（法医学专业论文）gcms法测定生物样品中有毒阴离子的研究.pdf

目录 f | i i it ii it ii i ii iiii iiii l y 18 9 3 3 5 6 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要4 二、英文缩略语7 三、论文 论文一 前言8刚舌g 材料与方法1 0 实验结果1 3 讨论2 0 论文二 前言0 0 0 0 00 3 2 刖舌 j 2 材料与方法3 4 实验结果3 7 讨论o o ooooo oo ooo odo oooodoogooo 4 9 结论0 000 0 00o o bo 5 9 四、本研究创新性的自我评价6 1 五、参考文献6 2 六、附录 综述一6 6 综述二7 3 在学期间科研成绩8 2 致谢j ? 8 3 个人简历8 4 中文论著摘要 g c m s 法测定生物样品中有毒阴离子的研究 目的 由于氰化物和亚硝酸盐具有广泛存在性和剧毒性，它们一直是我国中毒案件 中常见的毒物。氰化物和亚硝酸盐的毒性主要由其分子在机体内释放出的无机阴 离子刈一和n 0 2 - 所引起，故其毒性强弱也主要取决于释出阴离子的含量。因此 快速准确地检测生物样品中游离的c n 一和n 0 2 一，在毒物分析以及临床医学研究中 具有重要的实际应用价值。测定c n 一和n 0 2 一的方法有分光光度法、电化学法和色 谱法。其中，气相色谱质谱法( g c m s ) 综合了气相色谱和质谱的优点，具有灵 敏度高、分析速度快和鉴别能力强的特点，可完成复杂生物样品中痕量组分的定 性和定量分析，在生物样品分析中占有重要地位。但由于c n 一和n 0 2 一离子系水溶 性无机阴离子，其强极性、水溶性和无挥发性限制了气相色谱质谱在测定生物样 品中c n 一和n 0 2 一离子的应用。本实验的目的就是探索通过对生物样品进行一系列 的前处理，对无机阴离子进行浓缩富集，使其转换成极性小、挥发性强的物质， 进行气相色谱质谱分析，实现生物样品中无机阴离子的快速、准确分析。 方法 l 、g c m s 法测定血浆和尿中c n 一的含量。在0 5 m l 血浆或尿中，加入o 5 m l 硼砂缓冲溶液( p h - - 1 0 ) ，加入5 9 l ，0 1 9 9 p l 以( 共计0 5 1 t g ) 三溴苯( 内标) ； 向上述溶液中加入苯甲醛，涡旋振荡3 0 s 后，静置5 m i n ；在1 5 c m ( 高) x 1 0 c m ( 内径) 的玻璃层析柱底端填入少许脱脂棉，然后填入1 5 9 硅藻土；将上述溶液 转移至硅藻土柱中，静置1 0 m i n ；用混合溶液( 5 m l 正己烷+ 2 0 9 l h f b c 1 ) 洗脱， 同时完成第二步衍生化；将脱出液置于通风橱内，n 2 下浓缩至近干，吸取1 1 t l 于 o c m s 分析。 2 、g c m s 法测定血浆和尿中n 0 2 一的含量。在0 5 m l 血浆或尿中，加入l m l 磷酸缓冲溶液( p h - - 3 ) ，分别加入衍生化试剂2 ，3 d a n 溶液和1 ，8 d a n 溶液2 0 此， 密封，涡旋震荡3 0 秒，于6 0 水浴中加热1 0 m i n ，冷却后，加入内标s k f 5 2 5 a ( 0 1 m g m l 。1 ) 5 i l ；缓慢加入0 5 9 碳酸铵至上述溶液中，调p h 至8 5 ，涡旋振 荡3 0 s ，直至c 0 2 完全释放；向上述溶液中加入2 m l 乙酸乙酯萃取，震荡l m i n ， 3 5 0 0 r r a i n 离心5 m i n ；取上清液n 2 气下浓缩至近干，吸取lp l 进行g c m s 分析。 硅田 耋口禾 生物样品中的c n 一和n 0 2 - 经衍生化处理后，不仅改善了色谱行为，减小或消 除了极性大的物质可能产生的拖尾，还提高了检测器对被测物的灵敏度，降低了 目标物的检测限，衍生化产物和内标在设定的色谱质谱条件下得到很好的分离且 没有干扰，实现了生物样品中c n 一和n 0 2 一的快速、准确分析。在血浆样品中c n 一 的l ，o d 为0 0 4 鹇m l ，n 0 2 一l o d 为o 0 0 5 9 9 m l d ( 2 ，3 - d a n 衍生化) ，n 0 2 一l o d 为 0 0 1 p g m l 以( 1 ，8 - d a n 衍生化) ；尿样品中c n 一的l o d 为0 0 1 p g m l ，n 0 2 一l o d 为 0 0 0 1 1 t g m l 以( 2 ，3 - d a n 衍生化) ，n 0 2 一l o d 为0 。0 0 5 1 , t g m l 以( 1 ，8 - d a n 衍生化) 。 该方法的线性关系、精密度、回收率均较好，衍生化产物在2 4 h 内的稳定性良好。 其中，n 0 2 一测定中，2 ，3 d a n 衍生化法在方法学方面优于1 ，8 d a n 衍生化法。 