（微生物学专业论文）适冷海洋细菌pseudoalteromonas+spmb1内切葡聚糖酶基因的克隆和表达.pdf

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重堡生登塑堕丝宝! ! 垡丝! ! 竺竺兰坐兰墨堡坚! 二! 由塑蔓塞堕堕薹旦堕重壁塑要茎i _ 一 c l o n i n ga n de x p r e s s i o no fe n d o g l u c a n a s e o fm a r i n ec o l d - a d a p t e d b a c t e r i ap s e u d o a l e r o 秘o n a ss p m b 一1 a b s t r a c t m a r i n ec o l d a d a p t e dm i c r o b e sw h i c hh a v e1 i v e du pw i t ht h ec o o le n v i r o n m e n t a f t e rl o n ga d a p t i o na r ew i t hs p e c i f i ci n h e r i ta n dm e t a b o l i t e s o m ee n z y m e sf r o m t h e s em i c r o b e sa r en o v e li ns t r u c t u r e sa n df u n c t i o n sc o m p a r e dt ot h o s ef r o m t e r r e s t r i a lb e i n g s m e t a b o l i t e sp r o d u c e db yd o m i n a n tm a r i n eb a c t e r i aa r et h e m o s ta b u n d a n t t h ee n z y m e st h e yp r o d u c ea r ec h a r a c t e r i s t i co fh e a t s e n s i t i v i t y a n dl o wc a t a l y z i n gt e m p e r a t u r e t h e s ee n z y m e sa r ec a l l e dc o l d a d a p t e de n z y m e s f o rt h e i ro p t i m u mc a t a l y z i n gt e m p e r a t u r ei sa b o u t3 0 a n dt h e r ea r es t i l lh i g h p r o p o r t i o no fe n z y m ee a p a b i l i t yw h e nc a t a l y z e da to c 一4 c e l l u c a s eh a sb e e nw i d e l yu s e di nv i n t a g e ，f e e d s t u f f ，a n df o o di n d u s t r y t h er e s e a r c ho nc o l d a d a p t e dc e l l u c a s ef r o mm a r i n eb a c t e r i ai so fs i g n i f i c a n c e i n t h e o r ya n do fv a l u ei np r a c t i c a lp r o d u c t i o n t h eg r a mn e g a t i v er o db a c t e r i am b 一1u s e di nt h i se x p e r i m e n tw a ss c r e e n e d f r o mm u do ft h eb o t t o mo fh u a n g h a ia n di t so p t i m u mg r o w t ht e m p e r a t u r ew a sa t 2 0 。ca n dt h eh i g h e s tg r o w t ht e m p e r a t u r ew a sa b o u t4 0 。c i tc a ns t i l lg r o we v e n a to 。