（基础兽医学专业论文）鸡il2cdna及其去信号肽cdna的原核和酵母表达研究.pdf

甘肃农业大学硕士论文摘要 摘要 白细胞介素2 ( i n t e r l e u k i n 2 ，i l 2 ) 主要是由t 细胞和n k 细胞等产生一种的糖蛋白， 在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥着重要的作用。鸡 i l 2 ( c h i l 2 ) m r n a 全长7 4 7 b p ，阅读框e d n a4 2 9 b p ，编码1 4 2 个氨基酸残基，n 端含 有2 2 个氨基酸残基的信号肽序列。本文为探讨c h l l 2 全基因和去除信号肽的基因序列 在原核和真核表达系统中的表达行为，分别构建含有信号肽序列和不含信号肽序列的原 核和酵母表达载体，并在大肠杆菌和酵母中进行表达，以期为i l 2 基因在不同表达系统 中的高效表达和表达调控的研究奠定基础。 根据g e n b a n k 中发表的c h i l 2 基因e d n a 序列设计三条引物，利用r t - p c r 技术 从经诱导的卢氏鸡胚脾淋巴细胞中扩增出4 2 9 b p 的c h i l 2 基因全长编码区e d n a 和 3 6 3 b p 的成熟的c h l l 2 的c d n a ，分别将两段e d n a 克隆到原核表达载体p e t 2 8 a ( + ) 和 酵母表达载体p p i c z a a 中，获得原核重组质粒p e t 2 8 a - i l 2 、p e t 2 8 a s i l 2 和酵母重 组质粒p p i c z a a i l - 2 、p p i c z a a a s i l - 2 。s d s p a g e 和w e s t e r nb l o t t i n g 分析鉴定表达 产物，r n as t r u c t u r e 软件分析m r n a 5 端的二级结构。 p e t 2 8 a i l 2 、p e t 2 8 a - a s i l 2 转化的b l 2 1 ( d e 3 ) 菌在i p t g 浓度为1 0 m m o l l 、诱 导4 h 表达水平最高，表达出的2 2 k d 和1 8 k d 蛋白经w e s t e r nb l o t t i n g 鉴定为鸡i l 一2 和 s i l 2 。在相同条件下，i l 2 的表达水平明显低于s i l 2 ，经r n as t r u c t u r e 软件分析 发现，在i l 2m r n a 的5 端形成了比较复杂的二级结构，“茎环”比为1 0 3 4 ，而s i l 2 m r n a 的5 端的“茎环”比仅为0 5 7 1 。推测可能是由于i l 2m r n a 5 端复杂的二级结构 阻碍了m r n a 与核糖体3 0 s 亚基的结合，从而影响了翻译的起始效率的缘故。 p p i c z a a i l 2 和p p i c z a a a s i l 2 转化的巴斯德毕赤酵母x 3 3 在3 0 、甲醇浓度 为1 、诱导7 2 h 和9 6 h 表达明显，表达出2 8 k d 和2 4 k d 的融合蛋白经w e s t e r - b l o t t i n g 鉴定为鸡i l 2 和s i l 2 。在相同条件下，i l 2 的表达水平略低于s t l 2 ，经r n a s t r u c t u r e 软件分析发现，前者的m r n a 也形成了比较复杂的二级结构，“茎环”比为1 ， 而后者的m r n a 的“茎环”比为0 4 7 0 6 。推测m r n a 复杂的二级结构也可能是影响酵母 表达水平的原因之一。 关键词：鸡；白细胞介素一2 ：原核表达；酵母表达：信号肽；m r n a 二级结构 甘肃农业大学硕士论文s u m m a r y s u m m a r v v i n t e r l e u k i n - 2 ( i l - 2 ) i sag l u c o p r o t e i nm a d eb ytl y m p h o c y t ec e l la n dn kc e l l ，w h i c h 埘t h i m p o r t a n tf u n c t i o n si nt h em a t u r a t i o n ，a c t i v a t i o n ，p r o l i f e r a t i o na n di m m u n er e g u l a t i o no ft h e i m m u n ec e l l s t h ec l l i l - 2m r n as e q u e n c ew i t h7 4 7 b po fl e n g t h ，4 2 9 b po fr e a d i n gf r a m eo f e d n a ，14 3o fa m i n oa c i dr e s i d u e sa n d2 2o fa m i n oa c i d r e s i d u e sa tn s i g n a lp e p t i d es e q u e n c e n ep r o k a r y o t i ca n