一定的耐受性。 当离子浓度为1 1 0 。3 m o v l 时，c a 2 + 对酶的活性明显有促进作用，酶活力提高了 l1 5 7 ，m 9 2 + 对酶活则没有明显影响，而砧3 + 则起抑制作用，酶活力分别下降了1 7 ， n a + 有一定的促进作用，但作用不明显。当浓度为1 0 刁( w v 或v v ) 时，变性剂s d s 、 t w e e n s 0 与t r i t o nx 1 0 0 对酶均有不同程度的抑制作用，酶活力分别下降了6 9 、 3 3 及2 2 。该酶是一种c a 2 + 离子依赖型酶，c a 2 + 对酶活性有明显的促进作用。 对底物特异性的测定表明，该酶对c = 1 2 链长的甘油三酯有较好的水解能力。 p m s f 是蛋白侧链s e r 残基的有效修饰剂，当其浓度达到2 m m 时，酶活完全丧 失，表明丝氨酸残基是酶催化功能的必需基团。d t t 对酶活性的影响表现为酶活力 随d t t 浓度的提高而下降，当d t t 达到1 0 m m 时，酶活损失达7 7 ，残余酶活为 2 3 0 4 。因为d t t 可还原二硫键，改变酶的空间构象，导致酶活大幅降低。 第4 章小结与结论 4 1 结论 第4 章小结与结论 1 、微生物脂肪酶作为生物催化剂，具有高度的底物选择性、区域选择性、对映体 选择性，可催化手性化合物合成、生物柴油合成、转酯反应等，产生高品质物质的 同时也对环境友好。高选择性和高稳定性的脂肪酶发现仍是当前的重要方向，而自 然界潜在的未发掘的微生物资源为新型脂肪酶的获得提供了广阔的酶源。 作者采用三丁酸甘油酯分离平板和摇瓶发酵，经初筛和复筛得到8 株脂肪酶产 生菌，对这8 株菌所产的脂肪酶的作用温度、p h 、热稳定性分别进行测定。结果表 明：8 株脂肪酶都在碱性条件下有较高的酶活；r t l 、r t 3 、r t 4 、r t 7 、r t 9 、l t 4 等脂肪酶适宜温度为2 5 左右，r t 6 、r t l 9 两株脂肪酶适宜温度为3 5 ；对酶热 稳定性的研究显示，酶对6 0 8 0 c 均有不同程度的耐受性( 见图2 1 ) ，但r t 6 、r t 7 、 r t 9 、l t 4 脂肪酶均在4 0 0 处理半小时后酶活损失较大，这种现象简称“4 0 敏感”。 2 、1 6 sr r n a 普遍存在于原核生物中，在1 6 sr r n a 分子中，既含有高度保守的 序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各 类生物亲缘关系的研究。其次，1 6 sr r n a 的相对分子量大小适中，约1 5 4 0 个核 苷酸，便于序列分析。因此，它是测量进化和亲缘关系的良好工具。 基于1 6 s 序列分析对这8 株脂肪酶产生菌进行分类。结果显示r t l 、r t 3 、r t 7 、 r t l 9 、l t 4 为假单胞菌属，其中l t 4 和r t 7 与荧光假单胞菌( p f l u o r e s c e n s ) 分类 相近，命名为p f l u o r e s c e n sl t 4 与p f l u o r e s c e n sr t 7 ；r t l 9 与p r h o d e s i a e 分类相 近，命名为p r h o d e s i a er t l 9 ；r t l 与r t 3 相似度达到1 0 0 ，可能为同种，暂命名 为p s e u d o m o n a sr t1 与p s e u d o m o n a sr t