（林木遗传育种专业论文）矮牵牛转ACA与GNA双价抗蚜虫基因的研究.pdf

摘要：矮牵牛( p e t u n f a h y b r i d a ) 花大色艳花色丰富，为长势旺盛的装饰性花卉， 能周年繁殖上市，可以广泛用于花坛布置、花槽配置、景点摆设、窗台点缀、家 庭装饰。目前，矮牵牛在国际上已成为主要的盆花和装饰植物。矮牵牛销售量大， 种植面广，有着很大的发展空间。但矮牵牛特别容易受虫害影响，其中蚜虫尤为 严重。蚜虫危害不仅大大降低了矮牵牛的观赏性与装饰性，而且还给工业化生产 带来了很大的影响，是一个急待解决的问题。 本实验采用根癌农杆菌介导途径。将尾穗苋凝集素基因( a c a ) 和雪花莲凝 集素基因( g n a ) 的质粒p c a m b i a 2 3 0 0 - a g 转化进大肠杆菌d h 5a 感受态细胞进行扩 增，继而提取质粒并转化根癌农杆菌l b a 4 4 0 4 ，通过农杆菌介导途径，用叶盘转 化法将质粒转化到矮牵牛中，并最终获得了转基因矮牵牛苗。该研究为矮牵牛抗 蚜工作和进一步向矮牵牛导入其他工程基因的研究积累了经验。 主要结果如下： 1 建立了一套完整的矮牵牛组织培养植株再生系统。 本实验借鉴了前人对矮牵牛组织培养的研究成果，采用了b a ( 苄氨基嘌呤) 和n a a ( 萘乙酸) 两种植物生长调节荆进行配比实验。通过不同激素浓度的m s 培养基对矮牵牛叶片进行培养，结果表明增殖培养基m s + 6 一b a ( 1 o m g l ) + n 从 ( 0 i m g l ) 对矮牵牛芽的增殖率最高，达到4 7 9 2 。 2 对质粒转化大肠杆菌和根癌农杆菌的条件进行了优化。 摇床的转速达到4 0 0 r p m 时，4 - 5 个小时细菌生长就会进入稳定期，然后迅 速过度到衰亡期，出现凝集、沉淀：如果摇床的转速仅为8 0 r p m ，细菌生长速度 缓慢，2 4 小时后也仅能看到微弱的混浊；摇床转速在1 8 0 r p m 时，细菌生长速度 适中，1 6 小时左右0 d 值可达到o 5 左右。在实验中我们发现大肠杆菌d h 5a 在 2 7 下振荡培养1 6 h ，o d 值才达到0 0 3 ；温度升高到3 7 ，4 h 后o d 就已达到 0 1 。综合以上原因，在培养大肠杆菌时，摇床转速以1 8 0 r p m 为宜，温度3 7 为佳，培养时间在1 6 h 左右，o d 值达到o 5 左右，转化效率最高。 对比实验表明，质粒提取质量好的，转化效率比质量差的转化效率高。将大 肠杆菌和根癌农杆放在低温的c a c l ：溶液( 4 c ) 中清洗数次是提高转化率所必 需的。液氮在根癌农杆菌转化过程中起着非常重要的作用，在没有液氮的情况下 进行转化，转化率几乎为零。 3 对根癌农杆菌转化矮牵牛的条件进行了优化。 通过对比实验，浸染7 8 m i n 为宜。另外，预培养是必需的。未进行预培养 的对照出苗率很低仅为1 1 2 ，污染较高i 进行预培养2 d 的出苗率也较低仅为 2 5 3 ；进行预培养4 d 的出苗率最高为5 9 1 ；进行预培养6 d 的出苗率也较低 仅为2 9 1 。从实验的结果来看，矮牵牛叶片在侵染前预培养4 d 最佳。共培养 天数为0 ，即侵染后直接进行筛选培养，转化率为o ；随着共培养天数的增加， 转化率也增加；在共培养天数为4 天时，转化率达到峰值，达到5 3 8 ；丽后转 化率有所下降。所以，就矮牵牛而言，共培养时间以4 d 最佳。 为了增加筛选的准确性，我们选择卡那浓度为l o o m g l 作为转基因矮牵牛的 筛选浓度。在含有5 0 0 m g lc e f + l o o m a lk a n 的选择培养基上，愈伤组织的生长 明显受到抑制，表现为愈伤组织形成延迟，大约1 5 天才见有少量愈伤形成，一 个月后才有大量愈伤组织产生；只有一部分叶片组织脱分化形成愈伤组织。未转 化组织在相同选择培养基上不能形成愈伤组织。 4 对转基因再生植株进行了卡那霉素抗性分析、p c r 、p c r - 酶切和虫试检测。 通过农杆菌介导法，获得了一些转基因矮牵牛植株。当幼苗长至3 5 片真时 时，将其转至降低琼脂含量的胚诱导培养基中，进行生根。将根系发育良好的植 株经炼苗2 周后，移栽至土中。用浓度为1 0 0 0m g l 卡那霉紊点滴于转化再生苗 生长点，其中4 2 棵导入p c & m b i a 2 3 0 0 - a g 的矮牵牛再生苗中有3 6 棵幼苗没有发 生任何变化。而对照幼苗和6 棵转基因矮牵牛新生真叶上则出现了黄色斑块。重 复2 次，观察结果一致。 挑选2 0 棵转基因植株以特异引物对g n a 基因和a c a 基因进行p c r 检测。p c r 检测结果表明p c a m b i a 2 3 0 0 - a g 转化再生矮牵牛植株全部为g n a 基因阳性。但其 中有4 株g n a 检测为阳性的植株，在检测a c a 时却表现为阴性。为了进一步验证 g n a 和a c a 基因的p c r 结果是真阳性还是假阳性，我们利用p c r - 酶切方法进行了 进一步检测。结果表明从转基因植株基因组中扩增出的g n a 基因和a c a 基因均是 真阳性。