讨论 根据文中衍生物的色谱以及质谱特征，分别讨论了c n 一和n 0 2 - 衍生化反应的 机理：c n 一测定中涉及到两步衍生化反应，第一步衍生化为苯甲醛与c n 一的亲核 加成反应，第二步衍生化为上述产物与七氟丁酰氯的亲核取代反应；n 0 2 - 测定中， 二氨基萘和亚硝酸根离子发生重氮化反应，然后与萘环上的另一个氨基进行分子 内缩合成环，生成偶氮亚氨基杂环化合物。文中分别探索了c n 一和n 0 2 - 衍生化反 应过程中的影响因素：c n 一测定中，讨论了样品p h 值、氰离子和苯甲醛柱前反应 时间、苯甲醛用量对衍生化反应的影响，最终确定p n 值为1 0 、氰离子和苯甲醛 柱前反应时间为5 m i n 、苯甲醛为5 此时衍生化产物的响应值最大；n 0 2 - 测定中， 讨论了样品p h 值、衍生化温度、反应时间对衍生化反应的影响，最终确定p h 值 为3 、在6 0 下反应1 0 m i n 时衍生化产物的响应值最大。文中分别对质谱及色谱 图进行了解析，探索了衍生化产物的质谱裂解规律，并对色谱图中的主要峰进行 归属分析。文中讨论了在c n 一测定中硅藻土柱的作用机理，即固相支持的液液萃 取，该方法集提取、衍生化、洗脱为一体，不仅简化了实验过程，而且缩短了分 2 析时间。文中分别将两种方法与文献方法进行比较，证实本方法耗时更短、精密 度和准确度更高、操作更加简便安全。 结论 本文探索了g c m s 测定生物样品中有毒阴离子c n 一和n 0 2 - 的实验方法。通 过优化方法的样品前处理过程，使待测阴离子形成极性低、易被g c m s 识别的化 合物，缩短了分析时间，提高了检测灵敏度，得到较好的重现性、准确度和线性 关系，使我们能够在毒物分析以及临床医学研究中更快更准确地测定生物样品中 c n 一和n 0 2 一的含量。 关键词 氰化物；亚硝酸盐；苯甲醛；七氟丁酰氯；硅藻土；2 ，3 二氨基萘；1 ，8 二氨 基萘；g c m s ；血浆；尿 3 英文论著摘要 d e t e r m i n a t i o no ft o x i ca n i o n si nb i o l o g i c a l f l u i d sb yg a sc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r y i n t r o d u c t i o n c y a n i d ea n dn i t r i t ea r ec o m m o np o i s o n si nf o r e n s i cc a s e sb e c a u s eo ft h e i rw i d e a v a i l a b i l i t ya n dh i g ht o x i c i t y t h et o x i c i t yo fc y a n i d ea n dn i t r i t ei sm a i n l yc a u s e db y t h ea n i o n sd i s s o c i a t e db ym o l e c u l e s s ot h eq u a n t i f i c a t i o no fc y a n i d ea n dn i t r i t ei n b i o l o g i c a l f u i d si s f r e q u e n t l yr e q u i r e d i nc l i n i c a la n df o r e n s i c p r a c t i c e g a s c h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ( g c m s ) c o m b i n e d t h e a d v a n t a g e s o fg a s c h r o m a t o g r a p h ya n dm a s ss p e c t r o m e t r y , h a sh i g hd e g r e eo fs e n s i t i v i t y ，h i g hs p e e do f d e t e r m i n a t i o na n dh i g hs e l e c t i v i t y g c m sp l a y sa n i m p o r t a n tr o l e i nf o r e n s i c i n d e n t i f i c a t i o nb e c a u s eo fr a p i da n da c c u r a t eq u a l i t a t i o na n dq u a n t i f i c a t i o ni nc o m p l e x b i o l o g i c a ls p e c i m e n a p p l y i n go fg c m si nd e t e r m i n a t i o no fa n i o n si sl i m i t e db e c