dp p a s t o r i se x p r e s s i o nv e c t o rw e r e c o n s t r u c t e da n de x p r e s s e di ne c o l i a n dp p a s t o r i si no r d e rt or e s e a r c ht h ee x p r e s s i o no ft h ew h o l eg e n ea n dt h eg e n ew i t h o u t s i g n a lp e p t i d eo ft h ec h i c k e ni n t e r l e u k i n 一2 ( c h l l - 2 ) i ne u k a r y o t i ca n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n s y s t e m t h r e ep r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ec h i l - 2g e n es e q u e n c e si nt h eg e n b a n k a n dt h ew h o l e 4 2 9 b pg e n ea n d3 6 3 p bg e n ew i t h o u ts i g n a ls e q u e n c eo fc h l l 2w e r ea m p l i f i e d f r o mt h ei n d u c e ds p l e e nl y m p hc e l l so fl u s h ic h i c k e ne m b r y ob yu s i n gr t - p c r , w h i c hw e r e c l o n e di n t ot h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp e t 2 8 aa n dp p a s t o r i se x p r e s sv e c t o rp p i c z a a r e s p e c t i v e l yt oc o n s t r u c tt h ep r o k a r y o nr e c o m b i n a t ep l a s m i dp e t 2 8 a - i l - 2 ，p e t 2 8 a - as i l 一2 a n d p p a s t o r i s r e c o m b i n a t e p l a s m i dp p i c z a a - i l 2 ，p p i c z a a - s i l - 2 a n a l y s eb y s d s p a g ea n dw e s t e r nb l o t t i n g s e c o n d a r ys t r u c t u r ew a sa n a l y z e db yr n as t r u c t u r e s o f t w a r e e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) t r a n s f o r m e d 、) l ，i t hp e t 2 8 a - i l 一2a n dp e t 2 8 a 一s i l - 2h a dt h eh i g h e s t e x p r e s s i o nl e v e lu n d e rt h ec o n d i t i o no f1 0 m m o l lo fi p t gf o r4h o u r s ，t h ep r o t e i nw i m2 2 k da n d18k dw e r ec l l i l 2a n d s i l - 2r e s p e c t i v e l y , t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fi l - 2i sl o w e r t h a na s i l 一2o b v i o u s l ya tt h es a m ec o n d i t i o n c h l l 一2f u l l - l e n g t hg e n ef o r m e dac o m p l e x s e c o n d a r ys t r u c t u r ea tt h e5 ，m i aa n dt h ep r o p o r t i o no fs t e ma n dr i n gw a s1 0 3 4 ，w h i l e0 5 71 o fp r o p o r t i o no fs t e ma n dr i n gw i t ha s i l - 25 m r n a m a y b et h ec o m p l e xa n dr e l a t i v e l y s t a b l e5 ，m i as e c o n d a r ys t r u c t u r eo fc h