虫试结果表明p c a m b i a 2 3 0 0 一a g 的转化再生矮牵牛中不抗、中低抗以及 高抗植株所占比例分别为2 0 ，3 0 和5 0 。p c a m b i a 2 3 0 0 - a g 的转基因植株对蚜 虫具有明显的抑制作用，蚜口密度抑制率为6 3 1 5 ，表现出g n a 和a c a 对蚜虫 生长和繁殖的抑制。 关键词：矮牵牛，组织培养，农杆菌介导转化，抗性检测 u a b s t r a c t ：t h ef l o w e ro f p f t u n i ah y b r i d ai sb i ga n dc o l o r f u l ，i ti sa no r n a m e n tf l o w e r 、v i m9 0 0 dg r o w t ht r e e d ，c 锄b ep r o p a g a t e dt om a r k e ti i le a c hs e a s o n ，a n dc a nb e e x t e n s i v e l yu s e di nc o l l o c a t i o no fp a r t e r r e ，f l o w e rg r o o v e ，l a n d s c a p e ，w i n d o w s i l la n d h o u s e a tp r e s e n t ，p e t u n i ah y b r i d ah a sb e c o m et ob eo n eo ft h em o s ti m p o r t a n t b a s i n f l o w e r sa n do r n m m e e tp l a n t s i tw i l lh a v eag o o dd e v e l o p m e n ts p a c e ，b e c a u s e t h ev e e d i t i o na n dp l a n t i n ga r e ao f p e t u n i a7 砂b r i d ai sb i g b u ti n f e c t i o no fi n s e c tp e s t o np e t u n mh y b r i d ai sv e r ys e v e r e , e s p e c i a l l yb ya p h i d 1 1 1 ei n f e c t i o no f a p h i dw i l ln o t o n l yr e d u c et h eo m a m e l l ta n dd e c o r a t i o no fp e t u n 融h y b r i d a ，b u ta l s o a 丘、e c tt h e i n d u s t r i a l i z a t i o n p r o p a g a t i o n s oi ti sa i lu r g e n tp r o b l e mt os e t t l e m e d i a t i o no fa g r o b a c t e r i u mw a su s e di nt h i ss t u d y f i r s t t h ep l a n te x p r e s s i o n v e c t o rp c a m b i a 2 3 0 0 a gw i t h g e n e sa c aa n dg n aw a st r a n s f e r r e d i n t o e s e h e r i c h i ac o l fd h 5 at oa m p l i f y , t h c ad r e wo u tt h ev e c t o ra n dt r a n s f e r r e di n t ot h e a g r o b a c t e r i u ml b a 4 4 0 4b yf r e e z e - t h a wm e t h o d s e c o n d 也et w og e n e sw e r e t r a n s f e r r e di n t op e t u n i ah y b r i d ab y1 e a r - d i s em e t h o dm e d i a t e db yt h ea g r o b a c t e r i u m t r a n s g e n i cp l a n t s o fp e t u n i a 抽b r i d aw e r eo b t a i n e d t h es t u d ya c c u m u l a t e d e x p e r i e n c e sf o ra p h i d - r e s i s t a n c ew o r ka n dt r a n s f o r m a t i o no fo t h e rg e n ei n t op e t u n i a h y b r i d a t h em a i nr e s u l t sw e r es h o w e d 1 t h er e g e n e r a t i