（蔬菜学专业论文）番茄四个抗病基因的基因标记的创建与辅助选择.pdf

华大学学位论姗怖胍荆嬲 学位论文 名 如需保密，解密时间 鑫口年占只；o 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 。 研究生签名： 韵雹杉卜时间：劢问答年 月z 7 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 学位论文收录到( ( 中国学位论文全文数据库，并进行信息服务( 包括但不限于汇编、 复制、发行、信息网络传播等) ，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：砑t 矫 导师签名： 争杖雾 签名日期：加8 年f 月2 7 日 签名日期：纠吲烽月；秒日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业人学2 0 0 8 届硕l ：学位论文 目录 中文摘要i a b s i r a c i i i i 第一章文献综述1 1 1 课题的提出1 1 2 番茄主要病害1 1 2 1 番茄病毒病。l 1 2 2 番茄枯萎病2 1 2 3 番茄青枯病：。3 1 2 4 番茄叶霉病4 1 2 5 番茄根结线虫4 1 3 番茄抗病虫基因的定位与克隆5 1 3 1 质量抗病虫性状的基因定位5 1 3 1 1 番茄烟草花叶病毒病( t m 2 8 ) 5 1 3 1 2 番茄根结线虫6 1 3 1 3 番茄细菌性斑疹病6 1 3 1 4 番茄叶霉病7 1 3 1 5 番茄枯萎病7 1 3 2 数量抗病虫性状的基因定位7 1 3 2 1 番茄晚疫病7 1 3 2 2 番茄青枯病8 1 4 等位基因特异p c r ( a s p c r ) 一一种优良的s n p 分型技术1 0 1 4 1 a s p c r 的原理1 0 1 4 2 a s p c r 技术的改良1 l 1 4 2 1 错配碱基的引入1 l 1 4 2 2 巢式p c r 1 1 1 4 2 3 四引物a r m s p c r l2 1 4 2 3e n a a 引物等位特异扩增1 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 5 分子选择技术的研究进展12 1 5 1 质量抗病虫性状的分子选择1 3 1 5 2 数量抗病虫性状的分子选择1 4 第二章抗病基因的基因标记的创建与鉴定1 5 2 1 材料与方法。1 5 2 1 1 植物材料与接种病原1 5 2 1 2 基因序列收集与分析1 5 2 1 3 引物设计思路1 5 2 1 3 1t m 2 8 引物1 6 2 1 3 2 1 - 2 引物1 6 2 1 3 3c f - 9 引物一16 2 1 3 4m i j 引物。1 6 2 1 4 等位基因特异p c r 1 6 2 1 5 抗病基因标记的验证1 7 2 1 5 1t m v 接种鉴定1 7 2 1 5 2 枯萎病抗性材料p c r 鉴定1 7 2 1 5 3 南方根结线虫接种鉴定1 7 2 1 5 4 叶霉菌生理小种鉴别1 8 2 2 结果与分析l9 2 2 1 抗病基因的序列分析1 9 2 2 2 等位基因特异p c r 标记的创建2 1 2 2 3t m 2 8 基因特异引物的p c r 扩增与t m v 接种鉴定2 l 2 2 4i 2 基因特异引物p c r 扩增结果2 3 2 2 5m i 1 基因特异p c r 与南方根结线虫接种结果一2 3 2 2 6 叶霉病抗病基因特异引物的扩增结果2 5 2 3 讨论。2 6 2 3 1 抗病基因序列的分析与引物设计2 6 2 3 2 抗病性鉴定方法与效果2 7 2 3 3 抗病基因标记的创建2 7 2 3 4p c r 扩增问题2 8 华中农业人学2 0 0 8 届硕l ：学位论文 第三章番茄多种病害抗性基因标记辅助田间育种2 9 3 1 前言2 9 3 2 材料与方法。3 0 3 2 1 番茄材料与聚合杂交方式3 0 3 2 2 基因组d n a 的提取3 0 3 2 3 引物的合成及其序列3 0 3 2 4p c r 扩增与产物的检测3 0 3 2 5 田间经济性状调查。3 l 3 2 6 抗病接种鉴定。