c s oi tw a so n et y p i c a lc o l d a d a p t e db a c t e r i a t h e b 1 4 - e n d o g l u c a n a s e e x c r e t e db ym b lb e l o n g e dt oc o l d a d a p t e de n z y m e sf o rt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e w a sa t3 5 。c ：i t b e l o n g e dt oa c i d i ce n z y m e sf o rt h eo p t i m u mp hw a sa b o u t6 0 1 6 sr d n ao fb a c t e r i ai sc h a r a c t e r i s t i co ft h ec o n s e r v a t i v es e q u e n c eo nt h e t w oe n d sa n dv a r i a n ts e q u e n c ei nt h em i d d l e i ti sau s e f u lm e t h o dt oi d e n t i f y b a c t e r i aa c c o r d i n gt ov a r i a n ts e q u e n c e a c c o r d i n gt ot h es e q u e n c eo f1 6 sr d n a ， t h eb a c t e r i u mw es c r e e n e dw a si d e n t i f i e da so n e s p e c i e so fp s e u d o a t e r o m o n a s a n dw a sn a m e da sp s e u d o a l t e r o m o n a ss p m b 一1 p h y l o g e n e t i ct r e eo ft h e1 6 sr d n a 5 些查盔堂亟主堂堡丝皇! 重堡垒登塑萱生! ! j 丝! ! ! 翌竺塑15 巳婴：! 直塑堕壅焦堕茎旦盟塞堕塑垂垄一 s e q u e n c e sw a sc o n s t r u c t e d p s e u d o a l t o r o m o n a s w a si s o l a t e df r o ma l t e r o m o n a si n 1 9 9 5 s ol i t t l er e s e a r c hh a db e e nd o n ea b o u ti t i ti sm e a n i n g f u lt op a y a t t e n t i o n t op s e u d o a l t o f o m o n a ss p m b 一1 t h eg e n ec o l ae n c o d i n gb 一1 ，4 一e n d o g l u c a n a s ew a sc l o n e db yp c ra n dt h er e s u l t i n d i c a t e dt h a tt h ew h o l el e n g t hw a s1 4 7 9 b pw h i c he n c o d e d4 9 2a m i n oa c i d s t h e f i g u r eo f3 ds t r u c t u r eo ft h ec e l aw a sc o n s t r u c t e db ys w i s s m o d e ，a na u t o m a t e d h o m o l o g ym o d e l i n gs e r v e r t h eh o m o l o g ya n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tt h ep r o t e i n s e q u e n c ef r o m1 t o2 7w a ss i g n a lp e p t i d e ，t h ep r o t e i ns e q u e n c ef r o m2 8t o3 2 8 w a sc a t a l y t i cd o m a i n ，t h ep r o t e i ns e q u e n c ef r