（动物学专业论文）大熊猫主要组织相容性复合体Ⅱ类基因研究.pdf

浙江大学博士沦文 大熊猫主要组织棚容性复合体l i 类基因研究 内容提要 大熊猫( a i l u r o p o d am e l a n o l e u c a ) 是我国特有的国家l 级珍稀濒危保护动 物。目前仅分布于陕西、四川和甘肃三省的秦岭山脉和岷山、邛崃与凉山山脉等 青藏高原东缘的边缘地区。根据国家林业局和世界野生动物基金( w w f ) 截至 2 0 0 4 年、历时4 年的对大熊猫及其栖息地的全面调查结果，我国现存野生大熊猫 约1 6 0 0 只。一万多年以来，由于受晚更新世冰川末期的影响，以及人类在其漫长 的历史发展岁月中对栖息地的逐步蚕食，分布于秦岭、岷山、邛崃、凉山、大相 岭和小相岭等六个l l l 系的大熊猫，已成为六个孤立的小种群，且秦岭种群已分化 为大熊猫的一个亚种秦岭亚种( a i l u r o p o d a ? 1 1 q i n l i n g e n s i s ) 。 大熊猫的人工圈养繁育工程始于2 0 世纪8 0 年代。迄今为止，圈养于世界各地 的大熊猫共有1 8 3 只。其中，中国大熊猫保护中心( 卧龙) 及其所属的碧峰峡基 地( 雅安) ，以及成都大熊猫繁育研究基地共有大熊猫1 4 3 只，是最大的三个人工 圈养种群占圈养大熊猫总数的7 8 。 本文在中国大熊猫保护中心( 卧龙) 及其所属的碧峰峡基地( 雅安) 、成都 大熊猫繁育研究基地、佛坪国家级自然保护区和楼观台珍稀野生动物救助中心共 采集大熊猫秦岭亚种和指名亚种( a i l u r o p o d a m e l a n o l e u c a ) 的6 3 只随机个体的 粪便、血液、肝、肾和皮张样品7 3 份，并选择主要组织相容性复合体( m h c ) i i 类分子中多态性最高的d r b 和d q a 位点的第二外显子序列作为分子标记，分别 开展了粪便中大熊猫高质量d n a 提取方法的研究和m h c 基因d r b 和d q a 位点 的遗传变异性分析，获得了如下的主要研究结果： 1 建立了大熊猫粪便样品长期保存，以及自粪便样品中提取犬熊猫高质量d n a 的技术方法，解决了该物种基因组d n a 获取的非损伤性策略，并为其它濒危 野生动物基因组d n a 的材料来源提供了借鉴。 2 在大熊猫秦岭亚种和指名种中，共发现m h c 基因i l 类分子的d l i b 位点有7 个等位基因，分别被命名为a i m e - d r b * 1 、a j m e - d r 斜2 、a i m e - d r b * 3 、 a i m e - p r ? * 4 、a i m e - d r 劈5 、a l i n e - d r i p 6 和a i m e - d r b * 7 。其中，秦岭亚利，在该 浙江大学1 撙士论文大熊猫主要组织相容性复合体i i 类基囚研究 位点上具有a i m e - d r b l 、a i m e - d r l 萍4 、a i m e - d r b * 5 、a i m e - d r 辟6 和a i m e - d r b 7 5 个等位基因，且其中的a i m e - d r b 5 、a i m e - d r b * 6 和a i m e - d r i 拌73 个等位基因 为秦岭亚种所特有；而在指名亚种中，共有a i m e - d r b * i 、a i m e - d r 睁2 、 月砌p 一撕傍3 和a i m e - d r 劈4 4 个等位基因，且其中的a i m e - d r 傍2 和a i m e - d r 辟3 2 个等位基因，为指名亚种所特有。此结果表明，大熊猫秦岭亚种和指名亚种 在m h c 基因i i 类分子的d r b 位点上，己因产生了部分的遗传变异而进化形 成了各自的特有等位基因，从而在分子水平上，进一步为大熊猫秦岭亚种的 形成，提供了佐证。 3 在d q a 位点上，秦岭亚种和指名亚种共有6 个等位基因，分别被命名为 a i m e d q a * 1 、a i m e - d q 纠 2 、a i m d d q a * 3 、a i m e d q a * 4 、a i m e d q 爿 5 和 a i m e d q 爿 6 ，但秦岭亚种共有全部的6 个等位基因，而指名亚神却只有 a i m e - d q a * 1 、a i m e d 鲫 2 、a i m e d q a 3 、a i m ed 刨 4 和a i m e d 幽$ 55 个 等位基因。进一步分析还发现，成都大熊猫繁育研究基地种群拥有指名亚种 的全部5 个等位基因，但中国大熊猫保护中心( 卧龙) 及其所属的碧峰峡基 地( 雅安) 种群却缺少该位点中的a i m e d 鲫 3 这一等位基因。 4 分别对m h c 的d r b e i d q a 位点的等位基因数和变异率的分布差异进行分析 后发现，秦岭亚种、指名亚种、中国大熊猫保护中心( 卧龙) 、碧峰峡基地 ( 雅安) 和成都大熊猫繁育研究基地的大熊猫的多样性水平，与其它经历过 瓶颈效应的濒危动物相当，但较未曾经历过瓶颈效应的物种为低。 