3 1 3 3 结果与分析3 1 3 3 1 基因标记辅助选择的方法3 l 3 3 2 番茄抗烟草花叶病毒的p c r 分析3 1 3 3 3 番茄抗枯萎病的p c r 分析3 2 3 3 4 番茄抗根结线虫的p c r 分析一3 4 3 3 5 基因标记辅助选择三抗病基因株系3 5 3 3 6 田间番茄的经济性状调查3 5 3 3 7 分子标记辅助选择聚合四抗病基因株系3 9 3 4 讨论3 9 3 4 1 田间性状调查与标记辅助选择相结合3 9 3 4 2 本研究选育的多抗性番茄材料的应用前景3 9 3 4 3 基因标记辅助选择的优点4 0 3 4 4 基因标记应用于蔬菜遗传育种研究中存在的问题和难点4 0 3 4 5 基因标记在植物遗传育种中的应用前景4 l 参考文献4 2 附录5 0 附录一：植物d n a 的小量法提取程序5 0 附录二：硕士在读期间已接受会议论文摘要5 0 致谢51 华中农业人学2 0 0 8 屈硕l j 学位论文 中文摘要 番茄是世界广泛种植的蔬菜作物之一，其独特的风味、丰富的营养、鲜艳的色 彩和特殊的医用价值吸引着越来越多的消费者，培育优良的抗病品种是防治各种番 茄病害最为有效的方法。本研究的目的：利用生物信息学手段，找到抗病基因与其 等位基因的核苷酸差异位点，通过设计等位基因特异引物，开发出抗病基因的标记 用于基因标记辅助选择。为番茄抗病品种的选育提供新的材料，加快番茄抗病品种 选育的进程。本研究获得的主要结果如下： 1 从g e n b a n k 中获得抗病基因砌一2 a 、c f - 9 ，1 - 2 、m i j 以及等位基因的序列信息， 通过生物信息学软件分析，找到番茄抗病基因m 2 口，c f - 9 、i - 2 上s n p s 共2 4 个；分析了m i l 基因等位序列与附近r g a 的g d n a 序列，找到了它们在第一 个内含子结构的核苷酸差异。 2 分别根据抗病基因t m 2 a 、c f - 9 、i - 2 的s n p s 位点设计基因特异引物3 对，引物 3 端与模板互补或错配，并人为的在3 端的第二或第三位引入错配碱基。m i j 基因特异引物是根据第一个内含子两侧翼的序列进行设计，扩增抗病基因与等 位序列的第一个内含子区域。 3 采用摩擦接种法和灌根法对抗病材料和敏感材料进行t m v 和南方根接线虫接 种鉴定，同时分别以t m 2 a 和m i j 特异引物对这些材料进行p c r 扩增。实验结 果证明，t m v 与南方根接线虫接种结果与p c r 扩增结果完全吻合。 4 以c f - 9 特异引物对国际通用的叶霉病生理小种鉴别寄主进行p c r 检测，检测结 果显示仅o n t 7 7 1 9 ( c f - 9 1 c f - 9 ) 能扩增出条带。以厶2 特异引物对抗枯萎病品系 l a 3 8 4 7 ( n c h s 1 ) 、l a 4 0 2 6 ( f l o r i d a 7 4 8 1 ) 和敏感品系a 5 3 作p c r 检测，试 验结果表明，l a 3 8 4 7 、l a 4 0 2 6 均能扩增出6 0 0 b p 大小的带，而a 5 3 扩增出大 小为7 2 0 b p 左右的条带。这说明2 a 、c f - 9 ，1 - 2 、m i j 特异引物均能用于田间 基因标记辅助选择。 5 本研究以国外多抗f l 品种为材料，连续多代自交，在f 3 、1 = 4 苗期采用基因标记 ( t m 2 日，i - 2 、m i j ) 辅助选择，并结合田间经济性状调查，选择经济性状较好、 含三抗性基因的单株。共得到三抗性品系3 份，三抗性材料8 7 株，得到经济性 状优良的自交系8 份。 6 对获得的三抗性品系，进行四种抗性基因杂交聚合。以三抗的自交系为母本， 含有c f 抗性基因的佳粉1 8 号和硬粉8 号为父本，杂交，对其f 1 代的2 2 个单 株进行分子标记检测，表明有9 株聚合了四种抗性基因，可作为将来选育多抗 性番茄的优质抗源。 华中农业人学2 0 0 8 届硕1 ：学位论文 关键词：番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mm i l l ) ；基因标记；抗病基因；基因聚合； 标记辅助选择；t m 2 口；c f - 9 ；厶2 ；m i j ；s n p a b s t r a c t lo m a t ol sg r o w na r o u n da l lt h ew o r l da sak e y v e g e t a b l ea n da t t r a c t sag r o w i n g n u m b e ro fc o n s u m e r sw i t hu n i q u ef l a v o r s ，h i g hn u t r i t i v e v