o ns y s t e r no f t i s s u ec u l t u r eo f p e t u n i ah y b r i d aw a ss e tu p o nt h eb a s eo ff o r m e rr e s e a r c h ，t h ec o m p a r i s o ne x p e r m e n t so f t w op l a n t h o r m o n e sw e r ed e s i g n e d 1 1 l er e s u l t ss h o w e dt h a tm u l t i 嘲i e a t i o nc u l t e r em e d i u mm s + 6 - b a ( 1 0 m l ) + n 从( 0 1 i n g l ) w a s t h e b e s t ，t h e m u l t i p l i c a t i o n r a t eo f b u d s w a s h i g h e s t r e a c h e d4 7 9 2 2 t h ec o n d i t i o no ft r a n s f o r m a t i o no fp l a s m i di n t oe s c h e r i c h i ac o l ia n d a g r o b a c t e r i u mw a so p t i m i z e d w h e nr o t a t es p e e do f r o c k - b e dr e a c h e d4 0 0 r p m , 4 5h o u r sl a t e r , t h eg r o w t ho f b a c i l l u sw o u l dc o m ei n t oas t a b i l i z a t i o ns t a g e , a n dr a p i d l ys t e p p e di n t oc o n t a b e s c e e c e s t a g e ，t h eb a c i l l u sw o u l dc o a g u l a t ea n dd e p o s i t ；m e ni tw a so n l y8 0 r p m ，t h eg r o w t h o f b a c i l l u sw o u l db ev e r ys l o w , 2 4h o u r si a t e r , t h et u r b i d i t yo f c u l t u r em e d i u mw a s f a i n t ；w h e ei tr e a c h e dl8 0 r p m t h eg r o w t ho f b a c i u u sw o u l db em o d e r a t e , l6h o u r s l a t e r , t h eo dv a l u eo f c u l t u r em e d i u mw o u l dr e a c h a b o u to 5 i tw a sa l s of o u n dt h a ta t 2 7 ，s u r g ec u l t u r e1 6h o u r sl a t e r ，t h eo dv a l u eo f c u l t u r em e d i u mw a sa b o u to 0 3 ；a t 3 7 s u r g e g u l t u r e 4 h o u m l a t e r , t h e o dv a l u e o f c u l t u r e m e d i u mc o u l dr e a c h o 1 i n t e g r a t e du p w a r d sr e a s o n s ，r o t a t es p e e do f r o c k - b e da t18 0 r p m ，t e m p e r a t u r ea t3 7 ， c u l t u r e d16h o u r a n do dv a l u ea ta b o u t0 5w a st h eo p t i m i z e dc o n d i t i o no fe u l t u r e d e s c h e r i c h i ac o l i ，a n di nt h i sc o n d i t i o nt h et r a n s f o t l n a t i o nr a t ew a sh i 吐e s t 1 1 kr e s u l t so fc o m p a r i s o ne x p e r m e n t ss h o w e dt h a t t h eq u a l i t yo fp l a s m i d e x t r a c t e dw a sb e r e r , t h et r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yw a sh i 醢e