5 中国大熊猫保护中心( 卧龙) 、碧峰峡基地( 雅安) 和成都大熊猫繁育研究 基地三个人工圈养的大熊猫种群在d r b * 0 d q a 位点上的杂合度，都低于 h a r d y - w e i n b e r g 平衡的标准。经分析本文认为，导致该结果的原因，可能是由 于建群者( 奠基者) 的数量较小，不可避免的近交造成d r b 年i d q a 位点等位 基因纯合的缘故。与此同时，本文还发现d r b 和d q a 两个位点的等位基因在 秦岭亚种的野生种群中平均分布，但在四j i i 亚种圈养种群中的分布却有所偏 向，且尤以成都大熊猫繁育研究基地为甚。这说明在圈养种群中，近交已经 在定程度上造成了种群遗传多样性的下降，有必要在圈养大熊猫的繁殖管 理中，采取一定的措施，防止遗传多样性的进一步丢失。 6 通过对d r b 和d q a 位点的等位基因抗原结合位点之异义置换相对速率同 浙江大学博士论文 太熊猫主要组织相容性复合体i i 类基因研究 义置换相对速率的比值分析，发现两个位点等位基因的异义置换速率在抗原 结合位点上，均远远大于同义置换位点。而在非抗原结合位点上，其异义置 换速率则接近甚至小于同义置换相对速率。此结果表明，大熊猫d r b 和d q a 位点的抗原结合位点和非抗原结合位点，具有不同的进化方式，从而为“m h c 基因的多态性是由正向选择来维持”的观点，提供了佐证。 7 通过邻接法构建的d r b 位点之等位基因进化树，本文发现在该位点的 a i m e - d r b i a i m e - d r b * 7 中，等位基因a i m e - d r 毋6 和a i m e - d r 傍7 与其它五 个等位基因的，更接近于猫科动物的同源基因。由此推测，大熊猫的m h c 基因，具有跨物种进化的特点。 8 通过血液总r n a 的提取和反转录检测，证明了大熊猫d r b 和d q a 位点的等位 基因，能够在其体内表达形成蛋白分子以行使与免疫相关的功能。 9 根据上述结果，本文提出了在人工圈养种群中如何保护大熊猫等位基因的多 态性和平衡种群内等位基因频率的一些建议。 关键词：大熊猫；秦岭亚种：指名亚种：粪便d n a ；主要组织相容性复合体( m h c ) d r b ；d q a ；单核苷酸构像多态性( s s c p ) ；遗传多样性；平衡选择 跨物种进化：保护建议。 6 浙江大学博士论文大熊猫主要虮织相容性复台休1 1 类基因研究 a b s t r a c t g i a n tp a n d a i l u r o p o d am e l a n o l e u c a ) i sa ne n d a n g e r e ds p e c i e st h a ti s e n d e m i ct oc h i n a c u r r e n t l y 。t h eg i a n tp a n d a sa r er e s t r i c t e dt ot h ei s o l a t e d q i n l i n gm o u n t a i nr e g i o n o fs h a a n x ip r o v i n c ea n dt h em i n s h a n q i o n g l a i x i a n g l i n ga n dl i a n g s h a nm o u n t a i n so fs i c h u a np r o v i n c eo nt h ee d g eo ft h e t i b e t a np l a t e a u ( s c h a l l e re ta 1 19 8 5 ；m a c k i n n o ne ta 1 19 8 9 ；o b d e ne ta 1 19 9 4 ) t h eh i s t o r i c a ls e p a r a t i o nb e t w e e nt h eq i n l i n ga n do t h e rp o p u l a t i o n s h a sy i e l d e dan e wq i n l i n gs u b s p e c i e s ( a i l u r o p o d am q m l i n g e n s s ) f r o mt h e n o m i n a t es i c h u a ns u b s p e c i e s ( a i l u r o p o d a ，n m e l a n o l e u c a ) f w a ne ta 1 2 0 0 3 ； w a ne ta l ，2 0 0 5 ) a c a p t i v eb r e e d i n gp r o g r a mw a si n i t i a t e di nt h e1 9 8 0 s ，a n dn o wt h e r e1 8 3 g i a n tp a n d a s i nt h ec a p t i v ep r o g r a m t h eg i a n tp a n d ab r e e d i n gb a s e si n y a a n w o l o n ga n dc h e n g d un o