a l u e s ，b r i g h tc o l o r sa n ds p e c i a l m e d l c a jv a j u e s b r e e d i n gv a r i e t i e sf o rd i s e a s er e s i s t a n ti s t h em o s te f f 如t i v em e t h o dt 0 c o n t r o lv a j l o u st o m a t od i s e a s e s t h ep u r p o s eo f t h i ss t u d y ：f i n d i n gn u c l e o t i d ed j f f e r e n c e s l na l l e l eb e t w e e nr e s i s t a n c eg e n e sa n ds e n s i t i v eg e n e s b ym e a n so fb i o i n f o m a t i c st o o l s d e v e j o p i n gr e s l s t a n t eg e n em a r k e r sf o rm a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o nm r o u g hm ed e s i g no f a l l e l es p e c i f i cp r i m e r i tp r o v i d e st h en e w m a t e r i a lf o rb r e e d i n gn e wv 撕e t i e so fm a t e a l s a n ds p e e du pt h eb r e e d i n go fd i s e a s e r e s i s t a n tt o m a t op r o c e s s t h e m a j nr e s u l t sa r ea s f o l l o w s ： 1 f h es e q u e n c em f o r m a t i o no fr e s i s t a n c eg e n et m 2 ，c f - 9 ，1 - 2 ，m i a n dt h e i r a l l e l e w e r eo b a j n e df 而mg e n b a n k 2 4s n p so f d i s e a s e r e s i s t a n tt o m a t og e n et m 2 a c f - 9 , j ，2 ，w e 陀f o u n dt h r o u g hb i o i n f o r m a t i c ss o f t w a r ea n a l y s i s t h en u c l e o t i d ed i 慨n c e o fi n t r o n1o fm i - jw a sf o u n db yt h e a n a l y s i so ft h eg e n es e q u e n c ea n dt h er g a v i c i n i t yg d n as e q u e n c e s 2 a c c o r d i n gt ot h es n p ss i t eo fr e s i s t a n c eg e n e t m 2 口，c f - 9 ，1 - 2 ，m r e ep a i r so f s p e c l n cp n m e r sw e r ed e s i g n e d ，r e s p e c t i v e t oi m p r o v et h es p e c i f i c i t yo ft r a d i t i o n a j a j l e l e p e c i f i cp c ra m p l i f i c a t i o n ，a na r t i f i c i a lb a s ep a i rm i s m a t c hw 嬲i n n d u c e d w i t h i n3 e n do fa l l e l e s p e c i f i cp r i m e r s p e c i f i cp r i m e r so fm i 一1w e r e d e s i g n e d a c c o r d i n gt ot h ef l a n