l l 一2o b s t r u c tt h ec o m b i n a t i o no fm r n a 晰t h3 0 s s u b u n i tr i b o s o m e ，a n dt h e ni n f l u e n c e dt h es t a r t i n gf r e q u e n c yo ft r a n s l a t i o n p p a s t o r i s x - 3 3t r a n s f o r m e dw i t h p p i c z a a i l 2a n dp p i c z a a a s i l 2h a da l l o b v i o u se x p r e s s i o nu n d e rt h ec o n d i t i o no f3 0 ca n dl o fm e t h a n o la f t e ri n d u c i n g7 2 ha n d 9 6 h t h ef u s i o n a lp r o t e i nw i t l l2 8 k da n d2 4 k dw e r ec 1 1 i l - 2a n dc h a s i l 一2 ，t h ee x p r e s s i o n l e v e lo fi l 2i sal i t t l el o w e rt h a n s i l - 2a tt h es a m ec o n d i t i o n s a n dt h ef o r m e ra l s of o r m e d ac o m p l e xa n dr e l a t i v e l ys t a b l e5 m r n as e c o n d a r ys t r u c t u r ea n a l y z e db yr n a s t r u c t u r e s o f t w a r e t h ep r o p o r t i o no fs t e ma n dr i n go fi l 25 ，m i 矾aw a s1 , b u t0 4 7 0 6o fp r o p o r t i o no f t h el a t t e r t h ec o m p l e xs e c o n d a r ys t r u c t u r em a y b eo n eo ft h er e a s o nw h i c he f f e c tt h ey e a s t e x p r e s sl e v e l k e yw o r d s ：c h i c k e n ；i n t e r l e u k i n - 2 ；p r o k a r y o ne x p r e s s ；y e a s te x p r e s s ；s i g n a lp e p t i d e ；m r n a s e c o n d a r ys t r u c t u r e 甘肃农业大学硕士论文缩写词英汉对照表 缩写词 a m p a o x b p b 细胞 c d n a c l l i l 2 c m c o n a d h a s d o c d t t e c o l i e p o i b d d v i f n n i l 2 r i p t g j a k k a n a k d a k h f l c m m a p k a m p i c i l l i n 缩写词英汉对照表 英文名称 b a s ep a i r b u r s ao r i e n t e dc e l l s c o m p l e m e n t a r yd n a c h i c k e ni n t e r l e u k i n - 2 中文名称 氨苄青霉素 醇氧化酶 d n a 碱基对数目 朝囊定位细胞 互补d 1 妊 鸡白细胞介素2 c o n d i t i o n a lm e d i u m 条件培养基 d i h y d r o x y a c e t o n es y n t h a s e 二羟丙酮合成酶 3 - a l p h a , 1 2 - a l p h a - d i h y d r o x y 5 - b e t a - c h o l a n - 2 4 脱氧胆酸钠 o i ca c is o d i u ms a l t d i t h i o t h r e i t o l e n t e r o p a t h o g e n i c e r y t h r o p o i e t i n i n f e c t i o u sb u r s a ld i s e a s e i n f e c t i o u sb u r s a ld i s e a s ev i r u s i n t e r f e m n o t i n t e r l e u k i n i n t e r l e u k i n 一2r e c e p t o r 二硫苏糖醇 大肠杆菌 红细胞生成素 传染性法氏囊病 法氏囊病病毒 干扰素 白细胞介素 白介素2 受体 i s o p r o p y l - b e