wc o n t a i nl a r g ec a p t i v ep o p u l a t i o n so ft h e s i c h u a ns u b s p e c i e s c o m p d s i n g1 4 3i n d i v i d u a l s ，r e s p e c t i v e l y ( x i e g i p p s ， 2 0 0 4 ) ， i nt h i ss t u d y , w ec o l l e c t e ds a m p l e sf r o m6 3i n d i v i d u a l t h es a m p l e sc o v e r e d t h eb o t hs u b s p e c i e so fg i a n tp a n d aa n db o t ht h ew i l d a n dt h ec a p t i v e p o p u l a t i o n s w es e l e c t e dm a j o rh i s t o c e m p a t i b i l i t yc o m p l e x ( m h c ) a sg e n e t i c m a k e r s ，a n dd i dc o m p r e h e n s i v e i yr e s e a r c ho ng e n e t i cd i v e r s i t yo ft h i ss p e c i e s w i t hf u n c t i o n a ll o c i w ea l s od e v e l o p e dar e l i a b l em e t h o df o ri s o l a t i n gd n a f r o mg i a n tp a n d af e c e s ，a st h i sw o u l da l l o wu st oa n a l y z eal a r g e r , f e c a l _ b a s e d s a m p l es i z e o u rm a j o rr e s u l t sw e r e , 1 w ed e v e l o p e dar e l i a b l ea n de f f i c i e n tm e t h o df o ri s o l a t i n ga n da n a l y s i s d n af r o mg i a n tp a n d af e c e s t h i ss e r i e so fm e t h o di n c l u d et h ec o l l e c t i n g ， c o n s e r v i n g ，e x t r a c t i n ga n da n a l y s i so ff e c e s o fg i a n tp a n d a c o n s t r u c t i o n o ft h i sm e t h o dw o u l db eb e n e f i tt of u t u r er e s e a r c hw i t h o u ti n t r u s i o no n g i a n tp a n d aa n do t h e rr a r ea n dc r y p t i cs p e c i e s 7 浙江大学博士论文大熊猫主要组织相容性复合体i i 类基困研究 2 w ef o u n d7a l l e l e so ni o c u sd r ba n dn a m e dt h e ma sa i m e - d r 毋1 、 a i m e - b r b * 2 ，a i m e - d r b * 3 ，a i m e - d r d # 4 、a j m e - d r 辟5 ，a j m e - d r 捞6a n d a i m e - d r d k 7 t h eq i n l i n gs u b s p e c i e sp r e s e n t e df i v ea l l e l e s ( a i m e - d r 辟1 、 a z m e - b r 劈4 、a j m e - d r l y # 5 、a m e - d r 料6a n da i m e - d r 辟7 ) i nw h i c ha l l e l e s a i m e - d r b 5 、a l m e - d r 劈6a n da i m e - d r b * 7a r ep r i v a t e t h es i c h u a n s u b s p e c i e sp r e s e n t e df o u ra l l e l e s ( a m e - d r 豫! 