k i n gs e q u e n c eo fi n t r o n1 ，t oa m p l i f yt h er e g i o no fi n t r o n l0 f d i s e a s e r e s i s t a n tg e n ea n dt h ea l l e l e j f r i c t l o nv a c c i n a t i o nm e t h o dw a su s e dt od e t e c tt h er e s i s t a n tm a t e r i a l s 锄d s e n s i t i v e m a t e r i a l so ft m va n ds o a p i n gr o o tm e t h o dw a sa p p l i e dt o i d e n t i f yt h er e s i s t a n c ef o r m e l o i d o g y n ei n c o g n i t a s i m u l t a n e o u s l y ，t h es p e c i f i cp r i m e r so ft m 2 口a n dm i 1w e r e a m p l i f i e qf o rt h eg d n ao ft o m a t op l a n t s t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt m va n d m e i o l d o g y n ei n c o g n i mv a c c i n a t i o nc o n n e c t e dw i t ht h er e s u l t so fp c r 锄p l i f i c a t i o n f u l l yc o n s i s t e n t l y 4 r l a e s p e c i f i cp r i m e r so fc f 9w e r e a p p l i e d t o d e t e c td i f f e r e n t i a lh o s t s0 f c j a d o s p o r i u m f u l v u m ，w h i c hw a su s e da l l o v e rt h e w o r l d ，a n do n l vo n t 7 719 ( c f - 9 c f - 9 ) h a dam o n o m o r p h i cb a n d t h es p e c i f i cp r i m e r so fi 2 w e r eu s e d f o rp c r t e s t l n gt oi d e n t i f yt h er e s i s t a n c eo fw i l td i s e a s e r e s i s t a n ts t r a i n sl a 3 8 4 7 ( n c h s 1 ) l a 4 0 2 6 ( f l o r i d a 7 4 81 ) a n d s e n s i t i v es t r a i n sa 5 3 t h er e s u i t ss h o w e d t h a t6 0 0b p i i i 华中农业大学2 0 0 8 届硕上学位论文 b a n d sw e r ea m p l i f i e di nl a 3 8 4 7 ，l a 4 0 2 6a n das i z eo fa b o u t7 2 0b pb a n d sw e r e a m p l i f i e di na 5 3 t h i ss h o w st h a ts p e c i f i cp r i m e r so ft m - 2 a , c f - 9 , 1 - 2 m i j c a nb e u s e di ng e n em a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o n i nt h i s s t u d ym a n yr e s i s t a n tm a t e r i a l sw e r ei n t r o d u c e da n dm a i n t a i n e db yf u l l s e l f - m a t i n g g e n em a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o nw a sc o n d u c t e df o rf 3o rf 4s e e d l i n g u s i n gg e n e t i cm a r k e r s ( t m 一2 b i - 2 。