o m3 2 9t o4 2 7w a s1 i n k e ra n dt h e p r o t e i ns e q u e n c ef r o m4 2 8t o4 9 2w a sc a r b o h y d r a t e b i n d i n gm o d u l e 国埘w a s j o i n t e dt op g e x 4 t 1 t oc o n s t r u c t e x p r e s s i o np l a s m i dp g e x c e l h w h i c hw a s e x p r e s s e d i nec o h b l 2 1 a f t e rc u l t u r e da t3 7 a n di n d u c e da t1 8 t h e e x p r e s s i o no fc o l a w a sd o n es u c c e s s f u l l y a n a l y s i st ot h es u p e r n a t a n to f 叵 c o l is o n i c a t er e v e a l e dt h a tt h es o l u b l ef u s i o ne n z y m e g s t c e l a ，w a sa b o u t4 o ft h et o t a ls o l u b l ep r o t e i no f c o l i c e l l sa n dt h ec o n c e n t r a t i o no fg s t c e l a w a sa b o u t0 5 7 2 m g m 1 c o m p a r e dt ot h en a t i v e b i ，4 - e n d o g l u c a n a s e t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r eo ff u s i o ne n z y m e ，g s t c e l h ，w a ss t i l la t3 5 。cw h i c hb e l o n g e dt o c o l d a d a p t e de n z y m e s ：t h eo p t i m u mp ho fg s t c e l ai n c r e a s e df r o mp h6 0t op h 7 2a n dt u r n e di n t on e u t r a le n z y m e s ，a l s o ，g s t c e l aw a sm o r ee n d u r a b l e t oc h a n g e o fa c i da n da l k a l i t h a nt h en a t i v ee n z y m e s ow ec a n s a yt h a tf u s i o ne n z y m e ， g s t c e l a ，h a sm o r ea d v a n t a g e so fp o t e n t i a l a p p l i c a t i o n t h er e s u l tw eg o tl a i ds o l i db a s ef o rt h ef u r t h e rr e s e a r c ho nc o l d a d a p t e d e n z y m e sf r o mp s o u d o a t o r o m o n a ss p n 3 1a n d p r o v i d e dv a l u a b l ef i g u r e sf o r r e s e a r c ho nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns t r u c t u r ea n df u n c t i o n o fc o l d a d a t p e d e n z y m e s ，a n dh e l p e dt o c l a r i f y t h e c a t a l y t i c m e c h a n i s mo f c o l d a d a p t e d c e l 】u c a s e k e y w o r d ：m a r i n eb a c t e r i a ，p s e u d o a l t e r o m o n a & c o l d a d a p e de n z y m e s ，0 一i ，4 e n d o g l u c a n a s e ，1 6 sr d n a ，g e n ee x p r e s s i o n 6 第一章绪论 海洋占地球表面积的7 0 以上，海水占了地球总水量的9 0 ，海洋中有丰富的生物 种类，其数目尚难确定。