、a e m e - d r 麝2 、a i m e - d r 劈3 a n da i m e - d r 毋4 ) ，i nw h i c ha l l e l e sa i m e - d r d # 2a n da i m e - d r 劈3a r ep r i v a t e ， t h i sr e s u l tg i v e sf u r t h e rp r o o ft ot h es u b s p e c i a t i o n 3 w ef o u n d6a l l e l e so nl o c u sd q aa n dn a m e dt h e ma sa i m e - d q a + l 、 a i m e - d q a + 2 、a i m e - d q a + 3 、a i m e - d q a 奉4 、a i m e - d q a + 5a n da i m e - d q a t h eq i n l i n gs u b s p e c i e s p r e s e n t e da l l t h es i xa l l e l e sw h i l es i c h u a n s u b s p e c i e sp r e s e n t e d f i v eo ft h e m i m e d q 卅4 l 、a i m e - d q a * 2 、 a i m e d q a + 3 、a i m e d q a 4a n da i m e - d q ，哇+ 5 ) i n s i c h u a ns u b s p e c i e s ， c h e n g d up o p u l a t i o np r e s e n tf i v ea l l e l e s 似i m e - d 剑+ l 、a i m e - d q a 4 2 、 a i m e d q a + 3 、a i m e - d q a 4 4a n d a i m e d q a 5 ) ，w h i l ey a a n w o l o n g p o p u l a t i o np r e s e n t e df o u ro ft h e m “i m e - d q a8 1 、a i m e - d q a + 2 、a i m e d q a 聿4 a n da i m e d q a + 5 ) o n l y 4 d i v e r s i t yo fg i a n tp a n d a sm h cg e n ew a se v a l u a t e dw i t hr e s p e c tt ot h e n u m b e ro fa l l e l e sa sw e l ia st h en u m b e ro fs u b s f i t u t e i o n sb e t w e e na l l e l e s t h eg i a n tp a n d ad r ba n dd q ad i v e r s i t yi sm i n u t ec o m p a r e dw i t ht h a to f n o n b o t t l e n e c k e dv e r t e b r a t e sa n da tt h es a m ei e v e lw i t ho t h e rb o t t l e d v e r t e b r a t e s 5 i nc o n t r a s tt ot h et h e o r e t i c a l e x p e c t a t i o n s i n l a r g e a n do u t b r e e d p o p u l a t i o n s w eo b s e r v e dl o w e rt h a nn e u t r a ll e v e l so fh e t e r o z y g o s i t yi na l l t h r e e g i a n tp a n d ap o p u l a t i o n s( c h e n g d u ，y a a n - w o l o n g a n d l o p i n g i o u g u a n g t a i ) a l lt h ef i n d i n g ss u g g e s tt h a ti n b r e e d i n gm i g h ta c c o u n t f o rl o w e ro b s e w e d h e t e r z y o g o s i t y e w e n s - w a t t e r s o nt e s tr e v e a l e dt h a tt h e c a p t i v ey a a n - w o l o n gp o p u l a t i o ne x h i b i t e dam o r ee v e nd i s t r i b u t i o no f a l l e l e st h a n p r e d i c t e db y n e u t r a l t h e o r y , a sr e f l e c t e d i nt h ew i l d f o p i n g l o u g u a n t a ip o p u l a t i o n d e s p i t em o r