t a - d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e异丙基b d 硫代半乳糖苷 l y m p h o l i n e - a c t i v a t e dk i l l e rc e l l k a n a r n y c i n k i l o m e t e rd a l t o n k i l l e rh e l p e rf a c t o r l y m p h o c y t e c o n d i t i o n e dm e d i u m m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e 5 3 淋巴因子激活的杀伤细胞 卡那霉素 千道尔顿 杀伤辅助因子 淋巴细胞条件培养基 丝裂原激活的蛋白激酶 m c a b m o n o c l o n a la n t i b o d y d m r n a n k p b l p h o p t k s d s p a g e s h s t a t t c a t c ( j f t c r 卫巳m 哐d t i l 细胞 t i r 哪 t r f t r i s t 细胞 m a r e r k ”sd i s e a s e m e s s e n g e rr n a n a t u r a lk i l l e rc e l l p e r i p h e r a lb l o o dl y m p h o c y l e s p h o s p h a t a s e p r o t e i nt y r o s i n ek i l a s e s o d i u md o d e c y ls u l f a t ep o l y a e r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s s r ch o m o l o g y s i g n a lt r a n s d u c e r sa n da c t i v a t o r so f t r a n s c r i p t i o n t r i c h l o r o a c e t i ca c i d tc e l lg r o w t hf a c t o r t - c e l lr e c e p t o r t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t u m o ri n f i l t r a t i n gl y m p h o c y t e t - c e l l t r a n s l a t i o ni n i t i a t i o nr e g i o n tc e l lm i t o g e n i cf a c t o r t - c e l lr e p l a c i n gf a c t o r h y d r o x y m e t h y l n i t r o m e t h a n e t h y m u sd e p e n d e ml y m p h o c y t ec e l l s 单克隆抗体 马立克氏病 信使r n a 自然杀伤细胞 人外周血淋巴细胞 磷酸酶 蛋白质酪氨酸激酶 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝 胶电泳 s 同源区 信号传导及转录激活因子 三氯乙酸 t 细胞生长因子 t 细胞受体 四甲基乙二胺 肿瘤浸润淋巴细胞 m r n a 翻译起始区 t 细胞促分裂因子 t 细胞替代因子 三羟甲基硝基甲烷 胸腺依赖淋巴细胞 x g a l 5 - b r o m o - 4 。c h l o r o - 3 _ i n d o l y 。p d g a l a c t o p y r a n 5 溴- 4 氯3 吲哚基p d 半乳糖 o s i d e y n b y p d y e 笛tn i t r o g e nb a s e y e a s te x t r a c tp e p t o n ed e x t r o s ea g a r 无氨基酵母氮源 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基 甘肃农业大学硕士论文 声明 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得甘肃农业 大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的通知 对本研究所作的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：壤- 智签字日期： 。