早期观点认为，海洋环境难以形成数量大的生物物种多样性， 原估计海洋约有物种2 0 万种，但是随着近代技术的进步，人们获得的海洋生物种类出 乎意料的多，目前认为海洋物种数量可能比原估计量至少多一个数量级，并且有人认为 海洋生物多样性的丰富程度应与陆地热带雨林接近，而后者被认为是地球上物种最丰富 的地方。 如果说人类对陆地资源的开发已经过度的话，那么海洋对于人类，依然有很多方面 是神秘的。过去记录和利用的海洋生物绝大多数为容易发现和获得的生物，也就是比较 大型的动物、植物，而对于个体微小的生物微生物，则相对研究较少。作为地球生 态系统的一环，微生物与动、植物同等重要，在物质转化和元素循环中，有些角色只有 微生物才可以担当。但是，目前的实际情况却是对微生物的开发利用非常少，一般认为 目前能被培养、分离和鉴定的微生物种类仅占自然存在量的5 ，而海洋中则仅有1 左 右的微生物被分离鉴定“。因此，海洋微生物基本上是一块未开垦的处女地，很值得科 学工作者去好好的开发利用。同时海洋微生物由于其特殊的生态环境( 低温、高压、厌 氧等) 使其具有一些不同于陆地微生物的特点，例如适冷、嗜盐、耐压等，其中适冷是 目前研究较多的一个方向。 1 1 适冷微生物及其适冷机制 1 1 1 适冷微生物的定义 海洋微生物大多数为适冷微生物( c o l da d a p t e dm i c r o o r g a n i s r a ) ，也称为低温微 生物。最早的适冷微生物是由f o r s t e r 发现的，他于1 8 8 7 年报道了在冷冻保存的鱼中 分离到能在0 生长的细菌，随后陆续又有大量的低温微生物被分离并研究。1 9 0 2 年 s c h m i d t n i e l s o 首先将能在o 下生长的微生物命名为嗜冷微生物( p s y c h r o p h i l e s ) 。 些查盔堂堡主堂笪堡塞! 重堡塞鲎塑堕坐! 些丝! 塑竺竺竺丝翌：坚旦二! 堕塑蔓鏊蕉堕茎垦盟塞堡型奏垄一 以后，i n g r a h a m 和s t o k e s ( 1 9 5 9 年) ，s t o k e s ( 1 9 6 3 年) 给出了一个更为准确的定义，他 们将在一周或两周内在o 下能够生长出肉眼可见的菌落的微生物称为嗜冷微生物，并 区分为专性嗜冷微生物( o b l i g a t ep s y c h r o p h i l e s ) 和兼性嗜冷微生物( f a c u l t a t i v e d s v c h r o p h i l e s ) 。专性嗜冷微生物是指最适生长温度低于2 0 c 的微生物，而兼性嗜冷 微生物是指最适生长温度高于2 0 的微生物。由于这个定义中，兼性嗜冷微生物并没 有嗜低温的特征，与中温微生物难以区别，因此，m o r i t a 于1 9 7 5 年重新给出了一个适 冷微生物的定义“。他将适冷微生物分成两大类：嗜冷微生物( p s y e h r o p h i l e ) 和耐冷 微生物( p s y c h r o t r o p h s ) 。嗜冷微生物是指最适生长温度不高于1 5 ( 2 ，最高生长温度不 高于2 0 的微生物；耐冷微生物是指在0 下能够生长繁殖，最适生长温度为2 0 2 5 的微生物。耐冷微生物又被区分为狭义和广义两种，狭义耐冷微生物的最高生长温度不 超过4 0 。c ，而广义的耐冷微生物最高生长温度不低于4 0 。现在m o r i t a 对适冷微生物 的定义已被广泛采用。 1 1 2 适冷微生物的适冷机制 适冷微生物在长期的进化过程中，已经形成了特殊的结构和代谢机制来适应生存的 低温环境。 1 1 2 1 适冷微生物的结构特征 目前对适冷微生物适冷结构研究最多的是其膜的结构。研究表明适冷菌的膜脂中不 饱和脂肪酸的含量较高，由于不饱和脂肪酸含量的增多，导致膜脂的熔点降低，因此， 适冷菌的膜脂在低温下可以保持液晶态，具有很强的流动性，这对适冷菌在低温下的生 存非常重要。另外，适冷菌在低温下不仅膜脂含量高，而且膜的面积增大，这可以使适 冷菌吸收更多的营养。增加膜中不饱和脂肪酸含量从而改变膜的结构是微生物适应低温 的策略之一，它已经被许多实验证实。