ec a p t i v e b o m p a n d a s r 浙江大学博士论文大熊猫主要组织相容性复合体i i 类基因研究 s a m p l e d ，t h ec a p u v ec h e n g d up o p u l a t i o ni n d i c a t e dt h a tt h ed i s t r i b u t i o no f i t sf o u ra l l e l e sw a sc o n s i s t e n tw i t ht h en e u t m le x p e c t a t i o n 6 w ef o u n dt h r e et y p e so fe v i d e n c ef o rb a l a n c i n gs e l e c t i o nf o rt h eg i a n t p a n d aa l l e l e s ，f i r s t ，w ef o u n da no b v i o u se x c e s so fn o n s y n o n y m o u s s u b s t i t u t i o n so v e rs y n o n y m o u sa tt h ea b sp o s i t i o n s 。w h e r e a sal o w e r e s t i m a t eo fn o n s y n o n y m o u so n e st h a ns y n o n y m o u sw a sp r e s e n ti nt h e n o n - a b sp o s i t i o n s s e c o n d ，t r a n s s p e c i e se v o l u t i o no ft h ea l l e l e sa i m e 一6 a n da i m e 一7w a sr e v e a l e db e t w e e nt h eg i a n tp a n d aa n do t h e rf e l i n e s p e c i e s t h i r d ，w ef o u n dam o r ee v e nd i s t r i b u t i o no fa l l e l e st h a ne x p e c t e d f r o mn e u t r a l i t y 7 an e i g h b o r - j o i n i n g ( n j ) t r e ew a sc o n s t r u c t e dt o g e t h e rw i t hs e q u e n c ed a t a f r o mo t h e rc a r n i v o r e s r e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h ea i m e - d r 防6a n d a i m e - d r b * 7a l l e l e ss h o w e dh i g h e rd sv a l u e sa g a i n s to t h e rp a n d aa l l e l e s t h a ta g a i n s tc a tm h c a l l e l e s ，s t r o n g l ys u p p o r t i n gat r a n s s p e d e se v o l u t i o n o ft h ed r bl o c iu n d e rs t u d y , i e t h eo r i g i no ft h ea l l e l e sa i m e 一6a n da i m e 一7 p r e d a t e dt h ep h y l o g e n e t i cs p l i tb e t w e e n t h eg i a n tp a n d aa n do t h e rf e l i d s 8 r t - p c rf r o mb l o o dc d n au s i n gt h ee x o n l o c a t e dp r i m e r p a i rs h o w e dt h a t t h ec d n ap r o d u c td i dr e p r e s e n tt h em h ci id r ba n dd q a t a r g e tl o c u s d e m o n s t r a t i n gt h a tt h em h cg e n ee x a m i n e dh e r ei se x p r e s s e dl o c i 9 a c c o r d i n g t ot h er e s u l t sa b o v e ，w ep r o v i d e ds o m ea d v i c e sf o rt h e m a n a g e m e n t o f c a p t i v eg i a n tp a n d ap o p u l a t i o ni n c