r ；af e wt i m e so fc l e a n o u t o f e s c h e r i c h i ac o la n da g r o b a c t e r i u mi nl o wt e m p e r a t u r ec a c i ，s o l u t i o n ( 4 ) w a s n e c e s s a r yt oi m p r o v et h et r a n s f o r r n a t i o ne m c i e e c y ；a n dt h ef l u i dn i t r o g e ni sv e r y i m p r o t a n ti nt h et r a n s f o r m a t i o np r o c e s so fa g r o b a c t e r i u m ，i ft h e r ew a sn of l u i d n i t r o g e n ，t h et r a n s f o r n l a t i o nf a t ew a sn e a r l yo 3 功ec o n d i t i o no ft r a n s f o f i l l a t i o no fp e t u n i ah y b r i d ab ya g r o b a c t e r i u mw a s o p t i m i z e d t h er e s u l t so fc o m p a r i s o ne x p e r m e n t ss h o w e dt h a t ，t h et i m eo fd i p d y ei na b o u t 7 8r a i nw a sb e s t a n dp r e - c u l t u r ei sn e c e s s a r yf o ri m p r o v e m e n to f 扛a n s f o r m a t i o n t h er a t eo f t r a n s f o r m a t i o no f n o n - p r o - c u l t u r e w a sv e r y l o w , j u s ta b o u t l 1 2 ，a n d t h e p o l l u t i o nr a t ew a sh i 醢；t h er a t eo f t r a n s f o r m a t i o no f p r e c u l t u r e2d a y sw a sj u s ta b o u t 2 5 3 ：t h er a t eo f t r a n s f o r m a t i o no f p r e - e u l t u r e4d a y sw a sh i g h e s t , r c a o h5 9 1 ；a n d t h er a t eo f t r a n s f o r m a t i o no f p r e - c u l t u r e6d a y sw a si u s ta b o u t2 9 1 。i ti n d i c a t e dt h a t p r e - c u l t u r e4d a y sw a sb e s t t h er a t eo ft r a n s f o r m a t i o no fc o - c u l t u r e0d a yw a so ： c o - c u l t u r ew a sl o n g e r , a n dt h et r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yw a sh i g h e r ；w h e ne n - c u l t u r e 4d a y s ，t h er a t eo ft r a n s f o n n a t i o nw a sh i 吐e s tr e a c h5 3 8 ；a f t e r4d a y sm er a t eo f t r a n s f o r m a t i o ns u b d u e d s ot op e t u n 妇h y b r i d a , c o c u l t u r e4d a yi sb e s t w es e l e c t e dt h ek a nc o n c e n t r a t i o na t 1 0 0 m g la ss c r e e n i n gc o n c e n t r a t i o nt o t r a n s f e r r e dp e t u n 妇 | i z y b r i d ap l a n t s 。