g 年6 月彩日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解甘肃农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：甘 肃农业大学有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意甘肃农 业大学可以采用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分 内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 奄畸 ) 时间： d 占年多月形日 甘肃农业大学硕士论文文献综述 白细胞介素2 概况 第一篇文献综述 第一章白细胞介素2 概况 1 9 7 6 年，m o r g a n b 等首次发现在丝裂原刺激的淋巴细胞培养上清或条件培养基 ( c o n d i t i o n a lm e d i u m ，c m ) 中存在一种因子，它能够选择性地维持t 淋巴细胞在体外长 期生长，人们将该因子称为t 细胞生长因子( tc e l lg r o w t hf a c t o r ，t c g f ) 。在对免疫应答 的研究过程中，又发现了许多具有生物活性的分子，研究者各以自己测得的活性进行命 名，十几年报道了近百种因子。为了避免命名的混乱，1 9 7 9 年第二届国际淋巴因子专题 会议将免疫应答过程中白细胞间相互作用的细胞因子统一命名为白细胞介素 2 ( i n t e r l e u k i n 2 ，i l - 2 ) ，i l - 2 是t 细胞和自然杀伤性细胞( n k 细胞) 产生的糖蛋白，在机 体的免疫应答中起重要作用。i l 2 的其他名称包括t 细胞替代因子( t - c e l lr e p l a c i n g f a c t o r ，t r f ) 、t 细胞促分裂因子( tc e l lm i t o g e n i cf a c t o r ，t m f ) 、淋巴细胞条件培养基 ( l y m p h o c y t e c o n d i t i o n e dm e d i u m ，l c m ) 和杀伤辅助因子( k i l l e rh e l p e rf a c t o r ，k h f ) 等【2 1 。 随着研究的深入，人们发现除了激活的t 细胞外，其它组织也可产生i l 2 ，而且i l 2 除了作用于t 细胞外，还可作用于多种免疫效应细胞，包括b 细胞、巨噬细胞、n k 细 胞，并能诱导产生新型的杀伤细胞即淋巴因子激活的杀伤细胞。至今得到公认的白细胞 介素有2 7 种，分别命名为i l 1 i l 2 7 ，在i l 家族中的大多数成员在氨基酸序列结构、 理化特点和生物学活性等方面均不相同 3 1 。它们在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫 调节等一系列过程中均发挥重要作用，此外它们还参与机体的多种生理及病理反应。 1i l 2 的分类、结构与功能 i l 2 分为天然i l 2 和非天然i l 2 。天然i l 2 由正常产生i l 2 的细胞中获得，主要 用人外周血淋巴细胞( p e r i p h e r a lb l o o dl y m p h o c y l e s ，p b l ) 、扁桃体淋巴细胞、脾脏细胞 等制备。非天然i l 2 研究最多的是利用基因工程方法以大肠杆菌、酵母、某些哺乳动物 的细胞( 如c o s 一7 ) 表达并分离获得。凡以基因工程方法表达并制备的白细胞介素2 即称 为基因工程( 或重组) i l 2 ，它具有与天然i l 2 同样的生物活性。i l 2 分子量大小为1 5 5 1 7 2 k d ，天然的i l 2 对热比较稳定，5 6 l h 、3 7 c 1 2 h 、7 0 1 5 m i n 处理仍保留活性，4 可保存一年以上，其活性在p h 2 - - 一9 范围内保持稳定【4 】。另外i l 2 对蛋白酶敏感，对 神经氨酸酶等不敏感。关于i l 2 结构和功能的研究多采用蛋白质工程的方法，即基因定 点突变，导致蛋白质氨基酸的改变，然后研究突变蛋白质的生物功能【5 1 。另外发现i l 2 的二级结构主要由0 l 螺旋组成，在其中引入些氨基酸，会破坏0 【螺旋结构，从而影响 其生物学功能。 1 9 8 3 年t a n i g u c h 6 】首次克隆了人的i l 2e d n a ，1 9 9 0 年，g o o d m l 等1 7 1 及s c o w 等 1 8 】分别用p c r 方法克隆了绵羊i l 2c d n a ，此后猪、牛、犬等i l 2c d n a 分别克隆成功， 甘肃农业大学硕士论文文献综述白细胞介素2 概况 国内也有多种动物的i l 2e d n a 克隆成功的报道。迄今为止，至少有3 0 种哺乳动物的 i l 2 基因已经克隆成功【9 - 1 2 】。与人和哺乳动物相比，早在1 9 8 2 年s e h a u e n s t e i n 等【1 3 】首次 发现了鸡i l 一2 ，但其后的鸡i l 2 的研究十分滞后，主要是由于鸡i l 2 的中枢特异性较 强，使得在人和哺乳动物i l 2 研究中使用的许多成功技术和方法无法有效应用于鸡i l 2 的研究。最初试图利用部分纯化蛋白或哺乳动物的i l 2e d n a 序列进行杂交，克隆鸡i l 2 的e d n a 文库均未成功。