m i - l 、) c o m b i n e dw i t ht h es u r v e y so fe c o n o m i c f i e l dt r a i t s t h et o m a t op l a n t s ，w h i c hh a db e t t e re c o n o m i cc h a r a c t e r sa n dt h r e e r e s i s t a n c eg e n e s ，w e r es e l e c t e d i nt h i sr e s e a r c h ，at o t a lo f8 7t h r e er e s i s t a n tp l a n t s a n de i g h ti n b r e dw h i c hh a d g o o de c o n o m i ct r a i t sw e r er e c e i v e d t h ep l a n t sw h i c hc a l t yt h r e eg e n e sw e r ec r o s s e dw i t hj i a f e n g18a n dy i n g f e n n o 8t or e a l i z ef o u rr e s i s t a n tg e n ep y r a m i d s t h ep c rt e s tw e r ep r o c e e d e df o r2 2 h y b r i dp l a n t sa n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tn i n et o m a t op l a n t so ft h ef o u rr e s i s t e n tg e n e c a nb eu s e da sf u t u r eb r e e d i n go fh i g hq u a l i t ym u l t i r e s i s t a n tt o m a t or e s o u r c e s k e y w o r d s ：t o m a t o ( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mm i l l ) ；g e n em a r k e r ；d i s e a s e r e s i s t a n t g e n e ； g e n e p y r a m i d ； m a r k e r -a s s i s t e ds e l e c t i o n( m a s ) ： t m 2 a ；c f - 9 ；l - 2 ；m i - 1 ；s n p i v 5 6 华中农业人学2 0 0 8 届硕l ：学位论文 b c b s a c a p s c d s c f - 9 c m d n a e b e s t i n d e l i s s r g a s m a s m i 1 q t l r a p d r f l p r g a s c a r s n p s s r b a c k c r o s s b u l k e ds e g r e g a n ta n a l y s i s c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i cs e q u e n c e c o d i n gs e q u e n c e c l a d o s p o r i u mf u l v u mr e s i s t a n c eg e n e c e n t i m o r g a n s d e o x y r i b on u c l e i ca c i d e t h i d i u mb r o m i d e e x p r e s s e ds e q u e n c et a g s m a l l i n s e r t i o n d e l e t i o np o l y m o r p h i s m