i no r d e l - t oi m p o r v ct h ev e r a c i t yo fs c r e e n i n g i n 也es e l e c t i o nc u l t u r em e d i u mc o n t a i n i n g5 0 0 r n g lc e fa n d1 0 0 m g lk 锄g r o w t ho f t h er e c o v e r n gt i s s u ew a sd i s t i n c t l yr e s t r a i n e d w h i c hr e p r e s e n t e da sd e l a y i n gi n f o r m a t i o no fr e c o v e r i n gt i s s u e ，f e wr e c o v e r i n gt i s s u ef o r m e da b e u ti n15d a y s ，t h e l a r g e n e s sw a sf o r m e di nlm e n t h ，a n di u s tv e r yf e wo fl e a ft i s s u ed o 侬：d d i f f e r e n t i a t i o na n df o r m c dr e c o v e r i n gt i s s u e n o n - t r a n s f e r r e dt i s s u ec o u l dn o tf o r m a n yr e c o v e r i n g t i s s u ei nt h e8 f l l l em e d i u m 4 a n a l y s i so fk e nr e s i s t a n c e ，p c r ，p c r - e n z y m ea n da p i dt e s to nt r a n s f e r r e dp e t u n i a h y b r i d ap l a n t sw a sc a r r i e do u t w eg o ts o m et r a n s f e r r e dp e t u n i ah y b r i d a p l a n t st h r o u g h m e d i a t i o no f a g r o b a c t e r i u m w h e nt h es e e d l i n g sg r o w e dt o3 - 5l e a v e ss t a g e ，m o v e dt h e mt o e m b r y oi n d u c e m e n tm e d i u ml o wa g a rc o n t a i n e d t a k i n gr o o t s t r a n s p l a n t e dt h o s e p l a n t sw h i o hr o o t sd e v e l o p e dw e l lt oe a r t h , a f e rw o r k o u t e d2w e e k s 1 0 0 0 m lk a n w a sd i p p e do n t ot h eg r o w t hp o i n to fp l a n t sw h i c ht r a n s f e r r e dp c a m b i a 2 3 0 0 一a q3 6 o u to f 4 2t h e md i dn o ta p p e a ra n yc h a n g e b u tt h em b i r t h i n gl e a v e so fc k p l a n t sa n d t h eo t h e r6t r a n s f e r r e dp l a n t sa p p e a r e dy e l l o ws p o t s r e p e a t e dt w i c e ，r e s u l l sd i dn o t c h a n g e s e l e c t e d2 0t r a n s f e n e dp l a n t st ob eb s e do np c rt e s t ，u s i n gs p e c i a lp r i m e r st o a m p l i f i e dg n aa n da c ag e n e t h er c s u l t ss h o w e dt h a ta l lp e t u n i ah y b r i d ep l a n t s w h i c ht r a n s f e r r e db yp c a m b i a 2 3 0 0 - a gw e r eg n ap c rt e s tp o s i t i v e , a n d4o u to f t h e mw e r ea c ap c rt e s tn e g a t i v e 1 6o u to f t l l e mw e r ea c ap c rt e s tp o s i t i v e w e u s e dt h ep c r e n z y m ea n a l y s i st ov a l i d a t et h ep c rt e s tr e s u l t so f g n aa n da c a