l u d i n g e f f o r t s u n d e r t a k e nt oi n c r e a s et h ea b u n d a n c eo fl e s s # e q u e n ta l l e l e sa c r o s sa l l p a n d ap o p u l a t i o n s k e y w o r d ：g i a n tp a n d a ；q i n l i n gs u b s p e c i e s ；n o m i n a t es u b s p e c i e s ；m a j o r h i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ( m h c ) ；d r b ；d q a ；s i n g l e s t r a n d c o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ( s s c p ) ；g e n e t i cd i v e r s i t y ；b a l a n c e s e l e c t i o n ；t r a n s - s p e c i e se v o l u t i o n ；c o n s e r v a t i o na d v i c e 9 浙江大学博士论文 大熊猫主要组织相容性复合体类基因研究 第一部分 文献综述 0 浙江大学博士论文 太熊猫主要组织相容性复台件1 1 类基因研究 第一章大熊猫研究综述 大熊猫( a j l u r o p o d am e a n o j e u c a ) 是我国特有的国家i 一级重点保护野生 动物，被世界自然保护联盟物种生存委员会( i u c n ) 定为濒危( e ) 级，并列 入濒危动植物种国际贸易公约( c i t e s ) 附录i 。化石资料表明，早在九百多万年 前的中新世晚期，现今大熊猫的祖先祖熊猫就已经诞生( f l y n na n dq i ，1 9 8 2 邱占祥，1 9 8 9 ) 。但在历经了几百万年的自然兴衰演化，以及受人类历史漫长发 展岁月的影响，现今的大熊猫已数量稀少，成为了名副其实的“活化石”。大熊 猫由食肉改变为以竹为食，并在形态习性和解剖结构上，既有原始特征，又有不 少适应特殊环境的特点( 胡锦矗，2 0 0 1 ) 。因此，大熊猫这一孑遗的特化食肉目动 物，具有重要的学术研究价值。 第一节大熊猫的形态 大熊猫体长1 2 0 1 8 0 厘米，肩高6 5 7 5 厘米，胸围8 7 8 9 厘米，臀高6 4 6 5 厘米，后足长1 2 2 0 厘米，耳长7 2 1 1 5 厘米，尾长1 1 5 2 0 0 厘米。野生的 大熊猫体重6 0 7 3 千克，最重的可达1 1 0 千克。在人工饲养条件下，大熊猫的体 重8 0 1 2 5 千克。 大熊猫体毛以白色为主，但四肢与肩胛部有连片的黑色毛区，眼区有形似眼 镜的黑斑，耳、鼻端和尾端也皆为黑色( 胡锦矗，2 0 0 1 ) 。 大熊猫的两个亚种在形态上具有明显差异。四川亚种头骨较大而臼齿较小， 头形似熊类动物，胸部毛色为深黑色，9 4 2 的个体腹部为白色，其余个体腹部 毛尖黑色，毛于为白色。秦岭亚种头骨较小而臼齿较大，头形圆似猫科动物，胸 部毛色呈深棕色，9 0 5 的个体腹部为棕色，其余个体腹部毛失棕色，毛干为白 色( w a n ，2 0 0 5 ) 。 浙江大学博士论文 大熊猫主要组织相容性复台体类基因研究 第二节大熊猫的分布 生物的分布范围与气候的变迁息息相关，大熊猫也是如此。第四纪( 包括更 新世和全新世) 气候变化的总趋势是逐渐变冷，但经历强烈的冷、暖气候波动， 冰期与问冰期频繁地交替出现( 曾伯勋，1 9 9 0 ) 。在冰期，大陆冰盖从高纬度地 区向低纬度地区推进，湿热气候向南退缩，喜暖动植物向赤道迁徙。在间冰期， 气候变暖，大陆冰盖向高纬度地区撤退，喜暖动植物侵占高纬度地区( 金建华等， 2 0 0 3 ) 。更新世早期，大熊猫从发源地迁出，分布于华南西部以及华中部分地区， 早更新世早期大熊猫分布的纬度大致在2 4 。2 4 3 l 。n 之间，而东界则达1 0 9 。e ( 重庆巫山) ：早更新世晚期大熊猫分布的最北界达到3 rn ( 陕西洋县) ，东 界达l l o 。l o e ( 吴汝康，1 9 8 9 ) 。 更新世中期，云贵高原和秦岭地区的抬升阻碍了西北干冷的季风，使得云贵、 秦岭东南的广大地区出现湿热气候，该时期也是我国第四纪气候最温暖潮湿的高 温期( 曾伯勋，1 9 9 0 ) 。更新世中晚期大熊猫的分布达到全盛期，广泛分布于我 国长江流域、珠江流域以及华北部分地区( d a v i d ，1 8 6 9 ) ，最北界达4 0 。n ( 周口店 第一化石点) ，向南则延仲至越南、老挝、缅甸部分地区，向东抵达东南沿海地 区。在我国云南、贵州、广西、广东、四川、重庆、江西、福建、浙江、湖南、 湖北、陕西、山西等地均发现有该时期的大熊猫化石。 晚更新世末期，大熊猫的分布范围开始缩小。大理冰期后，气温开始下降， 与大熊猫伴生的喜温动物开始南下，大熊猫也退缩至云南、贵州、广西，而在湖 南、湖北、重庆、浙江等少数地区。