直到1 9 9 7 年，s u n d i c k 1 2 】利用c o n a 刺激鸡的脾脏淋巴细胞构 建了一个e d n a 文库，用c o s 细胞进行体外表达，分析细胞培养上清对激活t 细胞的 增殖作用【1 4 1 。随后k a i s e r 等【1 5 】用r a c e 技术获得该基因全序列，使鸡i l 2 的研究真正 达到分子水平，其所克隆的鸡的i l 2m r n a 全长7 4 7b p ，结构基因长3 4 3 b p ，e d n a 阅 读框4 2 9 b p ，蛋白全长1 4 2 个氨基酸残基，在n 端含有2 2 个氨基酸残基的信号肽序列， 该序列与人和哺乳动物i l - 2 信号肽序列类似，而成熟的c h l l 2 蛋白含1 2 1 个氨基酸残 基。3 末端含有5 个a t t t a 序列，该序列可能是某些特异性内切核糖核酸酶的识别位 点，从而降低了i l 2m r n a 的稳定性。c h i l 2 成熟蛋白含有4 个半胱氨酸残基，可能 形成两个二硫键，而哺乳动物i l 2 成熟蛋白只含有3 个半胱氨酸残基，形成一个二硫键 u 6 。人i l 2 由四条螺旋结构组成，在第5 8 和1 0 5 位半胱氨酸处形成一个二硫键，该二 硫键对于维持蛋白三维结构、保持i l 2 活性具有非常重要的意义。k o l o d s i c k 等1 1 6 】还发 现c h l l 2 螺旋区a 中的1 7 位a s p 对维持i l 2 的生物学活性具有十分重要的作用，所 以正确的二硫键对于i l 2 的活性的保持是必须的【1 7 j 。 2i l 2 受体( i l 2 r ) 白细胞介素2 ( i l 2 ) 发挥其生物学作用是通过与免疫细胞表达的特异性i l 2 r 结合， 传导i l 2 信号而实现的。1 9 8 1 年，r o b b 等【8 j 发现t 细胞表面存在i l 2 受体( i l 2 r ) ，i l 2 和i l - 2 r 结合，产生一系列级联反应，通过激活j a k s t a t 、p 1 3 k 等多种途径，诱导细 胞增殖、分化、启动反凋亡机制，产生多种生物学效应。随着对i l 2 r 信号传递机制研 究的不断深入，i l 一2 r 作为一种重要的免疫信号传递分子将日益受到重视【1 9 m 】。 i l 一2 r 是由三个糖蛋白亚基组成，单个亚基不能传递i l 2 信号，只有2 或3 个亚基 组成复合体方能发挥受体功能，分别是q 、1 3 和y 三条链组成【2 2 - 2 6 】。 ( 1 ) i l 一2 r0 【链：即为抗活化t 细胞抗原( t a e ) ( p 5 5 ) ，是活化t 淋巴细胞的标志。 u e h i y a m a 首次制备了抗活化t 细胞抗原t a c 的m c a b ，与i l 2 相互竞争结合到t a c 阳 性细胞。1 9 8 4 年l e o n a r d 将t a c 分子的e d n a 克隆成功。t a e 分子为糖蛋白，由2 7 2 个 氨基酸残基组成，包括2 1 个氨基酸残基信号肽，成熟分子含2 5 1 个氨基酸，含有多个 半胱氨酸，2 个n 糖基化位点，穿膜区和胞浆区分别含1 9 和1 3 个氨基酸残基。 ( 2 ) i l - 2 rp 链：分子量7 0 k d ，故又称p 7 0 ，成熟i l 2 r1 3 链有5 2 5 个氨基酸，1 3 链含 2 6 个信号肽序列，5 个n 糖基化位点，包括胞膜外区、穿膜区和胞浆区。1 3 链的1 3 2 - 1 4 3 位与1 9 4 - - 1 9 7 位是i l - 2 结合位点。i l 2 rp 链本身无酪氨酸激酶区，但胞浆区中有 2 甘肃农业大学硕士论文文献综述白细胞介素2 概况 两个结构域：一个是靠近膜端的丝氨酸富含区；另一个是与酪氨酸激酶相联的酸性区域。 i l 2 rb 链主要分布于t 细胞、大颗粒淋巴细胞( l g l ) 、b 细胞、p r o t 细胞。 ( 3 ) i l 2 r 丫：同为跨膜蛋白，成熟的i l 2 r 丫链含3 4 7 个氨基酸，分子量6 4 k d 。胞 膜结构中的n 端位于胞外，2 5 4 个碱基构成，包括6 个n 链糖基化位点，第2 5 5 - 2 8 9 位的2 9 个氨基酸构成疏水跨膜区，胞浆区含8 6 个氨基酸，从2 8 8 一- - 3 2 1 位氨基酸序列 似乎同源于s r c 同源区2 ( s h a ) ，此区能与一些磷酸化蛋白中磷酸化酪氨酸残基相连，参 与信号的转导，跨膜区有2 9 个氨基酸，胞浆内尾肽8 6 个氨基酸，无激酶活性，但可与 细胞内非受体型蛋白t y r 激酶相互作用。p 、丫链结合是信号链必需的，但高亲和力的i l 2 r 形成必需有i l 2 rq 参与【2 。2 0 0 1 年，k o l o d s i c k t 2 8 1 通过突变分析方法首次证明鸡i l 2 蛋白的第1 7 位氨基酸为其受体p 链结合位点，1 1 9 , - - , 2 1 2 位氨基酸共同参与同其丫链的 结合有关。与其它细胞因子相似，i l 2 通过与靶细胞表面i l 2 r 结合，也能激活多种信 号转导途径。活化的t 细胞表面表达a 、p 、丫链，从而传递信号，引起细胞增殖反应。 