t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg n aa n da c a g e n ea m p l i f i e df r o mt r a n s f e r r e dp l a n t sg e n o m e w e r er c a lp o s i t i v e a p h i dt e s tr e s u l t ss h o w e dt h a t2 0 o ft h e r nr e s t r a i nm t ew e r e0 3 0 o ft h e mr e s 在a i nr a t ew e r en o tm o r et h a n5 0 a n d5 0 o ft h e l t lr e s t r a i nr a t e w e r em o r et h a n5 0 p e t u n i ah y b r i d ep l a n t sw h i c ht r a n s f e r r e db yp c a m b i a 2 3 0 0 a gc o u l dr e s t i a i nt h ea p h i d sd i s t i n c t l y , t h ea v e r a g er e s t r a i nr a t eo ft h o s er e s i s t a n t p l a n t sw a s6 3 15 p r e s e n t i n gg n aa n da c ac o u l dr e s t r a i nt h eg r o w t ha n d p r o p a g a t i o no f a p h i d k e yw o r d s ：p e t u n i ah y b r i d s ，t i s s u ec u l t u r e ，a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ， r e s i s t a n t et e s t s 声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南林学院或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示了谢意。 签名：到o ! 然 日期：趣：臣 关于论文使用授权的说明 本人同意：西南林学院有权保留论文的复印件，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文：提交论文一年后，允许论文被查阅和借阅，学校可以公布论文的全部 或部分内容。 ( 保密的论文在解密后应遵守此靓定) 签名：习立：孳导师签名：盔a 匕眨筵 日期：乏型：垒： 1 前言 1 前言 1 1 矮牵牛的分类地位和生长习性 矮牵牛( p e t u n i ah y b r j d a ) 又名碧冬茄、番薯花，茄科碧冬茄属；二年生草本 花卉，株高1 5 - 4 5 厘米，全株上下都有白色粘毛；茎直立或稍呈匍匐状；叶卵形全缘， 几无柄，互生，嫩叶略对生；花单生叶腋及顶生；花萼5 裂，裂片披针形；花冠漏斗 状。花瓣变化多，有重瓣、半重瓣、单瓣及花瓣边缘皱褶或里波状锯齿等各式变化。 花型有大花、小花之分；花色丰富，有纯白、粉红、桃红、玫瑰红、紫红、深红、紫 色、雪膏、红自相间，以及具有各种条纹、网纹和放射纹等等镶嵌间色。矮牵牛因其 花朵似牵牛，植株矮小而得名。 矮牵牛原产南美，喜温暖和阳光充足环境，不耐寒，怕雨涝；矮牵牛的生长适温 为1 3 1 8 c 。矮牵牛喜干怕湿，在生长过程中，需充足水分，特别夏季高温季节， 应在早、晚浇水，保持盆土湿润。但梅雨季节雨水多，对矮牵牛生长十分不利，盆土 过湿，茎叶容易徒长，花期雨水多，花朵褪色，易腐烂，若遇阵雨，花瓣容易撅裂。 如盆内长期积水，往往根部腐烂，整株萎蔫死亡。矮牵牛属长日照植物，生长期要 求阳光充足，大部分矮牵牛品种在正常阳光下，从播种至开花在1 0 0 天左右，如果光 照不足或阴雨天过多，往往开花延迟1 0 1 5 天，而且开花少。因此，冬季棚式栽培 矮牵牛时，在低温短日照条件下，茎叶生长繁茂：当春季长日照条件下，从茎叶顶端 很快着花。矮牵牛宜用疏松、肥沃和排水良好的微酸性砂质土壤。矮牵牛在条件适宜 时( 每日1 2h 以上的光照和2 0 - 2 5 ) ，一年四季都能开花，尤其是干燥温暖和阳 光充足的条件下会开得更加繁茂，从而成为炎热夏季装饰城市的“宠儿”，而在南方， 矮牵牛更是秋冬季节的时尚花卉，种植极为广泛。 1 2 矮牵牛研究进展 自1 8 0 3 年j u s s c a u 确定了矮牵牛属以来，已确定的矮牵牛大约3 0 种，由于矮牵 牛早期分类比较混乱，现在栽培的矮牵牛其确切来源尚不清楚，据推测，为腋花矮牵 牛限a x i l l a r i a ) f f l 撞羽矮牵牛( 户w i l a v e a ) 杂交变异而来。矮牵牛栽培育种比较早， 栽培品种非常丰富，至1 9 6 5 年已记载的有4 3 6 个品种。目前，矮牵牛主要有4 种类 矮牵牛转a c a 与g n a 双价抗蚜虫基因的研究 型：大花复瓣型、复瓣多花型、单瓣大花型和单瓣多花型。