（分析化学专业论文）氨基酸对映体的毛细管电泳电化学分离检测.pdf

氨基酸对映体的毛细管电泳电化学分离检测 专业：分析化学 作者：曾暖茜 导师：谢天尧副教授 摘要 氨基酸组成蛋白质的基本单元，在人体及动物生命活动中起着举足轻重的作 用，自然界存在的及具有生物活性的氨基酸均为l 型氨基酸，然而非天然氨基酸 多为外消旋体，d 型氨基酸在生理活性和实际用途与l 型有很大差别，d 型必须在 体内转化为l 型刁能被机体吸收利用，因此d l - 氨基酸的分离是生命科学研究的 基础，在蛋白质多肽的研究、有机化学中的不对称合成以及医药、食品、卫生等 领域的研究中都具有重要意义。采用通常的气相色谱和液相色谱法拆分，制备手 性固定相和色谱柱费用昂贵，大多数氨基酸没有紫外吸收峰、不产生荧光，一般 需要柱前样品衍生化。衍生化过程不仅费时繁琐，而且有可能使分析物质发生改 变，影响分析结果。高效毛细管电泳由于其高效、快速、样品用量少、操作简单 等优点，成为生物化学和分析化学中最受瞩目，发展最快的一种分离分析新技术， 己被广泛应用于生物医学、手性分离和环境检测等领域。电化学检测作为一种灵 敏度高，选择性好的检测方法在毛细管电泳分离分析中得到了广泛的应用，电导 检测具有通用性，对于氨基酸无须进行衍生化即可检测，操作简单，运行成本低。 本论文采用了毛细管电泳一电导检测分别对异亮氨酸和组氨酸进行了分离检测， 并对其分离机理进行了初步的探讨。 本论文包括三个部分，主要内容如下： 第一章 回顾和评述了毛细管电泳的发展历史；详细介绍了毛细管电泳的基本原理； 概述了毛细管电泳检测的各种方法，特别对电化学检测的各种方法及其最新应用 进展进行了详细的介绍：重点介绍了氨基酸的分离检测方法和毛细管电泳在氨基 酸的手性分离的应用和研究进展；并阐述了本课题的研究背景和意义。 第二章 在熔融石英毛细管( 5 0 肛mi d x 5 0c m ) 中，铜盐和羟丙基甲基纤维素作为 二元协同手性选择剂，以2m m o i l n a a c + 3m m o i l h a c + 1m m o i l c u + 1 0m g l h p m c ( p h = 3 5 ) 为电泳运行液，分离电压1 5 0 k v ，建立了异亮氨酸对映体的 毛细管电泳分离电导检测的分析新方法。异亮氨酸对映体获得良好的基线分离， 其线性范围为3 5 0 0m g l ，检出限( s n = 3 ) 为1m g l 。对影响分离度的影响 因素：电泳运行液组成，手性选择剂、h p m c 浓度等进行了洋细的讨论。本方法 具有较好检测灵敏度及重现性，操作简便，分析成本低，可发展于实际样品的分 析应用。 第三章 采用毛细管区带电泳一电导法，以铜l 精氨酸作为配基交换选择剂，在2 m m 0 1 ln a o h + 0 4m m o l lc i t + 1 3m m o l lc u + 2 6m m o l ll a r g ( p h = 1 0 2 ) 运行液中，采用电动进样，进样电压9 0k v ，进样时间1 0s ，分离电压1 5 0k v 下，组氨酸在8 分钟内实现分离检测，其线性范围为2 5 0 0m g l ，检出限( s ， = 3 ) 为0 5m g l 。对影响分离度的影响因素：电泳运行液组成、浓度，配体选 择剂摩尔比、浓度等进行了详细的讨论。本方法灵敏，快速，分析成本低，高效 简便，可发展于实际样品的分析应用。 关键词：毛细管电泳，电化学检测法，1 异亮氨酸，组氨酸，手性分离 c h i r a ls e p a r a t i o no fu n d e r i v a t i z e da m i n oa c i d sb y c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw i t he l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t o r m a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y n a m e z e n gn u a n x i s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rx i et i a n y a o a b s t r a c t a m i n oa c i d sa r ei m p o r t a mc o m p o u n d st h a ta r ea s s o c i a t e dw i t hp e p t i d e sa n d p r o t e i n sa n da r ef r e q u e n t l yf o u n di nf o o d ，f e e d s ，b o d yf l u i d sa n dt i s s u e s c h i r a l s e p a r a t i o no fd ，l a m i n oa c i d si so fg r e a ti m p o r t a n c ei nl i f es c i e n c e ，p h a r m a c e u t i c s a n df o o di n d u s t r y t h i sh a sb e e ne x t e n s i v e l ys t u d i e db yg ca n dh p l cu s i n gc h i r a l s t a t i o n a r yp h a s e s o rc h i r a lm o b i l ep h a s ea d d i t i v e s i nr e c e n t y e a r s ，c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sh a sb e e np r o v e nt ob eap o w e r f u lt e c h n i q u ef o rc h i r a la n a l y s i sb e c a u s e o fi t s h i g hs e p a r a t i o ne f f i c i e n c y ，s h o i ta n a l y s i st i m e s ，f e a s i b i l i t yi ns e l e c t i v i t y m a n i p u l a t i o n ，l o ws a m p l ea n dr e a g e n tc o n s u m p t i o na n ds i m p l ei n s t r u m e n ts e t u p m o s ta m i n oa c i d sl a c ks t r o n gu va b s o r b a n c ee x c e p tf o rt h r e ea r o m a t i ca m i n oa c i d s ， t h e yg e n e r a l l yr e q u i r ed e r i v a t i z a t i o np r i o rt oa n a l y s i sf o rs e n s i t i v ed e t e c t