至全新世，大熊猫的分布范围进一步缩小， 且分布区之问缺乏连通，生活区域逐渐破碎化( 马安成，1 9 9 2 ：宗冠福，1 9 8 5 ) 。 在距今20 0 0 年前，大熊猫还曾零星地分布在我国河南、湖北、湖南、贵州、 云南5 个省( l uz ，2 0 0 1 ) ，然而，由于人类活动的影响，目前分布仪限于陕西西 南的秦岭南麓，四j i l l 地西北缘的岷山和邛崃山、西缘的大、小相岭及大、小凉 山( 0 b r i e n ，1 9 9 4 ) ，而适于大熊猫生活的地区仅占上述区域的2 0 ，总面积约 60 0 0k d ( 图1 1 ) 。 塑! 茎堂堡主堕苎 一 茎些堂圭兰塑堡塑查竺墨鱼堡! ! 鲞苎里堕壅 图1 1 大熊猫的当前分布区( l uz e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 f i g u r e1 1t h er e s e n td i s t r i b u t i o no fg i a n tp a n d a ( a i l u r o p o d am e l a n o l e u c a ) ( l uz e ta 1 ，2 0 0 1 ) 3 浙江大学博士论文 大熊猫主要组织相容性复合体类基囚研究 第三节大熊猫的栖息地环境 就大地貌而言，大熊猫的栖息地属高山深谷，位于横断山脉东北段的长江上 游各支流在境内谷向南北而后汇总于长江主干，受东南湿润气候影响较大。这样 温暖潮湿的气候条件很适于高山竹类的生长。因此，大熊猫所选择的生境也多为 季风所及的迎风面。在秦岭为南坡；岷山、相岭和凉山基本上是东坡；而邛崃为 东南坡。这些坡面能够形成相对较为稳定的温暖潮湿的微环境，有利于它们的生 存繁衍( 胡锦矗，2 0 0 0 b ) 。 大熊猫以采食竹类植物为主。这些植物多为小径竹，长期处于自生自灭的原 始状态，广泛分布于深山老林中。据研究，可供大熊猫采食的竹种达1 2 属6 0 多种，其中仅箭竹属就有2 0 多种。这些竹种长期生长在高山暗针叶林、山地 暗针叶林、山地针阔叶混交林以及山地常绿阔叶林的林冠下，分布海拔7 0 0 一3 5 0 0 m ( 个别竹种分布海拔达3 8 0 0 m ) 不等。 由于高山深谷的气候有垂直变化，故大熊猫对生境选择还有季节变化。冬季 由于高山竹类的枝叶枯萎凋零，营养价值降低。它们常下移到山下河谷摄食保持 青绿的技叶和竹秆；夏季则上移摄食高山竹类；春夏之交又下移摄食新萌生的竹 笋；夏秋之交上移以高山竹类开始长出的新技叶为食，在凉山等地由于方竹属 ( c h i m o n o b a m b u s ) 的竹类秋季发笋，它们这时也下移择食方竹竹笋。由此可见， 大熊猫对生境的选择，都爱选择竹子营养质量最好的生境，以利生存和繁衍。但 l 扫于各山系的山势和竹类不同，在生境选择中，又出现了某些可塑性，以便更好 地适应所处的具体生态环境( 胡锦矗，2 0 0 0 b ：2 0 0 1 ) 。 第四节大熊猫的分子生物学研究概况 自1 8 6 9 年由法国传教i - d a v i d 将大熊猫定为新种发表后( d a v i d ，1 8 6 9 ) ，科学 家们开始从形态学、地理学、生态学、生物化学、细胞及遗传学、繁殖生物学、 兽医学和应用技术等方面，对其进行了多学科研究。截至2 0 0 1 年的统计，发表的 4 浙江大学博士论文太熊猫主要组织相容性夏台体i l 类基因研究 论文达1 4 5 0 余篇，出版的专著与论文集约3 0 余部( 胡锦矗，2 0 0 3 ) 。为此，作者 将结合本论文的研究内容，就其分子生物学方面的主要研究成果，简要综述如下。 一、分子系统学研究 大熊猫的起源及其分类地位的确定一直是科学家们争论的焦点( 胡锦矗， 2 0 0 0 a ；胡锦蔼e ta 1 ，1 9 9 0 ) 。1 9 6 5 年，z u c k e r k a n d l 和p a u l i n g ( 1 9 6 5 ) 最先 提出将基因型特征用于分类学与系统学研究。 王希成等( 1 9 9 0 ) 利用兔抗大熊猫i g g 免疫扩散和微量免疫电泳的方法，对 大熊猫的分类地位予以确定。结果发现：大熊猫与熊的亲缘关系较近而与小熊猫 较远。h a s h i m o t o 等( 1 9 9 3 ) 通过测定基因表达产物血红蛋白及其氨基酸序 列，分析了大熊猫及其近缘种之间的亲缘关系，其结论与王希成等的研究结果相 一致。 为了更深入地对大熊猫的分类地位予以确认，近年来许多学者逐渐将浚方面 的研究重心，转移到基因图谱与基因序列的分析上来。因为分子标记所提供的遗 传信息相对较多，且分子数据提供的比较尺度，更能有效地表明物种之间的同源 性和差异性( 幽波，1 9 9 9 ) 。通过r d n a 的r f l p s 分析结果表明，在亲缘关系上大熊 猫更接近于熊类，而不是小熊猫( l a ne ta 1 1 9 9 8 ) 。林峰等( 1 9 9 7 ) 用p c r 和 s o u t h e r n b l o t t i n g 杂交法，对包括大熊猫在内的儿种动物r a p d 的产物进行了分 析结果与前面的结论相同。