反应后，0 【、p 链和丫链解离，细胞对i l 2p 链不再敏感，单独i l 2 rt 链不能结合i l 2 ， 但对于中亲和力i l - 2 r ( 1 3 、r 链) 、高亲和力i l 2 r ( a 、p 、丫链) 的组成、i l 2 内化以及信 号转导是必需的。i l 2 与其受体结合后激活胞质内的多种非受体型蛋白质酪氨酸激酶 ( p t k ) ，进一步启动三种主要信号传导途径：控制基因转录的j a k s t a t 途径、导致细 胞增值和基因转录的r a s m a p k 途径以及与抗凋亡的细胞骨架布局有关的p 1 3 k 途径 1 2 9 1 。 3i l 2 的纯化和突变分析 s c h n e t l z l e r l 3 0 1 等首先将外周血淋巴细胞诱生的i l 2 用4 0 , - - - 8 0 硫酸铵沉淀，碳酸 氢铵悬浮，用s e p a d e xg 1 0 0 凝胶层析，i l 2 活性峰以p b s 透析，以b l u e s e p h a r o s e 胶 层析后进行s d s p a g e 电泳，得到具有两类活性的分离物，分别为9 0 , - - 1 1 5 k d 、1 9 5 2 1 5 k d ，后者可能是前者的双聚体。f r e d e r i c k s e n t 3 1 】将由脾淋巴细胞诱生的i l 一2 超滤浓 缩，浓缩物应用阴离子交换及s l i p e r o s e 1 2 过柱等方法，结果得到两个活性峰，其一相 对分子质量1 4 k u ，其二约为2 6 , - 一3 0 k u ，后者比前者活性强，两者均具有低亲水性。m y e r s 等报道了利用5 步法纯化鸡i l 2 的结果： ( 1 ) 凝胶过滤初步浓缩c o n a 刺激的鸡脾淋巴细胞： ( 2 ) 硫酸铵沉淀； ( 3 ) 用s e p h a d e xg 1 0 0 层析； “) 反向高压液相层析； ( 5 ) p h e n l y s e p h a r o s e 层析。得到的蛋白有两个峰值【3 2 1 ，分子量分别为1 7 5 - 2 5 k d 和 3 6 0 - - - 3 9 k d 。高分子量峰解聚烷基化后再以s e p h a d e xg 1 0 0 层析，可产生相对分子质 量为1 7 5 k d 的峰，说明鸡i l 2 可以形成聚合体或与其他蛋白质聚合。 突变分析有利于进一步阐明i l 2 结构与功能的关系。k o l o d s i c k 等对c 末端9 个 甘肃农业大学硕士论文文献综述 白细胞介素2 概况 氨基酸残基进行点突变研究，发现只改变单个氨基酸残基对活性的影响不大，推测c 末 端的9 个氨基酸中没有与受体相结合的特定氨基酸。为了进一步研究此9 个氨基酸的作 用，该学者又对鸡i l 2c 末端进行了缺失突变研究，他们分别对缺失l1 3 - 1 2 1 位、11 6 - 1 2 1 位、1 1 9 1 2 1 位氨基酸残基进行活性检测，发现缺失l1 3 - 1 2 1 位氨基酸残基的i l 2 完全失去了增殖脾淋巴细胞的活性。而缺失11 6 - 1 2 1 位和11 9 - 、- 1 2 1 位氨基酸残基的 i l - 2 只有在高浓度下才对脾脏淋巴细胞具有增殖作用、缺失2 个氨基酸残基对i l 2 活 性有很大的影响，推测c 末端的3 个氨基酸残基对维持i l 2 空间结构有重要作用。 4 白细胞介素2 的生物学功能 白细胞介素主要介导白细胞间的相互作用，但也参与其他细胞之间的相互作用。它 们通过结合到细胞表面的受体来传递复杂的分子信号，从而发挥广谱的生物学活性等。 i l 2 主要是辅助性t 淋巴细胞产生的一种细胞因子，也称t 细胞生长因子，具有多种生 物活性，促进t 细胞生长。i l 2 主要以自分泌方式由t 淋巴细胞分泌，分泌的i l 2 又 作用于t 细胞自身，诱导自身增殖、分化和发挥功能。i l 2 诱导t 细胞增殖，是由组织 相容性复合物分子和抗原组成的复合物与t 细胞受体相互作用，引发t 细胞上信号传导 反应，从而表达i l 2 和其受体。 i l 2 具有种属特异性，一般呈现下行性，即较高等动物的i l 2 能作用于较低等动 物的细胞，而低等动物的i l 。2 不能诱导较高等动物细胞发生反应。在进化程度相当的动 物中也表现明显的种属特异性，哺乳动物i l 2 之间有交叉性，这与其受体结合部位氨基 酸序列的保守性有关，而且与氨基酸排列顺序和形成的空间构型也有很大的关系。如人 和猿的i l 2 ，几乎可作用于所有哺乳动物的细胞，但其它哺乳动物的i l 2 很少作用于 人。e n g l i s h 等p 4 j 证实p i l 2 对鼠、羊外周血细胞有促进增殖作用，而对人外周血细胞无 反应，白细胞介素2 基因克隆仅仅作用于有限的免疫细胞，包括t 细胞、大颗粒淋巴细 胞、单核细胞、b 细胞和少突状神经胶质细胞，促进细胞增殖和分泌细胞因子。 ( 1 ) i l 2 最重要的作用是诱导t 淋巴细胞增殖( 从g o 期进入s 期) 和分化。t 细胞受 多种刺激后能产生i l 2 ，产生的i l 2 又作用于t 细胞自身，诱导自身增殖、分化和发 挥功能，这种作用称为“自分泌作用”。i l 2 诱导t 细胞增殖的作用机理为，由组织相容 性复合物分子和抗原组成的复合物与t 细胞受体相互作用，引发t 细胞上信号转导反应， 从而表达i l 2 和其受体【3 5 1 。