i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t s g e n ea s s i s t e ds e l c t i o n m a r k e ra s s i s t e ds e l c t i o n m e i o i d o g y n er e s i s t a n c eg e n e q u a n t i t a t i v et r a i tl o c i r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ic d n a r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m r e s i s t a n c eg e n ea n a l o g s s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s i m p l es e q u e n c er e p e a t s 回交 分离群体分析方法 切割的扩增产物多态性序列 编码序列 番茄叶霉病抗性基因 厘摩 脱氧核苷酸 溴化乙锭 表达序列标签 小的插入缺失多态性 中间微卫星简单重复序列 基因标记辅助选择 分子标记辅助选择 根结线虫抗性基因 质量性状位点 随机扩增多态性d n a 限制性酶切长度多态性 抗病基因类似物 特征序列扩增多态性 单核苷酸多态性 简单重复序列 v 华中农业人学2 0 0 8 届硕l ：学位论文 1 1 课题的提出 第一章文献综述 番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m m i u ) 是世界上重要的蔬菜作物之一，其适应 范围广，分布于世界各地，被列为全世界产量最高的3 0 种农作物之一。番茄的产 量高，营养丰富，富含维生素类和糖类， 们喜爱。在番茄生产中，由于病虫危害， 既可生食又可作加工之用，因而深受人 经常造成大面积减产。目前在番茄生产 上经常发生的病害己达4 0 多种，因此如何提高番茄产量、改进品质、提高抗病性 己成为番茄育种的重要课题。 选育抗病品种是防治番茄病害最有效的办法，然而依靠常规的方法培育抗病 品种的困难很大。如人工接种鉴定，由于人为的鉴定标准有差异，在一定程度上 造成鉴定结果的不准确，同时在病原菌接种过程中要耗费大量的人力物力，延长 了育种年限，并且在选育过程中病菌的生理小种是不断分化的，经过较长时间培 育的抗病品种很可能在推广不久已被病原菌所克服。所以要求育种工作者必须缩 短育种周期，加快抗病新品种的选育。分子标记辅助选择体系的建立正是解决这 一问题的有效途径之一，它可以在苗期进行大量的鉴定，无需进行病原菌的接种， 加快了育种工作的进程。 本试验利用基因标记技术进行抗病基因的筛选工作，以抗病基因等位序列间 的差异( s n p s 、i n d e l s ) 设计引物，特异扩增抗病基因的某一片段，利用抗病基 因的片段作为标记，这样做的好处是：l 、改变了传统抗病育种方法中，受病原 菌保存与接种困难的限制。2 、目前鉴定的番茄抗病基因的分子标记多为连锁标 记，但是这些标记与抗病基因存在交换值，在检测过程中易出现假阳性，并且有 的标记需进行酶切检测，成本较高，难以在育种过程中加以实际利用。因此该方 法在很大程度上加速了育种的工作进程，降低的工作量和费用。 1 2 番茄主要病害 番茄作为一种蔬菜作物，在世界范围内都有广泛种植。但是由于连年重茬种 植，病害严重，而且病害种类多达4 0 多种。严重影响菜农的经济效益和蔬菜的品 质。 1 2 1 番茄病毒病 随着番茄在我国各地栽培的普及和扩大，病毒病的危害也日益严重，造成春 华中农业人学2 0 0 8 届硕一l 学位论文 番茄常年减产3 0 以上。有关番茄病毒病的毒源种类国外报道了近3 0 种( 杨悦俭， 1 9 9 2 ) ，番茄病毒病主要症状表现为不同程度矮化，新叶皱缩、叶片小、畸形、 上部叶片线形成蕨叶形，中下部叶片黄绿色向上卷起。减少座果数，果实发育慢。 着色不匀，也有新茎叶果实产生坏死斑，严重时产生紊斑。冯兰香等( 1 9 8 7 ) 在 我国番茄主生产区采集病毒病症状或类似病毒病症状的番茄样本，经研究鉴定发 现我国番茄病毒病的主要毒源有烟草花叶病毒( t m v ) 、黄瓜花叶病毒( c m v ) 、 马铃薯x 病毒( p v x ) 和马铃薯y 病毒( p v y ) ，分别占样本的6 3 2 、2 1 4 、 4 8 和3 1 ；研究还发现，越往南c m v 越严重，越往北t m v 越严重。