常见的栽培品种有梦幻系 列( d r e a m sh y b r i d s ) 、阿拉丁系列( a l a d d i nh y b r i d s ) 、神奇系列( m a g i ch y b r i d s ) 、 夸张系列( u l t r ah y b r i d s ) ，瀑布系列( d o u b l ec a s c a d eh y b r i d s ) 、波浪系列( w a v e h y b r i d s ) 和幻想曲系列( f a n t a s yh y b r i d s ) ( 彭春秀，2 0 0 3 ) 。 1 2 1 常规育种 矮牵牛人工育种较早，矮牵牛自1 8 3 5 年由威廉赫伯特( w i l l i a m h e r b e r t ) 育成 以后，1 8 4 9 年又出现重瓣矮牵牛品种。1 8 7 6 年通过自然突变育成了四倍体大花矮牵牛 系列。1 8 7 9 年很快又推出矮生小花品种。1 8 8 0 年，s h e p h e r d 夫人在加州做过矮牵牛 的杂交，培育出享有盛名的“c a l i f o r n i ag i a n t ”和“s u p e r h i s s i m a ”类型，但这些 品系长得不够健壮，花繁密度小，不适于露地种植。1 9 3 0 年育成杂种1 代的矮牵牛品 种，矮牵牛具有明显的杂种优势。目前，市场上卖的都是f l 代的种予。 国外对矮牵牛的遗传规律及杂交育种研究较早，并有一整套完善的f l 代育种程 序，从而为迸一步培育矮牵牛新品种打下基础，而杂交育种由于涉及到商业价值，有 关这方面的报道较少。自1 9 3 0 年日本首次培育了f l 代矮牵牛品种以来，通过常规方法 获得矮牵牛品种越来越多。国外一些大公司拥有丰富的遗传资源，已选育出许多纯系， 品种不断推陈出新，创造出极大的经济效益，并在园林绿化上起着重要作用。2 0 世纪 3 0 年代，这些第一代商品矮牵牛逐渐被日本阪田种草公司育成的完全重瓣品系( 1 9 3 4 年获美国a a s 大奖品种) 所替代。然而这种局面并没有维持多久，1 9 4 0 年p a n a m e r i c a n 公司解开了完全性多瓣品种的育种之谜，并相继培育出新的品种及杂交一代的品系， 后者又代替了前者，成为矮牵牛市场的主角。直到1 9 5 7 年阪田种苗再次育成红自相间 的名花，才重新回到竞争的舞台。随后竞争越来越激烈，品种更新也越来越快，1 9 8 9 年日本三多利啤酒公司推出“s a l i n i a ”葡萄性的新品种，由于品种特性佳，宣传手 法得当，从而对矮牵牛种苗的生产产生了极大的影响，1 9 9 7 年仅日本国内一年就卖出 了1 2 0 0 万盆，欧美市场则共销售4 6 0 0 万盆，成了难得的超级商品。现在，美国、日本 和韩国等国都已培育出许多f l 代杂种，并已注册专利。韩国的s o n g 等( 1 9 9 9 ) 用4 4 个 f l 代商业品种通过6 年连续自交获得了2 7 个第6 代纯系，并在s 5 和s 6 代对生长、开花期、 。花色、花径和耐湿性等进行调鸯，在s 6 代选择了2 7 个纯系，包括3 个白色系列、2 个黄 色系列、9 个粉红色系列、1 个珊瑚色系列、6 个红色系列和6 个紫色系列。国内黄善武 ( 1 9 9 8 ) 用f 1 代杂种为试材采用6 0 c oy 射线诱变、分离和单株系选的方法选育自交系 1 前言 和雄性不育系，并获得了蓝紫、粉红、亮粉红和深红等花色的矮牵牛一代杂种6 个。 唐小敏和齐鸣( 2 0 0 1 ) 用6 个矮牵牛的自交系透过双列杂交进行矮牵牛杂种优势研究 初步摸清矮牵牛杂种优势的一般规律。 1 2 2 生物技术育种 2 0 世纪7 0 年代以来，随着组织培养技术的发展，植物基因工程、体细胞工程及单 倍体育种在种质资源创新和品种选育中的地位越来越重要。目前，国内外在矮牵牛的 研究上已取得了相当好的成绩，相关专家曾进行过叶、茎、节间、叶肉原生质体、花 粉粒、根分生组织、茎尖分生组织、芽、花瓣等外植体类型的研究：如h a n d r o 等( 1 9 7 2 ) ， r a o ( 1 9 7 3 ) 曾利用矮牵牛杂种及重瓣杂种等的叶、茎、节间作外植体，再生形成不 定苗式胚状体。矮牵牛组织培养较易成功，在植物基因工程育种、体细胞育种及单倍 体育种都取得了一定的进展，基因工程育种已创造出新品种并加以应用，而体细胞育 种和单倍体育种直至现在尚无新品种产生，但它们在探索这两种技术在植物育种上的 可能性和前景作出了极大的贡献，并为其它植物种类的生物技术育种提供了理论基础 和技术模式。 1 2 2 1 矮牵牛基因工程育种 矮牵牛比较容易再生，组织与细胞操作技术简单，生活周期短，遗传背景清晰， 是一种重要花卉。随着花卉萋因工程研究的不断发展，矮牵牛作为一种转基因的模式 植物，对它进行转化所取得成功的例子是最多的。目前，已有新品种应用于生产。 h o r s c h 等( 1 9 8 5 ) 首次获得矮牵牛转基因植株。m a y e r 等( 1 9 8 7 ) 酋次将玉米色素合 成中的一个还原酶玉米二羟基黄酮醇还原酶( d i h y d r o f l a v o n o l4 - r e d u c t a s e ， d f r ) 基因转入矮牵牛，得到了花色变为砖红色的矮牵牛。