成熟外周血中t 细胞上i l 2 与高亲和力的受体结合后，会 导致运铁蛋白受体的表达，使t 细胞摄入离子； ( 2 ) i l - 2 能诱导n k 细胞增殖，增强n k 细胞的活性，诱导l a k 细胞和肿瘤浸润淋 巴细胞( t i l 细胞) ，并刺激它们产生细胞因子。高浓度的i l 2 在体外还能诱导n k 细胞 来源和t 细胞来源的l a k 细胞增殖并促进其活性，也可解除t i l 细胞的免疫抑制状态 并增强其免疫功能，而t i l 细胞对自身肿瘤细胞的杀伤活性比l a k 细胞更强； ( 3 ) 高剂量的i l - 2 能引起单核巨噬细胞增殖和分化，并增强单核巨噬细胞杀伤肿瘤 4 甘肃农业大学硕士论文文献综述 白细胞介素2 概况 细胞的作用； ( 4 ) i l 一2 也能刺激已活化的b 细胞增殖，活化b 细胞表达高亲和力i l 2r 。i l 2 除 了支持b 细胞生长外，还能促进免疫球蛋t 刍( i g m i g g ) 的分泌，i l 2 能增强激活的b 细 胞以及白血病细胞所产生的i l 2r 的表达，并刺激其增殖和免疫球蛋白的生成； ( 5 ) i l - 2 有抗肿瘤、抗微生物感染、引起移植排斥和自身免疫以及免疫调节作用。 i l 一2 单独使用或与单克隆抗体、l a k 细胞或t i l 等合用于临床，对肾细胞癌、转移性 黑色素瘤和淋巴瘤等有一定的治疗作用，对结肠癌也有疗效，还能提高肿瘤病人对放疗 和化疗的耐受性。 人和其它哺乳动物的i l 一2 不作用于家禽，原因是禽与哺乳动物种间隔较大。家禽细 胞因子与人和哺乳动物的同源性极低。对i l 2 的氨基酸序列分析表明这与其受体结合部 位氨基酸序列较保守有关。另外与氨基酸排列顺序和形成的空间构型也有很大关系【3 6 1 。 z e l u s 等1 37 】通过实验证明i l 2 具有沿种系谱向上有约束性向下无约束性的特点，即进化 程度高的i l 2 可以作用于进化程度高的动物。l a w s o n 等【3 8 】证明，鸡i l 2 不能诱导小鼠 c t l l 系的增殖，小鼠i l 2 也不能诱导鸡t 淋巴细胞的增殖，而且鸡i l 2 多抗也不能 抑制哺乳动物i l 2 诱导的小鼠c t l l 系的增殖，因此他们认为鸡i l 2 和哺乳动物i l 2 不存在交叉反应性。该学者分别将鸡和火鸡i l 2 克隆入p c i n e o 载体，在c o s 7 细胞进 行表达，用重组蛋白对鸡和火鸡的脾淋巴细胞和胸腺淋巴细胞进行交叉反应性实验结果 表明鸡i l 2 和火鸡i l 2 在生物学活性上具有一定的交叉反应性，但两者的受体表达水 平、受体结合位点和t 细胞受体( t c r ) 等还是存在一定的差异。s t e p a n i a k t 3 5 l 等通过抗鸡 i l 2 i g g 抗体阻断实验表明鸡i l 2 虽然不能诱导增殖反应，但能与c t l l 系受体结合， 鸡i l 2 和哺乳动物i l 2 同源性较低而二级结构却极相似可能是导致这一结果的根本原 因。 5 白介素2 基因克隆与表达 i l 2 是一种微量强效的淋巴因子，并且在丝裂原诱导的上清中包含多种i l 2 以外 的因子，因此用常规生化手段提取的i l 2 无论从纯度及数量方面均不能满足基础理论研 究及临床应用的需要。2 0 世纪7 0 年代后期涌现的基因工程技术给i l 2 研究和应用带来 了新的希望和突破。1 9 8 3 年t a n g u e h i l l s 等首先成功克隆了人i l 2e d n a ，将该e d n a 于c o s 7 细胞中表达，而确证其可编码具有生物活性的人i l 2 ，该e d n a 编码区为 4 5 9 b p ，编码1 5 2 个氨基酸，成熟的人i l 2 由1 3 3 个氨基酸组成，分子质量为1 5 4 2 k u ， 与纯化的i l 2 分子质量相符。1 9 8 5 年，y o k o t o 等1 3 9 】通过另一种技术路线成功克隆鼠i l 一2 的e d n a ，筛出3 个具有l l - 2 活性的e d n a 克隆。成熟i l 2 含有1 4 9 个氨基酸，分子 质量1 6 0 k u ，与人i l - 2 有6 2 同源性。小鼠i l 2e d n a 克隆成功，为使用哺乳动物细 胞表达系统克隆细胞因子基因开辟了条成功之路。1 9 8 6 年，c e t r e t l i 等1 4 0 用第三种策 略成功克隆了牛i l 一2e d n a ，牛i l 2e d n a 编码1 5 5 个氨基酸，其成熟i l 2 含有1 3 5 甘肃农业大学硕士论文文献综述白细胞介素2 概况 个氨基酸，分子质量为1 5 4 5 2 k u 与人和鼠的i l 2 各有6 5 及5 0 的同源性。 s u n d i c k 等【1 2 j 把完整的鸡i l 2 基因克隆入p c d n a i 中，首次在c o s 7 细胞中表达了 鸡i l 2 基因，该蛋白具有鸡t 淋巴细胞增殖活性。c h o i 等【3 3 】把含信号序列长4 3 0 个核 苷酸的鸡i l 2 基因克隆入p u c l 8 载体和真核表达载体p c d n a 3 ，分别在大肠杆菌和 c h o k 1 细胞中进行表达，得到的两种