a u s e a n i o n sa l w a y sh a v es t r o n gp o l a r i t y , w a t e r - s o l u b i l i t ya n dn o n v o l a t i l i t y i no u rs t u d y , w e e x p l o r e das e r i e so fp r e t r e a t m e n t so fb i o l o g i c a ls p e c i m e n s ，c o n c e n t r a t i o no fa n i o n s ， c o n v e r s ea n i o n st os u b s t a n c e sw h i c hh a v el o wp o l a r i t ya n dh i g hv o l a t i l i t y , a c h i e v e d r a p i da n da c c u r a t ed e t e r m i n a t i o no f a n i o n si nb i o l o g i c a ls p e c i m e n m e t h o d s 1 d e t e r m i n a t i o no fc n i nh u m a np l a s m aa n du r i n eb yg a sc h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y 谢t 1 1 t w o - s t e p d e r i v a t i z a t i o n b u f f e r s o l u t i o n ,1 , 3 ，5 一 t r i b r o m o b e n z e n e ( i n t e r n a ls t a n d a r d ) a n db e n z a i d e h y d ew e r ea d d e dt os a m p l et o c o m p l e t et h ef i r s t s t e pd e r i v a t i z a t i o n t h e nt h ea n a l y t e sw e r ee x t r a c t e dw i t hs o l i d - p h a s e e x t r a c t i o n ( s p e ) 谢t 1 1d i a t o m a c e o u se a r t hc o l u m n , e l u t e d 、) l ，i t hn - h e x a n ec o n t a i n i n g h e p t a f l u o r o b u t y r y lc h l o r i d e ( h f b - - c 1 ) t oc o m p l e t et h es e c o n d - s t e pd e r i v a t i z a t i o n f o r m i n gt h ef m a la n a l y t e ，h e p t a f l u o r o - b u t y r i ca c i d a l p h a - c y a n o b e n z y le s t e r t h e nt h e e l u e n tw a sc o l l e c t e di nag l a s st u b ea n de v a p o r a t e du n d e rn i t r o g e ns t e a mu n t i l a p p r o x i m a t e l yd r y ，1p l w a su s e dt ob ea n a l y z e db yg c m s 2 d e t e r m i n a t i o no fn 0 2 一i nh u m a np l a s m aa n db r i n eb yg a sc h r o m a t o g r a p h y 一 4 m a s ss p e c t r o m e t r y 1m lo ft h eb u f f e rs o l u t i o n ( p h = 3 ) a n d2 0 t lo f2 3 - d a no r l ，8 - d a ns o l u t i o nw e r ea d d e dt oo 5m lo fh u m a np l a s m ao ru r i n es a m p l e a f t e rv o r t e x o f3 0 s ，t h em i x t u r ew a sh e a t e da t6 0 f o r10m i n u t e s 。