v a nd e lk r o l 等( 1 9 8 8 ) 将 反义c h s 基因转入矮牵牛，抑制了色素合成系统，使得矮牵牛的花色由紫色变成白色。 查尔酮合酶是花色素合成途径中的关键酶，它在植物中的表达量直接影响到花色的变 化，在矮牵牛中，c h s 基因组成了一个多基因家族，包括8 一i 0 个成员( k o e s 等1 9 8 9 年) 。 在檀物正常发育过程中，只有c h s a 和c h s j 被表达，并且这种表达限于花组织中( 花冠 和花药) ，其中由c h s a 转录的m h n a 占总c h sm r n a 的9 0 。日本的三得利公司成功合成了 蓝色色素的基因f 3 5 h ，并导入白色矮牵牛中，得到了蓝色牵牛( 苏焕然等，1 9 9 6 ) 。 农杆菌介导的间接转化法适用于双子叶植物，矮牵牛因易于进行根癌农杆菌介导 矮牵牛转a c a 与g n a 双价抗蚜虫基因的研究 的基因导入，为通过转基因方法研究基因的功能提供了有利的条件( 国风利和孟繁静， 1 9 9 7 ) 。为此，矮牵牛的基因工程育种纷纷展开，并创造了一系列新品系，邵莉等( 1 9 9 5 年) 将来源于矮牵牛中的查尔酮合酶基因正向克隆到含有c a m v 3 5 s 启动子的中间介体 中，通过土壤农杆菌介导导入矮牵牛，转基因矮牵牛由原来紫色的花变成白色或紫自 相间的花朵，其育性也受到了影响，不能产生正常花粉粒，成为雄性不育株。n o r t h e r n 杂交分析表明，转基因植株花瓣中，内源和外源查尔酮合酶基因的转录均受到抑制。 d ej a e g e r 等( 1 9 9 9 ) 在矮牵牛的细胞液中表达抗体的单链可变区，五种s c f v 编码 区序列与3 5 s 启动子构建融合基因转化矮牵牛，在转基因植株的瞬间和稳定表达中都 有抗体片段的表达。李艳等( 2 0 0 1 年) 将9 一葡糖苷酸酶基因( u i d a ) 连在c h s a ( c h a l c o n es y n t h a s ea ，c h s a ) 基因下游形成融合基因，通过土壤农杆菌法转入矮牵牛，利 用g u s 组织染色检测到共抑制的发生具有发育特异性，在花组织发育时期开始发生， 发生的起始需要内源基因与外源基因的相互作用。r n a 原位杂交实验表明，共抑制的 发生没有组织特异性，且初步表明共抑制发生后，r n a 可能是在细胞质中发生降解的。 安利忻等( 2 0 0 1 ) 将a p i 基因克隆入植物中间载体p 2 0 8 ，通过根癌土壤杆菌介导的方法 转化矮牵牛( p e t u n i ah y b r i d av i l m ) 。对转基因植株进行了p c r 和s o u t h e r n 检测， 所得到的两个株系的转基因矮牵牛在r o 代即表现出提前且持续不断地开花的特性， 与对照差异显著。张伟等( 2 0 0 1 ) 利用农杆菌介导的方法将m t 及oq 基因导入矮牵牛 中。转基因植株对铅( p b ) 的抗性及吸收能力明显高于对照。p b 的吸收实验表明转m ， dd 基因的植株对p b 的吸收分别比对照提高了2 8 和3 5 。转m t 及da 基因植株后代种 子萌发与对照相比表现出明显的抗p b 优势。毛自朝等( 2 0 0 3 ) 通过p c r 程序克隆粪透 明颇菌血红蛋白基因( ( v h b ) 的编码区，将其置于c a l v l v3 5 s 启动子的驱动下导入矮牵 牛。p c r 和s o u t h e r n 杂交分析证明v h b 基因已整合到受体基因组中，而r t p c r 检测证实 了转基因矮牵牛中v h b 基因转录水平的表达。观察了转基因株系在液体培养基中对淹 水和缺氧的反应，发现v h b 的表达明显促进了水培植物的生长。为进一步研究转基因 植物在低氧条件的耐受能力，将上述的转基因株系在静置的液体培养基中进行完全的 淹没培养，结果显示转基因植株具有较强的低氧耐受能力。王君丹等( 2 0 0 4 ) 将厚叶旋 蒴苣苔脱水素( d e h y d r i n ) 基因b d n i 置于c a m v 3 5 s 启动子的调控之下，并插入于表达载 体p c a m b i a 3 3 0 0 中，通过根癌土壤杆菌( a g p o b a c t e r i u mu m e f a c i e n s ) 介导导入矮牵牛 ( p e t u n i ah y b r i d a ) ，经p c r 及s o u t h e r n 杂交表明b d n i 己转入矮牵牛基因组中，n o r t h e r n 实验证明，b d n i 基因在矮牵牛中在r n a 水平有较强的表达。通过对转b d n i 基因矮牵 4 i 前言 牛的保水力和低温离子渗漏的测定，初步验证转基因矮牵牛对水分胁迫的能力在一定 程度上有所增加。 1 2 2 2 体细胞杂交育种 自1 9 6 0 年以来用酶法获得大量有活力的植物原生质体，现已从四十多种植物的原 生质体产生出再生植株。通过异种原生质体的相互融合( 即体细胞杂交) 为植物