分子生物学.ppt

1,基因操作原理及相关技术,Parttwo:,基因操作(genemanipulation)基因工程(geneengineering)遗传工程genecloningmolecularcloning基因操作的核心部分为重组DNA技术。RecombinationDNAtechnology,3,基因工程与建筑工程,生物反应器,DNARecombination,1定义：对目的基因进行体外重组，再将重组分子导入受体细胞，使这个基因在受体细胞中复制、转录、翻译表达的过程。克隆（clone）：n,无性繁殖系及其后代。基因完全相同;v,指从同一祖先产生这类同一的DNA分子群或细胞群的过程。（Gene,cell,个体）,20世纪70年代发展起来的遗传学的一个分支学科。,理论上三大发现：Avery肺炎双球菌转化实验：证实了遗传物质的本质是DNA（1944年）Watson和Crick：提出DNA双螺旋结构模型（1953年）Nirenberg等：确定了遗传信息的传递方向（1961-1966年）DNARNA蛋白质,技术上三大发明：工具酶：分子手术刀，切割与缝合基因，包括限制性内切核酸酶、连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等，对DNA或RNA进行各种各样的修饰。载体(vector,vehicle)：本意是媒介体，在基因工程上指能将目的基因导入宿主细胞的DNA分子。逆转录酶（reversetranscription,RT)：打破了中心法则，使真核基因制备成为可能，RT-PCR。RNADNA,genemanipulation过程,1、目的基因的获取（PCR,genelibrary)；2、载体(vector)的选择与构建(工具酶等）；3、目的基因与载体连接，构建重组DNA分子；4、重组DNA导入受体细胞，转化子筛选；5、受体细胞中目的基因的功能表达。,基因工程的基本过程,分(合成)、切、连、转、选、鉴,重组DNA技术的意义,打破了自然种的界限真核/原核生物间基因的交流对生物进行定向改造基因治疗（基因矫正/添加，RNAi）基因工程药物（生长激素，细胞生长因子，重组疫苗等）,10,组织纤溶酶原激活物（tissueplasminogenactivator，tPA）,Oneexample-,How,？,载体，工具酶,基因操作的工具酶,限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease)DNA聚合酶连接酶（Ligase）反转录酶(Reversetranscriptase)碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）末端转移酶等,1、限制性内切酶,定义：是一类能够识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。EcoRI,HandIII,SalI,14,命名：3-4个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号第1字母（大写）产生该酶细菌的属名的第一字母；第2、3字母（小写）细菌的种名；第4字母（大写）细菌菌株名；罗马数字代表该菌株中发现的第几个酶。EcoRI:EscherichiacoliR(大肠杆菌R株),限制与修饰（Restriction-modification）,细菌体内存在限制和修饰系统（R-M）对自身的DNA进行甲基化修饰，免受自己限制酶的分解，对外来的DNA通过限制性内切酶降解，一般是指对外源DNA侵入的限制。应用：正是对限制和修饰现象的深入研究，导致限制性内切核酸酶的发现，应用甲基化处理保护免受限制性内切酶降解,分类,根据限制性内切核酸酶的作用特点，分为三大类。,I类限制性内切核酸酶,类限制性内切核酸酶,18,是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切。,类限制性内切核酸酶:,类限制性内切核酸酶,识别序列的长度：一般为4-8个碱基，最常见6个碱基。识别序列的结构：大多数为回文对称结构，切割位点在DNA两条链相对称的位置。回文结构：一条单链以中心轴对折可以形成互补的双链。,粘性末端（cohesiveend）-在DNA双链的不同位置切割DNA，形成有单链突出的末端。平末端（Bluntend）-在DNA双链的相同位置切割DNA分子。,限制酶产生的末端：,21,常用的限制性内切酶,22,DNA连接酶（ligase）,作用：使DNA的3羟基末端和5磷酸末端形成3-5磷酸二酯键，将两段DNA连接起来种类：T4DNAligase（噬菌体来源）E.coliDNAligase注意：连接DNA片段是否粘端；反应温度（16）和时间,23,24,DNA聚合酶,复制（DNAReplication）:亲代DNA双链分子(D.SDNA)在DNA聚合酶的作用下，分别以每单链DNA分子(S.SDNA)为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP，合成两条与亲代分子完全相同的子代DNA分子的过程。,25,DNA5ATGACTG33TACTGAC5RNA5AUGACUG3转录：以S.SDNA为模板，在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下.逆转录：.