t h et u b ew a sf o l l o w e db yt h e a d d i t i o no f ( 0 1 i n g m l q ) 5 1 x lo fi s a n ds h a k ef o r3 0s e c o n d s t h ep ho fs o l u t i o n c o n t a i n i n gt h er e a c t i o np r o d u c t i o nw a sr e a d j u s t e dt o8 5b ya d d i n g0 5 9a m m o n i u m c a r b o n a t e ，u n t i lt h ec a r b o nd i o x i d eg a sw a sl i b e r a t e dt h o r o u g h l y , t h et u b ew a sv o a e x e d f o r3 0 s 2m lo fe t h y le s t e rw a sa d d e dt oe x t r a c tt h ep r o d u c t i o n a f t e rc e n t r i f u g a t i o n , t h es u p e r n a t a n tw a st r a n s f e r r e di n t oav i a la n de v a p o r a t e du n d e rn i t r o g e ns t e a mu n t i l a p p r o x i m a t e l yd 珥l1 t lw a su s e dt ob ea n a l y z e db yg c m s r e s u l t s t h r o u g hd e r i v a t i z a t i o no fc n a n dn 0 2 。i nb i o l o g i c a ls p e c i m e n , t h ed e r i v a t i v e s s h o w9 0 0 dc h r o m a t o g r a p h i cb e h a v i o r s ，m i n u so re l i m i n a t et h es t r e a k i n gc a u s e db y s t r o n gp o l a r i t y , i n c r e a s e t h e d e g r e eo fs e n s i t i v i t y ，l o w e rt h el i m i to fd e t e c t i o n ， c h r o m a t o g r a m so fc n a n dn 0 2 一d e r i v a t i v e sw h i c ha r es h a r p ，n oi n t e r f e r i n gp e a k sa n d av e r yl o wb a c k g r o u n dw e r eo b s e r v e da c r o s st h ew h o l el i n e a rr a n g e a c h i e v e dr a p i d a n da c c u r a t ed e t e r m i n a t i o no fa n i o n si nb i o l o g i c a ls p e c i m e n i np l a s m a , t h el o do f c n i s0 0 4 1 上g m l ，l o do fn 0 2 一i s0 0 0 5 1 t g m l 1 ( d e r i v e db y2 3 一d a n ) ，l o do f n 0 2 一i so o l i t g 。m l _ ( d e r i v e db y1 ，8 d a n ) ；i nu r i n e ，t h el o do fc n i s 0 0 1i _ t g 。m l ，l o do fn 0 2 一i s0 0 0 1 g m l _ ( d e r i v e db y2 ，3 一d a n ) ，l o do f n 0 2 一i s 0 0 0 5 1 t g m l ( d e r i v e db y1 , 8 一d a n ) t h em e t h o d sh a v eg o o dl i n e a r i t y , p r e c i s i o na n d a c c u r a c y t h es t a b i l i t i e so fd e r i v a t i v e si n2 4 hw e r ef o u n dt ob ee x c e l l e n t b e t w e e nt h e m e t h o d so fd e t e r m i n a t i o no fn 0 2 一，d e r i v a t i z a t i o nb y2 ，3 - d a ni s s u p e r