例如将ec o l i 或s a l m o n e l l a 突变体培养在含不 饱和脂肪酸的培养基中可导致这些菌的最低生长温度降低，增加其适冷性。c a n i l l a c 等将中温的，耐冷的，嗜冷的三株a r t h r o b a e t e r 菌株分别培养在低于其最适生长温度 的温度下，结果三株菌膜脂中不饱和脂肪酸的含量都增多。将培养在3 2 。c ( 最适生长 温度) 下处于对数生长中期的中温菌a g o b i b r m i s 转到2 。c t 培养，菌株立即停止生 坐查盔堂堡土堂焦丝皇! 重堡塑堂塑重= 竺! ! ! 堡丝! ! 竺竺兰翌：坚! ：! 由塑蔓塞塑堕苎旦堕堕堡塑耋垄二一 长，直到其膜中不饱和脂肪酸的含量升高到其生长在1 9 2 0 下的水平时，才继续生长。 由此可见，在低温下如果膜中不饱和脂肪酸含量低，膜的流动性降低，细菌将难以吸收 环境中的营养，从而影响其生长。细菌膜中不饱和脂肪酸是由不饱和脂肪酸合成酶合成 的，对嗜冷菌如b a c i l l u s , l i s t c r i a , p s e u d o m o n a s , b r e v i b a c t e r i u m 和嗜冷酵母的研究 表明，低温能诱导不饱和脂肪酸合成酶的合成，高温则使适冷菌失去合成此酶的能力并 导致酶失活，因此适冷菌在高温下难以保持膜中不饱和脂肪酸的含量，这可能是适冷菌 不耐高温的原因之一。 除了对适冷菌膜的结构研究较多之外，对适冷菌所产的适冷酶的结构也有较为详细 的研究，通过对适冷n 一淀粉酶，枯草杆菌蛋白酶，8 一内酰胺酶，磷酸酶等结构的研 究表明，适冷酶在低温下较同类的中温酶和高温酶具有更高的柔性。在适冷酶的结构中， 盐桥的数量减少，疏水核内芳香环的相互作用减弱，脯氨酸与精氨酸残基数量减少，酶 的疏水性减弱，亲水性增强，从而使酶与溶剂的相互作用增强。这些结构的改变都有利 于酶分子柔性的增加。已获得结晶的适冷酶有n 一淀粉酶和丝氨酸蛋白酶等，通过对其 结构的研究表明，酶的催化部位较为保守。r e n t i e r 等( 1 9 9 3 ) 比较了嗜冷菌与嗜热菌 的丙糖磷酸异构酶基因，发现虽然整个酶的d n a 同源性只有3 4 ，但这两个酶的活性区 域非常保守。“。t r i m b u r ( 1 9 9 4 ) 的研究发现，适冷节杆菌产生的b 一半乳糖苷酶与叵c o l i 的l a c z 酶虽然只有1 9 的同源性，但它们的亲核和酸性氨基酸的区域包括推测的位于 活性中心的氨基酸残基却是非常保守的”。除了活性部位保守之外，适冷酶的其他结构 特征却有利于提高酶分子的柔性，例如d a v a i l 等的研究表明枯草芽孢杆菌素$ 4 1 与同 类中温酶相比，虽然只有底物结合部位的两个氨基酸残基被取代，但是却明显减少了活 性部位入口的空间位阻，使酶分子变得更具柔性，降低了催化过程中构象改变所消耗的 能量；在$ 4 1 中，盐桥与芳香族相互作用的减少也使酶分子柔性增加，$ 4 1 酶分子表面 有四个长链的氨基酸以及大量的极性氨基酸残基，主要为天冬氨酸，它们使酶分子表面 的长度与极性增加，从而增强酶分子与溶剂的相互作用，使酶更具柔性，同时降低了酶 分子的紧密度和稳定性”。适冷酶的这种柔性结构使酶在低温下具有更高的催化效率， 是适冷菌适应低温的另一条重要途径。 毫无疑问，适冷菌能够在低温下下常生长，除了有适应低温的膜结构和酶结构之外， 肯定还有其他不同于中温或高温微生物的适低温结构，由于研究较少，在此不作详细讨 论。 些查查堂塑主堂垡焦皇! 重堡塑登塑堕生兰鱼丝! ：曼- 旦竺竺丝望些二! 由塑萱鐾蕉堕苎璺盟重壁塑垂垄一 1 1 2 2 适冷微生物的适冷代谢机制 适冷微生物能够适应低温的特殊生态环境，除了有适应低温的特殊结构之外， 更 重要的是有适应低温的各种代谢机制，从而保证其在低温下能够正常生长。 a 保持膜对胞外营养物质的正常运转吸收 中温微生物在低于5 时一般就不能吸收代谢外源物质而只能代谢内源物质，这可 能是限制其在低温下生长的重要原因之一，而适冷微生物由于其膜在o c 甚至o 以下 仍具有流动性，因此它们在低温下仍然可以吸收胞外营养物质，进行生长代谢活动。 m o r t o n 等( 1 9 7 8 ) 研究了嗜冷、中温和嗜热的t o r u l o p s i s 属酵母对胞外葡萄糖的运转 能力，发现只有嗜冷酵母能够在2 c 的低温下运转葡萄糖。1 。