赵有为认 为我国常见的浸染番茄的病毒有7 种，包括马铃薯卷叶病毒( p l r v ) 、番茄束顶 病毒( t b t v ) 和番茄卷顶病毒( t c t v ) 等。由此可见，我国至少存在1 0 余种 浸染番茄的病毒，其中t m v 和c m v 都是为害我国番茄的最主要的病毒。m c r i t c h i e 等( 1 9 6 3 ) 首次利用抗性番茄栽培品种将番茄上t m v 划分成i 、i i 、i i i 、和 v 共五个株系；冯兰香等( 1 9 8 7 ) 将我过番茄的t m v j 0 分为4 个株系，即o 、l 、 2 、和1 2 株系，分别占分离物的8 l 、1 3 6 、3 6 和1 8 。小种0 分布最广泛， 这一点与英国、美国、日本等国的情况一致。烟草花叶病毒的寄主范围非常广泛。 因此其毒源植物也是很普遍的，例如烟草、辣椒等茄科植物和各种十字花科植物。 病毒可在一些多年生野生寄主和某些栽培作物体内越冬，土壤中的病残体也是病 害的初侵染源，业已证实，番茄种子也能携带烟草花叶病毒。烟草花叶病毒传染 性很强，很容易通过接触传染，主要通过分苗、定植、绑蔓、整枝、打顶、2 ， 4 一d 沾花等各项农事操作传播病毒。 上海市农业科学院丁辛顺等( 1 9 8 6 ) 根据1 9 8 1 1 9 8 3 年获得的五个c m v 代表 分离物的寄主范围、交互保护测定以及电子显微镜和血清测定结果发现上海郊区 浸染番茄作物的c m v 主要有三个类型：( 1 ) c m v 番茄轻花叶株系( c m v t m ) ， 这株系虽对番茄致病性较弱，但能系统侵染蚕豆；( 2 ) c m v 黄花叶株系 ( c m v t y ) ，对番茄致病性强，其症状与c m v y 株系有较多相似之处； ( 3 ) c m v 重花叶株系( c m v t s ) ，对番茄致病性最强，且在田间所占比例最高。因 此对病毒学家和育种家来说，应着重加强对c m v 重花叶株系的研究。 1 2 2 番茄枯萎病 自上世纪5 0 年代发现枯萎病以来，现枯萎病已遍及世界各地，并成为番茄生 产上的重要病害。番茄枯萎病是由镰孢属的番茄萎蔫病菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m f s p 1 y c o p e r s i c i ) 引起的一种维管束疾病，主要侵染植株导管组织，通过阻塞木质 部物质和水分运输引起植株萎蔫( 王全华，1 9 9 6 ) 。目前番茄枯萎病的生理小种 已发现3 个：生理小种1 、2 、3 。生理小种l 和2 广泛分布于美国大部分地区，以色 列、日本、加拿大、澳大利亚等地也有报道。另外日本的s a t o 和y a r a m o t o ( 1 9 7 4 ) ， 2 华中农业人学2 0 0 8 届硕l ：学位论文 美国的j a r v i s ( 1 9 7 8 ) ，澳大利亚的g r a t t i d g e ( 1 9 8 2 ) 相继又发现了一种新的生 理小种，它能使抗生理小种1 3 i ：1 2 的番茄品种感病，被认为是生理小种3 。我国对 番茄枯萎病菌生理小种的研究起步较晚。陈卫东( 1 9 8 2 ) 首次研究了北京、湖北 等地区的番茄枯萎病，鉴定结果认为这些地区的病菌为生理小种l 。刘晖、郑是 琳等( 1 9 9 1 ) 将来自山东省8 个地市及四川省重庆分离和采集到的病菌分离物进 行鉴定，结果这些地区的病菌也为生理小种1 。西安市蔬菜研究所( 郑贵彬，2 0 0 0 ) 对西安地区的枯萎病株鉴定，结果与陈卫东、刘晖相同。由于他们都采用的是国 际上目前较为流行的小种鉴定方法一近等位基因系品种i n p r s v e d p e a r s o n ( i p ) 和 p e a r s o n v f 1 1 ( v f 1 1 ) 鉴定小种法，因此可初步认为我国番茄枯萎病菌以生理 小种l 为主。当然这只是部分地区的鉴定结果，并不是我国的普遍情况，应该广 泛收集病株。特别是没有研究过的地区。 1 2 3 番茄青枯病 番茄青枯病又称细菌性枯萎病( b a c t e r i a lw i l t ) 是由青枯雷尔氏菌 ( r a l s t o n i a s o la n a c e a r u m ) 引起的一种毁灭性土传病害。在世界范围内，青枯病 菌可侵染4 0 多科2 0 0 多种植物( 申爱荣，2 0 0 6 ) ，其寄主范围之广仅次于农杆菌 ( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) 。