i o rt o d e r i v a t i z a t i o nb y1 , 8 - d a n d i s c u s s i o n a c c o r d i n gt oc h r o m a t o g r a p h i cb e h a v i o r sa n dm a s ss p e c t r o g r a p h i cb e h a v i o r s ，w e d i s c u s s e dt h ep r i n c i p l e so fd e r i v a t i z a t i o n sr e s p e c t i v e l y f o rd e r i v a t i z a t i o no fc n 一，t h e f i r s ts t e pi san u c l e o p h i l i ca d d i t i o nr e a c t i o nb e t w e e nb e n z a i d e h y d ea n dc n 一，t h es e c o n d s t e pi san u c l e o p h i l i ca d d i t i o n - e l i m i n a t i o nb e t w e e nh f b - c 1a n dc y a n o b e n z y la l c o h o l p r o d u c t ；f o rd e r i v a t i z a t i o no fn 0 2 一，ad i a z o t i z a t i o no c c u r sb e t w e e nd a na n dn 0 2 一， t h e nc o n n e c t e dw i t ha n o t h e ra m i n og r o u pb yc y c l i cc o n d e n s a t i o n i no u rs t u d y , w e 5 d i s c u s s e di n f l u e n c i n gf a c t o r si nc n 。a n dn 0 2 。d e r i v a t i z a t i o n s ：f o rd e r i v a t i z a t i o no f c n 一，w es t u d i e dt h ep hv a l u eo fs a m p l e ，r e a c t i o nt i m eo fc n a n db e n z a i d e h y d e ，a n d t h ea m o u n to fb e n z a i d e h y d e f i n a l l yw ef o u n dd e r i v a t i v eo fc n h a st h el a r g e s t r e s p o n s ev a l u ew h e np he q u a l s 10 ，5 p lo fb e n z a i d e h y d ea n dr e a c t sf o r5 m i n f o r d e r i v a t i z a t i o no fn 0 2 一，w es t u d i e dt h ep hv a l u eo fs a m p l e ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n d t i m e f i n a l l yw ef o u n dd e r i v a t i v eo fn 0 2 一h a st h el a r g e s tr e s p o n s ev a l u ew h e np h e q u a l s3 ，r e a c t sf o r 10 r a i na t6 0 c w ea l s os t u d i e dt h ew o r k i n gp r i n c i p l eo f d i a t o m a c e o u s e a r t h ：l i q u i d l i q u i d e x t r a c t i o n s u p p o r t e db ys o l i d e x t r a c t i o n , d e r i v a t i z a t i o na n de l u t i o n a r eg a t h e r e di ni n t e g r a lw h o l e n o to n l ys i m p l i f i e dt h e e x p e r i m e n t a lp r o c e s s ，b u ta l s os h o r t e nt h et i m eo fa n a l y s i s c o m p a r e d 谢t l lm e t h o d s g i v e nb yl i t e r a t u r e s ，o u rm e t h o d sh a v eas h o r t e ra n a l y s i s ，ab e a e rr e c o v e r ya n dm o r e s a f eo p e r a t i o n s c o n c l u t i o n i no u rs t u d y , w ee x p l o r e dt h ed e t e r m i n a t i o nm e t h o d so ft o x i ca n i o n so fc n 。