h e r b e r t 等( 1 9 9 2 ) 研究 比较了嗜冷的弧菌和耐冷的假单胞菌在不同温度下对葡萄糖和乳糖的吸收速度，发现嗜 冷弧菌吸收利用葡萄糖和乳糖在o 时最快，在1 5 2 0 c 时降低；而耐冷假单胞菌在2 0 时吸收葡萄糖和乳糖最快。由此可见，嗜冷微生物适应温度越低，在低温下膜运转和吸 收营养物质的能力越强。适冷微生物的这种能够在低温下保持膜对胞外营养物质运转 吸收的能力，为其在低温下正常生长提供了物质基础。 b 保持酶在低温下的高催化活性 由于适冷微生物产生的适冷酶的结构更具柔性，利用较少的能量就可发生构象转 变，因而这些适冷酶在低温下就具有较高的催化效率。例如f i b r o b a c t e rs u c c f n o g e n e s 产生的适冷葡聚糖酶的最适反应温度为2 5 。c ，在0 时具有最高活性的7 0 ；而同类中 温酶的最适反应温度为3 5 。c ，在o c 时则只有最高活性的1 8 “。从海洋鱼类中分离的 p s e u d o m o n a ss p p l 一4 产生的适冷蛋白酶最适催化温度为2 5 。c ，在o c 时具有最高活力 的1 5 ，而中温蛋白酶的最适催化温度一般为5 0 一6 0 。c ，在o c 下只具有不到1 的最高酶 活力”。适冷酶在低温下的高催化效率反映了它们对低温环境的适应，提高酶在低温下 的催化效率也是适冷微生物适应低温环境的途径之一。 l o 些查盔堂堡主堂焦垫兰i 重堡塞鲎塑垫生! 兰鱼丝! ! 竺竺业兰耋生坚璺：! 由塑塑鐾焦堕董旦堕重璧塑墨垄一 c 加快蛋白质降解，提高生长速率 嗜冷菌的最适生长温度低于1 6 。c ，耐冷菌的最适生长温度一般也在2 0 左右，因 此适冷菌在低温下具有很高的生长速率。研究发现，随着温度的降低，适冷菌的生长速 率降低的比中温菌慢，即适冷菌的温度系数q i o 小于中温菌的q i o ，这表明适冷菌可以 在低温下保持较高的生长速率u 。还有一些研究表明，耐冷菌的蛋白质降解速率比中 温菌要快的多m 1 1 2 1 1 。在海洋，冰川等寡营养的条件下，加快蛋白质降解可以迅速为 蛋白质的合成提供氨基酸，从而提高适冷菌的生存能力。 d 产生冷激蛋白( c s p ) m a yb a r b a r a 等的研究发现当生长温度突然降低时，无论是适冷微生物还是中温微 生物都会被诱导产生冷激蛋白1 “。例如将嗜冷酵母f r i c h o s p o r o np u - 以a ，7 s 的生长温 度从2 1 突然降为5 ，它在1 2 小时内就诱导合成了2 6 种冷激蛋白1 。这些冷激蛋 白可能在适冷微生物对低温的生理适应过程中发挥着重要的作用，但是目前对其具体作 用机制还不清楚。 1 2 海洋细菌适冷酶研究进展 海洋蕴藏着极其丰富的生物资源，但是由于它的极端环境，限制了科学工作者对它 的开发研究，因此，早期的生物研究主要集中在陆地生物上。到了2 0 世纪中期，科技 获得了突飞猛进的发展，各种先进工具的使用，为海洋生物资源的丌发提供了便利条件， 生物技术尤其是分子生物学的发展更是为海洋生物资源的开发提供了有力的工具。 海洋微生物中细菌的种类非常多，凡是在陆地上发现的细菌，在海洋中均有其代表 存在，它们分布于至少6 7 个属中，主要有弧菌属( g i b r o ) ，假单胞菌属( p s e u d o m o n a 占) ， 发光菌属( p h o o b a c t e r f u t o ) ，气单胞菌属( a e r o m o n a s ) ，邻单胞菌属( p l e s i o n m o n a 占) 芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) ，不动杆菌属( a c i n e t o b a c t e r ) ，交替单胞菌属( a t e r o m o n a s ) ， 交替假单胞菌属( p s e u d o a t e r o m o n a s ) 等。据推测，目前被描述的海洋细菌只占其总 量( 1 0 0 万一2 亿种) 的1 ，由此可见，海洋细菌的开发潜力是非常巨大的m 。海洋细 出查查堂堡土兰焦堡皇! 重整鲞鲎塑堕坐! ! ! 鱼竺! ! 望丝竺丝墨巳些：! 塑塑笪窭堕堕墨垦堂堕塑墅堕墅量一 菌可以产生多种生物活性物质，例如抗生素，抗病毒和抗肿瘤化合物，毒素，酶等。下 面主要介绍一下海洋适冷酶的情况。 1 2 1 适冷酶的定义 酶在生物体内催化各种代谢途径中的生化反应，对生物的繁殖至关重要。