青枯菌引起的青枯病是番茄、马铃薯、花生、烟 草、辣椒、茄子、生姜、香蕉等许多重要农作物的生产限制因素，世界各地均有 分布。多数农作物一旦受青枯菌侵染就表现枯萎症状，即基本失去产量或经济价 值，造成很大经济损失。而且青枯病作为土传病害，至今仍无有效的防治方法， 所以它越来越成为世界关注的难题。 青枯雷尔氏菌又可分为许多个复杂的菌系目前已形成两个国际公认的亚分 类系统。一是根据寄主范围将其划分为4 个生理小种( r a c e ) 。r a c e l 危害多数茄 科植物，包括番茄、马铃薯、茄子、烟草等，也危害其它科植物；r a c e 2 f l 皂侵染 香蕉、海里康和大蕉；r a c e 3 主要危害马铃薯，也可弱侵染烟草和番茄；r a c e 4 侵染姜以及弱侵染马铃薯等其他植物( 何礼远，1 9 9 5 ；卢同1 9 9 8 ) 。另有人将从 我国南方桑树上分离到的菌株列为r a c e 5 ( 王金生，2 0 0 0 ) ，我国番茄青枯菌主 要为r a c e l 。二是根据不同菌株对3 种双糖( 乳糖、麦芽糖、纤维二糖) 和三种酸 ( 甘露酸、山梨酸、甜酸) 等6 种碳水化合物的利用情况，将青枯菌划分为5 个生 化变种( b i o v a r ) ( h e ，1 9 8 3 ) 。番茄青枯茵属b i o v a r 3 和b i o v a r 4 。生理小种与 生化变种之间无绝对关系，但r a c e 3 只含b i o v a r 2 ( 徐世典，1 9 9 1 ) 。我国番茄青枯 病生化型以i i i 为主，其次为，极少数为2 ，生理小种大多数属生理小种l ，少数 为生理小种3 ( 康耀卫1 9 9 5 ，徐世典1 9 9 1 ) 。 3 华中农业人学2 0 0 8 届硕十学位论文 1 2 4 番茄叶霉病 番茄叶霉病( c l a d o s p o r i u mf u l v u m ) 是一种世界性的病害，每年都有大规模 的发生。特别是海拔低，湿度大的环境条件下( 如荷兰) ，番茄叶霉病更是猖獗。 在我国，随着塑料大棚番茄的大量种植，叶霉病的发生一年比一年严重，已经成 为保护地番茄生产的主要病害之一。虽然番茄叶霉病不是毁灭性的病害，但严重 发生时能使番茄减产1 5 以上，并使产品的商品性降低。在蔬菜病害中，番茄叶 霉病是生理小种分化最多的病害。抗病品种只要在生产中应用，很快就会被新的 生理小种攻克，而成为感病品种。据加拿大、荷兰等国家的研究结果表明，此病 对c f l c f 5 五个抗病基因己经分化出1 3 个生理小种( 李树德，1 9 9 5 ) 。其中有些 小种的致病力可以使含有2 4 个抗性基因的品种感病。到目前为止，北京地区己 经发现了叶霉病的8 个生理小种，它们是：小种1 2 ，2 1 2 - 3 ，2 3 ，1 2 4 ，2 4 ，2 3 4 和1 2 3 4 ，其中以小种1 2 和1 2 3 4 为主。东北地区以小种1 3 为主，另外还有0 2 3 和1 2 3 d 、种。( 李树德，1 9 9 5 ) 1 2 5 番茄根结线虫 根结线虫( m e l o i d o g y n es p p ) 是一种世界性的病害，对根结线虫的最早研究 开始于1 8 5 5 年，b e r k e l e y 首次发现了根结现象。c o m u 在1 8 7 9 年给根结线虫命名， 并把它定为一个种。c h r i s t i e 和a l i b n 发现了根结线虫存在不同的小种，在此基础 上c h i t w o o d ( 1 9 4 9 ) 将根结线虫归类于根结线虫属，并且对其中的几个小种进行 了描述，这在根结线虫的研究历史上是一个重要的贡献。在全世界范围内，根结 线虫可使农作物年平均减产2 4 5 ，使番茄减产2 0 6 。在所有由根结线虫引起 的农作物损失中，9 0 以上是由南方根结线虫、花生根结线虫，爪哇根结线虫、 北方根结线虫引起的。到目前为止，根结线虫有7 0 个种( 胡先奇，1 9 9 7 ) ，而且 不同的种或小种对同一种植物( 或品种) 的致病力也不相同。近年来由于抗病品 种的使用和基因对基因的作用，根结线虫不断分化出致病力更强的生理小种。根 结线虫的分布相当广泛，在南纬3 5 0 和北纬3 5 0 之间，主要分布的是南方根结线虫、 爪哇根结线虫和花生根结线虫，并且越靠近赤道分布越普遍，北纬3 5 。以北地区 主要是北方根结线虫。根结线虫于1 9 3 2 年首次在我国南方的番茄上发现，随后在 云南、福建、江西、广西、山东、上海、四川、辽宁、黑龙江等地均有不同程度 的发生，( 刘存