a n d n 0 2 一i nb i o l o g i c a lf l u i d s t h r o u g ho p t i m i z a t i o no fp r e t r e m e n t s ，c o n v e r s ea n i o n st o s u b s t a n c e sw h i c hh a v el o wp o l a r i t ya n dh i g hv o l a t i l i t y , a c h i e v e dg o o dl i n e a r i t y , p r e c i s i o na n da c c u r a c y t h r o u g ht h e s em e t h o d s ，w ec a nd e t e r m i n et h ec n a n dn 0 2 一 m o l er a p i d l ya n dm o r ea c c u r a t e l yi nb i o l o g i c a ls p e c i m e n k e vw o r d s c y a n i d e ；n i t r i t e ；b e n z a i d e h y d e ；h e p t a f l u o r o b u t y r y lc h l o r i d e ；d i a t o m a c e o u se a r t h ； 2 , 3 d i a m i n o n a p h t h a l e n e ；1 , 8 - d i a m i n o n a p h t h a l e n e ；g c m s ；p l a s m a ；u r i n e 6 英文缩略语 7 论文一 g c m s 法测定血浆和尿中氰离子的研究 前言 一、氰化物及其毒理、代谢 氰化物系指含氰基的化合物，其中碳原子和氮原子通过叁键相连接。这一叁 键给予氰基以相当高的稳定性，使之在通常的化学反应中都以一个整体存在。氰 化物广泛存在于自然界中，是一种剧毒物质，当空气中氰化氢气体的浓度为 0 3 m g l 1 ，会引起“闪电式”骤死；口服氰化物( 以氰化钾计) ，致死量为o 1 5 0 3 9 。 由于氰化物具有广泛存在性和剧毒性，它一直是我国中毒案件中常见的毒物之一。 氰化物中毒主要由呼吸道吸入其粉尘或氰化氢气体，也可通过皮肤、粘膜、 消化道吸收引起中毒。氰化物的中毒机理极为复杂，最基本的中毒机理是抑制细 胞色素氧化酶( 线粒体电子传递链的终端酶) ，使细胞色素失去传递电子能力， 从而中断a t p 生成，使呼吸链中断，出现细胞内窒息，引起组织缺氧而致中毒。 近年来，对于氰化物中毒机理的研究己逐渐深入到氧化代谢抑制之后的细胞结局 性损伤。 动物实验证明，氰化物的代谢受氰化物种类、实验动物种属及给药剂量等因素 影响【n 。氰化氢进入体内后，通过多种途径代谢。绝大部分( 8 0 以上) 氰基在 硫氰酸生成酶的催化下与体内供硫化合物( 胱氨酸、半胱氨酸和p 巯基丙酮酸) 作用形成硫氰酸盐，从肾脏排出。硫氰酸生成酶主要分布在细胞线粒体内，酶活 性以肝、肾最高，脑次之，肺、脾、肌肉和血液甚微。此解毒作用因体内供硫物 不足而受到限制。部分氰基在胱氨酸的作用下生成2 氨基噻唑啉- 4 羧酸( a t c a ) 及它的互变异构体2 亚氨基四氢噻唑4 羧酸( i t c a ) 。极少部分以原形由肺和 肾排出。此外，h c n 还可与b 1 2 。( 羟钴胺) 结合形成维生素b 1 2 ( 氰钴胺) 、与葡 萄糖结合形成无毒的氰醇化合物【2 4 ，5 1 。 8 二、测定生物样品中氰离子的意义 由于氰化物的广泛存在性和剧毒性，它一直是我国中毒案件中常见的毒物之 一。氰化物的毒性主要由其分子在机体内释放出的氰离子所引起，故其毒性强弱 也主要取决于释出氰离子的量及速度。因此快速准确检测生物样品中游离的氰离 子在毒物分析以及临床医学研究中具有实际应用价值。 三、氰离子的测定方法 随着现代仪器的不断发展，测定氰离子的方法有很多。根据所用仪器不同， 可分为分光光度法【6 】【7 】【8 】【9 】【l o 】【1 1 】【1 2 1 、电化学法【1 3 】【1 4 】和色谱法。其中，色谱法是根据 混合物中各组分在两相间分配系数的不同而进行分离分析，因此该方法是分析复 杂混合物最有利的手段。