酶的催化 活性明显的受温度的影响，任何酶都有最适催化温度，一般的，根据温度对酶活及稳定 性的影响，将酶分为适冷酶( c o l d a d a p t e de n z y m e s ) 、中温酶( m e s o p h i l i ce n z y m e s ) 和高温酶( t h e o m o p h i l i ce n z y m e s ) 三种。适冷酶一般是指最适催化温度为3 0 ( 2 左右， 比同类的中温酶和高温酶的最适催化温度明显的低，在0 甚至0 以下仍具有较高的 催化效率的一类酶“。通过结构分析及预测，发现适冷酶的活性中心并无特殊结构， 而与中温酶的活性中心有极强的保守性。研究表明，适冷酶的低温高催化活性与酶蛋白 的整体结构有关：适冷酶在低温下的高活性可能是由蛋白结构的柔性以及酶活性中心附 近的基团修饰引起的。酶蛋白内部功能域之间相互作用较少而与溶剂分子之间的作用增 强，从而形成较伸展的分子结构，使酶的活性中心更容易与底物接近，因而可在低耗能 的情况下发挥作用”。 1 2 2 海洋细菌适冷酶开发现状 适冷酶除了很少一部分是由中温酶突变而来，绝大部分是由生活在低温环境中的 适冷生物产生的。深海海洋细菌所产的酶大部分都是适冷酶，目前从海洋细菌中 纯化到的适冷酶主要有琼脂糖酶( a g a r a s e ) ，几丁质酶( c h i t i n a s e ) ，纤维素酶 ( c e l l u l a s e ) ，淀粉酶( a m y l a s e ) ，蛋自酶( p r o t e a s e ) ，甘露聚糖酶( m a n n a n a s e ) ，过氧 化物酶( m p o ) ，超氧化物歧化酶( s o d ) 等“。由于适冷酶的最适反应温度在3 0 。c 左右， 比中温酶要低2 0 。c 左右，因此可以在一些低温环境下应用，在实际生活中使用低温酶 是一条很有效的节省能源的途径“”。例如目前我们所使用的很多洗衣粉，为了达到更 好的去污效果，都添加了蛋白酶，但是现在添加的一般都是中温的碱性蛋白酶，最适酶 反应温度在5 0 。c 以上，因此要想达到最佳效果，洗涤用水的温度就要在5 0 6 0 。c ，而自 来水的温度一般在3 0 以下，所以洗涤时要用加热的水才能达到最好的效果，这在同 1 2 坐查盔堂堡主堂生堡塞! 鋈堡鲞鲎堡堕生! 竺鱼丝! ! 竺呈竺竺兰翌：坚生l 堕塑塑星堕堕苎旦堕重壁塑室垄一 常生活中很不方便而且消耗能量。但是如果洗衣粉中添加的是最适酶反应温度在3 0 。c 左右的适冷蛋白酶，则直接用自来水来洗涤就可以达到最佳效果，因此这些低温酶在生 产上有着巨大的潜在的应用价值。 当今一些先进国家如美国、i 二| 本等为了更好的利用适冷海洋微生物，开发海洋生物 资源，已经开始实施“海洋生物基因组计划”，以期获得有价值的遗传信息，尤其日本 在海洋微生物方面开展的工作非常多，取得了很大的成绩。我们国家也意识到了海洋生 物资源的开发的重要性，并把海洋生物技术列入了“8 6 3 ”计划中，并且以后在这一方 面的投资也一定会越来越多。 1 3 交替假单胞菌的研究现状 交替假单胞菌属( p s e u d o a t e r o m o n a s ) 是1 9 9 5 年从交替单胞菌属( a i t e r o m o n a s ) 中 分离出来的一个新属，主要是根据1 6 sr d n a 序列的特点来划分的。已知的交替假单胞 菌都是从水中分离到的，它的一个显著特点就是适冷1 。目前对交替假单胞菌的研究主 要集中在各种酶的纯化及基因的克隆上，还有一些生物活性物质的提取。 1 3 1 酶的纯化 从报道的文献来看，研究人员已经从交替假单胞菌中纯化到了多种酶类。 v e r a ，a l v a r e z 等( 1 9 9 8 ) 从p s e u d o a t e r o m o n a sa n t a r c t i c an 一1 中纯化了琼脂糖酶 “；b a k u n i n a ，s o v a 等从p s e u d o a l p m 月a s k m 7 0 1 中纯化到了d 一半乳糖苷酶“； 陈秀兰等( 2 0 0 2 ) 报道从p s e u d o a t e r o m o n a ss p s m 9 9 1 3 中得到一种低温蛋白酶 m c p 0 1 “1 ；另外还得到了1 3 一半乳糖菅酶，d n a 连接酶等2 5 3 2 “，这些酶一般来说都是低 温酶，最适反应温度比较低，大约在3 0 左右。 1 3 2 酶基因的克隆 对海洋细菌基因的研究具有非常重要的理论和应用价值，一方面可以了解海洋细菌 对环境的适应性机理( 尤其是海洋极端环境，包括嗜冷，嗜热，厌氧，嗜压等细菌的适 应机制) 、海洋细菌代谢调控( 包括一些海产养殖的致病菌的致病机制) 、特定生理类群 1 3 当查盔堂堡主堂垡婆塞! 