l e d j e 和a m a s o n ( 1 9 9 6 a ；1 9 9 6 b ) 利用线粒体1 2 s r r n a 的全基因序列，重建了食肉目动物的系统发育关系，认为食肉动物在相对较短的 时期内就发生了多歧分化，且大熊猫在亲缘关系上与熊类动物更为接近。| 司年， 两人又根据食肉目犬科动物c y tb 基因的全序列测定结果，推测出食肉类动物的5 个支系 犬科，小熊猫科，鼬超科，熊科( 含大熊猫) 及鳍足目 在相对较短的时间 内，就产生了进化隔离，其遗传距离表明，这种进化分离发生在4 5 0 0 万年以前。 张亚平和r y d e r ( 1 9 9 4 ) 在就熊超科8 个科动物线粒体d n a 的d 一环、c y tb 、1 2 sr r n a 、 t r n a p r o 和t r n a t h r 基因序列及线粒体d n a 的全序列进行分析后，发现大熊猫 与熊科关系较近。虽然也有研究者认为大熊猫与小熊猫的亲缘关系较近( t a n g l e e ta 1 1 9 8 6 ：张亚平e ta 1 ，1 9 9 1 ) ， 但总的来说，g l 前大多数的研究结果支 持将大赣猫列入熊科。 浙江大学博士论文 大熊猫主要组织相容性复合体“类基因研究 二，遗传多样性研究 濒危物种遗传多样性信息的获得，对于制定有效的保护策略，具有重要的意 义( f r a n k h a m ，2 0 0 2 ) 。为此，各种各样的分子标记被用于研究大熊猫的遗传多 样性背景。宿兵等( 1 9 9 4 ) 通过蛋白电泳技术，分析了成都动物园1 2 只大熊猫 的3 6 种血液同功酶及蛋白质的4 0 个遗传座位，认为只有一个座位存在多性态， 并由此得出了大熊猫遗传多样性贫乏的结论。 张亚平等( 1 9 9 7 ) 从4 0 只大熊猫的2 1 个奠基者中，共检出9 利线粒体单倍 型。在这9 种单倍型中，3 1 8 个碱基对的d - l o o p 区序列，仅3 个位点出现了转 换，2 个位点出现缺失或插入，但未检出碱基颠换的存在。大熊猫群体遗传分化 程度。比棕熊、亚洲黑熊、马来熊和北极熊为低。同年，张亚平( 1 9 9 7 ) 等对线 粒体d - l o o p 和t r n a 基因的分析也表明，大熊猫的遗传变异很低。 方盛国等( 1 9 9 7 ) 用d n a 指纹图谱刑大熊猫的遗传多样性进行了研究。他们 发现，五个山系中8 6 只大熊猫的平均等位基因频率为0 2 3 6 2 ，平均杂合率为 7 6 7 4 ，d n a 指纹图的相似系数为0 4 0 0 9 ，其近交程度在家养动物的限值范围 ( o 3 o 7 ) ，因而认为现存大熊猫的遗传多样性极度贫乏。 2 0 0 3 年，方盛国等( 2 0 0 3 ) 又利用指纹图谱对邛崃和凉山地区的大熊猫遗 传多样性进行了分析比较。结果发现大熊猫总体来说遗传多样性低。并且，凉山 地区( 总面积小但未片断化) 大熊猫的遗传多样性相对邛崃地区( 总面积大却发 生了片段化) 来说更低。这说明种群数量和栖息地大小这两个因素中，前者对大 熊猫遗传多样性影响更大。 吕植等( 2 0 0 1 ) 用4 个遗传学指标( 线粒体d n a 限制性片段长度多态性、线粒 体d n a 的控制区序列、d n a 指纹图谱和微卫星d n a 的多样性) ，对岷山、邛崃及秦岭 山系的大熊猫进行遗传多样性的研究，并与印度豹( a c j n o n y x j u b a t u s ) 、北美洲 豹( p u z f l e tc o n c o o r ) 等猫科动物比较后认为：大熊猫的遗传多样性处于中等水平。 她的结论之所以与其他研究者有差别，主要是由于比较时的不同参考动物和依据 标准有关。 6 浙江大学博士论文 大熊猫主要纽织相容性复合体1 1 类基因研究 三，大熊猫的亲子鉴定和个体识别技术 大熊猫在圈养条件下多采用人工授精的方法和多雄配一雌的方式进行繁殖。 这种繁殖方式虽然可以大大提高大熊猫的受孕率，但同时带来了亲子关系不清和 谱系难以确定的问题。很多研究者利用遗传标记来解决这个问题。遗传标记是指 任何一种简单的遗传特性，可用于追踪染色体上某一节段或某一基因在家系中的 传递。它在个体问的表现不同，通过这种差别可在一个家系中进行追踪( 王亚馥 等， 2 0 0 0 ) 。最初，0 b r e i n ( 1 9 8 4 ) 用血液、皮肤为材料，分析2 9 种同功酶的 迁移距离，鉴定了二雄配一雌所生子的亲子关系，但方法繁琐、材料受限。在 许多大熊猫亲子鉴定研究中都运用了微卫星位点。绝大多数的微卫星座位严格遵 循孟德尔遗传方式，根据这种规律可以对大熊猫个体进行亲子鉴定，并建立个体 问的谱系关系。张亚平等( 1 9 9 4 ：1 9 9 5 ) 和方盛国等( 1 9 9 4 ) 分别利用p c r 技术对 从毛发中获得的大熊猫微卫星位点进行了扩增分析。但此方法只能进行排除分 析，不能进行认定。同时，三雄或三雄以上个体配一雌的配种方式极难进行父权 认定。 方盛国( 1 9 9 4 ) 首次应用d n a 指纹技术进行大熊猫亲子鉴定，取得了理想的 结果。此方法准确、灵敏、稳定、重复性好，具有很高的个体鉴别能力。这一方 法的熟练应用及推广将有助于避免圈养条件下大熊猫的近亲繁殖。因为繁育系统 不仅影响种群的遗传结构，而