目前测定生物样品中氰离子含量的色谱方法有高效液相 色谱f 1 5 1 【1 6 ”1 【1 8 】、离子色谱1 9 】【2 0 】、气相色谱及气相色谱质谱联用等方法。 气相色谱是用气体作为流动相的色谱法，主要是利用物质的沸点、极性及吸 附性质的差异来实现混合物的分离。该方法柱效高、分离时间短、所需试样量少， 适于检测分子质量小于1 0 0 0 ，低沸点，易挥发，热稳定性好的化合物。尤其是近 些年发展的气相色谱质谱联用技术，既具有色谱法的高分离能力，又具有质谱法 的高鉴别能力，因而具有灵敏度高、分析速度快和鉴别能力强的特点，可同时完 成待测组分的分离和鉴定，特别适用于多组分混合物中未知组分的定性和定量分 析，判断化合物的分子结构，准确地测定化合物的分子量，可用于生物样品和体 液中药物和代谢物的痕量分析。气相及气质联用法的前处理分为直接测定法和化 学衍生化法。直接测定法：由于氰化氢( h c n ) 在常温常压下为无色气体，绝 大多数的气相色谱法是对样品处理后直接测定氰化氢色谱峰。文献中样品的前处 理方法是将样品酸化，然后顶空法【2 1 】【2 2 】【2 3 】【2 4 】【2 5 1 或顶空固相微萃取法【2 6 】【2 7 】【2 8 1 进 样，使用氮磷检测器或质谱进行检测。这两种前处理方法可用于样品中挥发性物 质的分析，免去传统的样品萃取、浓集等步骤，还可避免生物样品中非挥发组分 对色谱柱的污染。但在处理过程中，酸化易使样品中的硫氰根离子转化成氰离子， 人为造成氰离子浓度增高；文献方法中，氰化氢在两相之间达到平衡较慢，需 3 0 6 0 n l i n ；气液体积比，样品基体成分，平衡温度与时间等因素影响分析的准确 性与重现性；氰化氢的m z 为2 7 ，处于质谱质量范围的低质量端，误差较大，且容 9 易受到氮气( m z 2 8 ) 的干扰；最重要的是h c n 属于剧毒气体，前处理过程中易泄 露，对分析人员产生安全隐患。化学衍生化法：该方法是利用化学反应，使化 合物分子中的原子或官能团直接或间接地被其它原子或官能团置换，而成为新化 合物的方法。该方法所得到的新化合物称为衍生物。用于置换母体化合物中的原 子或官能团的物质称为衍生试剂。衍生化产物的溶解度、沸点、熔点、聚集态或 化学成分与原化合物会有所不同，由此产生的新的化学性质可满足色谱分析的条 件。一些文献方法是对氰离子进行衍生化，使其转化成其它含氰化合物再进行检 测。日本九州大学k a g e 实验组提出五氟苄基溴衍生化法。由于氰离子易溶于水、 不溶于有机溶剂，五氟苄基溴溶于有机溶剂而难溶于水，因此，在这个反应体系 中加入相转移催化剂t d m b a ( 十四烷基二甲基苄基氯化铵) 来加速两相之间的反 应。国内公安部物证鉴定中心封世珍等人【3 0 】主要通过氯胺t 对氰离子进行衍生化， 生成c n c i ，取顶空气体进样，e c d 检测。 以上文献对比发现：氰离子通过衍生化，转化成其它含氰化合物，一方面可 以改善色谱行为，减小或消除极性大的化合物可能产生的拖尾，另一方面可以提 高检测器对被测物的灵敏度，降低目标物的检测限。但现有的衍生化法操作比较 复杂，耗时长，回收率较低。本课题研究的目标是通过探索有氰离子参与的化学 反应机理、条件，提出一种简单、快速的衍生化方法，用g c m s 进行测定，实现 血浆和尿样品中氰离子含量的快速、准确分析；并将本方法与文献五氟苄基溴衍 生化法进行比较。 材料与方法 一、材料 ( 一) 仪器与试剂 l 、仪器 ( 1 ) s h i m a d z ug c m s q p 2 0 1 0 气相色谱质谱联用仪( 日本岛津公司) ； ( 2 ) p h 测定仪( 梅特勒一托利多仪器上海有限公司) ( 3 ) 旋涡混合器( 其林贝尔仪器制造公司) ( 4 ) 微量进样器( 上海安亭微量进样器厂) 1 0 ( 5 ) 精密电子天平( 沈阳杰龙仪器有限公司) ( 6 ) 固相萃取装置 ( 7 ) t d z 4 w s 台式离心机( 沈阳杰龙仪器有限公司) ( 8 ) 具塞离心管 2 、试剂 ( 1 ) 硅藻土：1 5 2 5 目 ( 2 ) 氰化钾标准品( 国药集团化学试剂有限公司) ( 3 ) 三溴苯( t b b ) 标准品( 日本和光纯药工业株式会社) ( 4 ) 七氟丁酰氯( h f b c 1 ) ( 东京化成工业株式会社) ( 5 ) 正己烷( 色谱纯) ( 国药集团化学试剂有限公司) ( 6 ) 盐酸：l m o l l 1 ( 7 ) 氢氧化钠：2 m 0 1 l ，5m o l l 。1 ( 8 ) 硼砂( 分析纯) ( 国药集团化学试剂有限公司) ( 9 ) 异丙醇( 分析纯) ( 国药集团化学试剂有限公司) ( 二) 生物样品 1 、血浆( 中国医科大学附属第一医院血库提供) 2 、尿液( 健康非吸烟人) 。 二、实验方法 ( 一) 溶液配制 l 、氰储备液的配制 精密称取氰化钾标准品适量，溶于0 5 m 的n a o h 溶液中，制备氰离子浓度为 1 0 m g m l 。1 的储备液，置于4 。c 下保存。 