适堡堂鲎垫壁丝! 竺璺丝! ! 竺璺婴婴兰里坚! ：! 由塑蔓鐾煎鳗垂堕! 鲤至堕塑奏垄 细菌的多样性及其系统进化关系田1 ；另一方面，由于具有丰富代谢产物的海洋细菌往 往菌体生长慢，产物量低，对菌体的培养还需要特殊设备( 如对海水腐蚀的耐受性，对 温度控制的要求) 等，极大的限制了对其产物的利用幢，因此将具有应用前景的海洋 细菌功能基因进行克隆和表达，将加速海洋细菌资源的产业化进程。 愚e u 面a r e ，d a s 所产的酶大部分是适冷酶，在生产上具有潜在的应用价值，但 是由于原始菌株生长慢，酶得率低，要想获得大量的酶产品，就必须使其在常温易培养 的条件下高效表达，将这些适冷酶基因在生长快的大肠杆菌中进行高效表达可能是一条 很好的途径；同时为了从分子水平解释适冷酶的适冷机理也要求我们必须克隆到大量的 酶基因。目前已经从p s e u d o a l t e r o l l l o n s s 中得到了一些基因序列，b i r o l o ，t u t i n o 等 ( 2 0 0 0 ) 从p s e u d o a j t e r o m o n a sh a l o p l a n k t f s t a c l 2 5 中克隆到了天冬氨酸转氨酶基因 “；h o y o u x ，j e n n e s 等( 2 0 0 1 ) 从p s e u d o a r e t o l l l o d s sh 日l o p l a n k t i st a e 7 9 中克隆了 0 一半乳糖苷酶基因。：s a w a b e ，t a k a h a s h i 等( 2 0 0 1 ) 从p s e u d o a t e r o m o n a se l y a k o v j i i a m 1 4 5 9 4 中克隆了海藻胶裂解酶基因”“；l e e ，k a t o 等( 2 0 0 2 ) 报道从 p s e u d o a t e r o m o n a # s p a 2 8 中克隆了金属蛋白酶基因”“。这些基因的大量获得，为深 入开展低温酶的分子生物学研究提供了很好的实验材料。 1 3 3 生物活性物质的开发 交替假单胞菌大多生活在深海中，生存环境非常独特，代谢产物也非常独特，因此 很可能从这些代谢产物里分离到一些独特有效的抗菌、抗癌、抗肿瘤等生物活性物质。 目前已经报道的有：n a k a y a m a ，h a y a s h i 等( 1 9 9 9 ) 从p s e u d o a t e ，o m o n a ss p f - 4 2 0 中分离到了一种可以通过阻断细菌呼吸链而抑菌的生物活性物质 k o r o r m i c i n “：k a n o h ，k a m i n o 等( 2 0 0 3 ) 从p s e u d o a l t e r o m o n a ss p k p 2 0 4 中分离到 了p s e u d o a l t e r o b a c t i n a 和b “； i s n a n s e t y o ，k a m e i 等( 2 0 0 3 ) 报道从 p s e u d o a l t e r o x o n a ss p o - b c 3 0 ( t ) 中分离到一种新的抗生素物质m c 2 1 a ，它对具有二 甲氧基苄青霉素抗性的s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sn n 口。这些实验结果表明 确实可以从交替假单胞菌中分离到一些独特的生物活性物质，遗憾的是目前这方面的工 作开展的还不多，相信以后它会成为一个研究的热点的。 1 4 1 4 内切葡聚糖酶的研究 纤维素酶是研究最早的酶之一，自1 9 0 6 年s e i l l i e r e 首先在蜗牛消化液中发现了 能降解天然纤维素的纤维索酶后，就在全世界掀起了一股研究纤维素酶的热潮。研究表 明纤维素酶通常是由多种酶组成一个纤维素酶系，共同作用于底物纤维素。要想将天然 纤维素分子完全降解为葡萄糖至少需要三类酶的协同作用，即内切b i ，4 - 葡聚糖酶 ( e g ) ，外切葡聚糖纤维二糖水解酶( c b h ) 和b 一葡萄糖苷酶( e c ) 。一般认为e g 作用 于无定形区，可随机的水解磷酸膨胀纤维素，羧甲基纤维素等无定形纤维素，释放纤维 寡糖：c b h 主要作用