依赖RNA的DNA聚合酶,DNA聚合酶,26,DNA聚合酶与DNA复制,27,常用的DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶；E.coliDNApolymerase的Klenow片段（Klenow酶）；耐热DNA聚合酶；反转录酶,28,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶（E.coliDNApolymerase）及其大片段（Klenow片段）,29,大肠杆菌DNA聚合酶I的酶活性5-3DNA聚合活性3-5外切酶活性5-3外切酶活性Klenow片段的酶活性5-3DNA聚合酶活性3-5外切酶活性,30,主要用途:,用切口平移法（nicktranslation）标记DNA，制备探针。,31,5-3外切酶活性5-3DNA聚合活性3-5外切酶活性,32,耐热DNA聚合酶,TaqDNA酶是一类耐热的DNA聚合酶。具有5-3聚合酶活性和5-3外切酶活性多数Taq酶缺乏3-5外切酶活性，反应温度70PCR（polymersechainreaction,聚合酶链式反应),33,逆转录酶（ReverseTranscriptase）,催化以RNA为模板的聚合反应，称依赖RNA的DNA聚合酶。以mRNA为模板，催化合成出互补的DNA，称为cDNA(complementaryDNA)；RT-PCR常见的逆转录酶:AMV:禽病毒来源反应温度42MMLV:鼠来源病毒反应温度38,34,RT-PCR,35,末端转移酶（terminaltransferase）,活性：催化dNTP加到3羟基末端用途：制造人工粘端进行末端标记,36,碱性磷酸酶alkalinephosphatase,作用：去除5磷酸基团，防止自身连接。种类：BAP-细菌性碱性磷酸酶CIP-牛小肠碱性磷酸酶用途：基因克隆中防止载体自身环化,37,其它：多聚核苷酸激酶：提供磷酸基团RNase-ribonucleaseDNase-deoxyribonuclaese,基因操作的载体,携带目的基因进入宿主细胞的运载工具（vector）,质粒载体,噬菌体(Lambdaphage),39,克隆载体：目的基因的克隆、扩增序列分析等表达载体（expressionvector）：表达外源基因,带有启动子，核糖体结合位点以及表达标签等。原核表达载体：E.coli真核表达载体：酵母，哺乳动物，昆虫细胞表达载体,40,载体的条件：1含有独立自主复制起点，便于在宿主中扩增；2一个或多个筛选标记，如抗性基因-氨苄青霉素抗性基因（Ampicillinresistancegene,ampr)；表型的显色反应等。3多克隆位点，便于目的基因的克隆。4高拷贝，便于分离提纯。,筛选标记：用来区别重组质粒与非重组质粒。当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。,筛选标记：当一个外源DNA片段克隆到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。用来区别重组质粒与非重组质粒。-互补：（-complementation）蓝白斑筛选,插入失活(pBR322)该质粒具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。当外源DNA片段插入tetr基因后，导致tetr基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。,多克隆位点（MultipleCloningSite）,是一段人工合成的DNA序列，含有密集排列的多种限制性酶切位点，以利于不同来源的外源DNA片段插入载体。,质粒载体(plasmidvector)1.概念：细菌染色体以外的，能自主复制双链闭合环状DNA分子。其大小可从2-3kb到200kb（kilobase)左右，能够在宿主内利用宿主的酶系统进行复制,赋予寄主一些新的遗传性状。,47,2.质粒载体分类质粒拷贝数(plasmidcopynumbers)：指细菌中质粒的分子个数,常用质粒数/每染色体来表示。严紧型质粒和松弛型质粒,松弛型质粒(relaxedplasmid)：复制只受本身的遗传结构的控制，有较多的拷贝数。严紧型质粒(stringentplasmid)：在寄主细胞内的复制除了受本身复制机构的控制外，还受染色体的严紧控制，因此拷贝数较少。,Example:pBR322质粒,50,pUC18/19,51,噬菌体phagevector,感染细菌的病毒,52,噬菌体Lifecycle,噬菌体载体分类：,双链（噬菌体）单链丝状（M13）在噬菌体颗粒内，基因组DNA呈线性，其两端的5末端带有12个碱基的互补单链（cos粘性末端），12个碱基的序列为5-GGGCGGCGACCT-3。当噬菌体DNA进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状DNA分子。,噬菌体载体types:1插入型载体：外源DNA直接插入噬菌体，容量小，容量6-8Kb的DNA片段，用于cDNA的克隆和cDNA文库构建。2置换型载体：噬菌体基因组中非必需基因被外源DNA替代，容量10-20Kb，用于基因组DNA的克隆和基因组DNA文库的构建。,粘粒载体（cosmid）cossite-carryingplasmid,带有粘性末端位点的质粒。由质粒和噬菌体的cos粘性末端构建成，容量大（45Kb），用于基因组文库构建。,56,病毒载体:逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒（AAV）载体等,57,腺病毒DNA不会整合到宿主细胞的基因组中，不会干扰其宿主细胞内基因的正常功能,基因治疗中最常用的病毒载体之一。,人类腺病毒为无包膜的DNA病毒，由20面体的蛋白质外壳和蛋白核酸组成，病毒基因组为双螺旋线性双链DNA，长约36kb。,58,美