2 、氰标准溶液的配制 ( 1 ) i 汉1 0 m g m l 。1c n 一储备液0 1 m l 于9 9 m l 空白血浆中，涡旋震荡混匀，得 到氰离子浓度为0 1 m g m l 1 的血浆标准溶液。将o 1 m g 1 1 1 l 以的血浆标准溶液用空白 血浆进行逐级稀释，分别得到氰离子浓度为0 1 1 t g m l ，0 2 9 9 m l 一，0 4 1 , t g m l 一， 1 1 t g m l 一，2 p g m l ，1 0 9 9 m l ，2 0 l a g m l ，4 0 9 9 m l ，1 0 0 1 t g m l 1 的血浆标准 溶液。 ( 2 ) 1 获1 0 m g m l lc n 一储备液0 1 m l 于9 9 m l 空白尿中，涡旋震荡混匀，得到 氰离子浓度为0 1 m g m l d 的尿标准溶液。将0 1 m g m l 1 的尿标准溶液用空白尿进行 逐级稀释，分别得到氰离子浓度为o 0 2 9 9 m l ，0 1 9 9 m l ，0 2 9 9 m l ，0 4 9 9 m l ， l 鹏m l ，2 9 9 m l ，4 9 9 m l ，1 0 1 t g m l ，2 0 9 9 m l 。1 的尿标准溶液。 3 、内标溶液的配制 取适量的三溴苯，溶于异丙醇中，配成浓度 1 0 0 m g m l 1 的内标储备液，再 用异丙醇稀释，配成浓度为0 1 m g m l 1 的内标溶液，置于4 c 下保存。 4 、缓冲溶液的配制 取适量的硼砂加入蒸馏水中，配成浓度为0 0 5 m 的硼砂溶液；于1 0 0 m l 的容量 瓶中加入2 5 m l 的0 0 5 m 硼砂溶液和2 1 5 m l 的0 2 m 氢氧化钠溶液，加入蒸馏水配成 p h 为1 0 的缓冲溶液。 ( 二) 分析条件 l 、色谱条件 气相色谱质谱联用仪：s h i m a d z ug c m sq p 2 0 1 0 ；色谱柱：r t x 5 毛细管柱( 聚 二甲基硅氧烷) ，1 0 m x 0 1 8 m m x 0 2 1 a m ( 膜厚) ；柱温程序：柱初始温度为6 0 0 ， 保持l m i n 后以1 5 m i n o 速度升至2 7 0 。c ，保持8 m i n ；载气为氦气( 9 9 9 9 9 ) ，柱 前压为7 6 5 k p a ，不分流进样1 止。 2 、质谱条件 e i 离子源，电子能量为7 0 e v ，质量范围4 0 9 0 0 u ，进样口温度为2 5 0 。c ，接口 温度为2 7 0 。c ，离子源温度为2 0 0 c ，检测器温度为2 0 0 0 c 。 3 、数据采集 g c m s 法分析采用全扫描( s c a n ) 和选择离子检测( s i m ) 两种方式进行分 析。在全扫描方式下，质量扫描范围为4 0 9 0 0 m z ，扫描间隔时间为0 5 0 s ，扫描时 间范围为0 2 0 m i n 。在s i m 方式下，扫描时间范围为0 1 0 m i n 。扫描时间间隔为0 2 s 。 氰衍生化产物用两个特征离子进行鉴定，m z 3 2 9 和m z 1 1 6 ；内标物t b b 用两个特 征离子进行鉴定，m z 3 1 4 和m z 2 3 5 。 1 2 ( 三) 分析步骤 l 、于试管中取0 5 m l 血浆或尿，向其中加入0 5 m l 硼砂缓冲溶液( p h = 1 0 ) ， 加入5 此，0 1 9 9 p l 。( 共计0 5 9 9 ) 三溴苯( 内标) 。 2 、向上述溶液中加入苯甲醛5 此，涡旋振荡3 0 s 后，静置5 r a i n 。 3 、在1 5 e m ( 高) x 1 0 c m ( 内径) 的玻璃层析柱底端填入少许脱脂棉，然后 填入1 5 9 硅藻土。将上述溶液转移至硅藻土柱中，静置1 0 m i n 。 4 、用混合溶液( 5 m l 正己烷+ 2 0 9 l h f b c i ) 洗脱，同时完成第二步衍生化。 5 、将脱出液置于通风橱内，氮气下浓缩至近干，取l g l 于g c m s 分析。 实验结果 一、氰衍生物及内标质谱图 质谱图系指分子离子或碎片离子的质量与其相对强度的关系图，又称棒图。 横坐标是带正电荷的离子碎片质荷比，即其质量除以电荷( m z ) ，由于一般讨论 的是单电荷离子( 群l z = 1 ) ，因此其值也就是该峰的质量。纵坐标是离子的相对丰 度( 强度) 。最强峰称为基峰，并规定其强度为1 0 0 ，其它峰以此确定相对强度。 由质谱图可以得到化合物的结构、相对分子量等信息。 氰衍生物和内标三溴苯的质谱图如图1 所示。图1 ( a ) 中m z 3 2 9 ，m z 1 1 6 ( 基 峰) ，m z 1 3 2 和m z 1 6 9 分别为氰衍生物 岫峰、碎片离子【c 6 h s c h c n + 峰、 【c 6 h s c h ( c n ) o + 峰g l c 3 f 7 + 峰。图l ( b ) 中砒3 1 4 和，彪2 3 5 分别为内标三溴苯的 呻峰和【衍b r