i o na n d e f f i c i e n ts e p a r a t i o nu s i n gu va b s o r b a n c eo rf l u o r e s c e n c e t h i si sl a b o ri n t e n s i v ea n d t i m ec o n s u m i n g e l e c t m c h e m i s t r yd e t e c t i o na sah i g hs e n s i t i v e ，s e l e c t i v ed e t e c t i o nm e t h o dh a s b e e nw i d e l yu s e di n c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s i nt h i st h e s i s ，c ec o u p l e dw i t h c o n d u c t i v i t yd e t e c t o rw a se m p l o y e dt os e p a r a t ea n dd e t e c tt h eu n d e r i v a t i z e da m i n o a c i de n a n t i o m e r s t h i st h e s i si n c l u d e st h r e ec h a p t e r s t h ef o l l o w i n g sa r em a j o rc o n t e n t ： i i i c h a p t e r1 i nt h i sc h a p t e r , t h ed e v e l o p i n gh i s t o r yo fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sh a db e e n r e v i e w e da n dt h eb a s i cs e p a r a t i o nt h e o r yh a db e e ns u m m a r i z e d s o m ek i n d so f d e t e c t i o nm e t h o d sh a db e e ni n t r o d u c e d ，a m o n gt h e m ，t h ee l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n m e t h o dw a sd e t a i l e d t h ed e v e l o p m e n ta n da p p h c a t m no fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i si n t h es e p a r a t i o no fa m i n oa c i de n a n t i o m e r sw a ss u m m e du p ，a n dt h es e p a r a t i o n m e c h a n i s mw a sj n t r o d u c e d c h a p t e r2 an e wm e t h o do fe n a n t i o s e p a r a t i o no fu n d e r i v a t i z e dd l - i s o - l e u c i n eb yh i g h p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i su s i n gb i n a r yc h k a ls e l e c t o r sc o u p l e dw i t h c o n d u c t i v i t yd e t e c t o rw a sd e v e l o p e d t h ee n a n t i o m e r so fd l - i s o l e u c i n ew e r e b a s e l i n es e p a r a t e du n d e rt h eo p t i m u ms e p a r a t ec o n d i t i o n s ：u n c o a t e df u s e d s i l i c a c a p i l l a r y ( 5 0u l n j d x 5 0c m ) ，2 m m o l l n a a c + 3 m m o l l h a c + 1 m m o l l c u + 1 0 m g lh p m c ( p h = 3 5 ) a sr u n n i n gb u f f e r , s e p a r a t i o nv o l t a g e1 5k v t h ec a l m r a t i o n c u r v eo ft h ee n a n t i o m e r ss h o w e dg o o dl i n e a r i t yi nt h er a n g ef r o m3t o5 0 0m e g lw i t h l o d = 1 m g l t h ee f f e c t so ft h ec o n c e n t r a t i o no fc o p p e rs a l ta n dh p m c ，t h ep ho f t h eb a c k g r o u n de l e c t r o l y t eo nr e s o l u t i o n s ( r s ) o ft h ee n a n t i o m e r sw e r ed i s c u s s e di n d e t a i l t h i sm e t h o di sw i t h o u tp r e t r e a t m e n t ，a n dw a sd e m o n s t r a t e ds i m p l e ，r a p i da n d r e p r o d u c i b l e c h a p t e r 3 an e wm e t h o df o rt h es e p a r a t i o no fu n d e r i v a t i z e dd l - h i s t i d i n eb yl i g a n d e x c h a n g ec a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i sw i t hc o n d u c t i v i t yd e t e c t o rw a sd e v e l o p e d t h e o p t i m u me x p e r i m e n t a lc o n d i t i o ni si na nu n c o a t e df u s e d s i l i c ac a p i l l a r y ( 5 0u m i d x 5 0c m ) 2 m m o i l n a o h + 0 4 m m o l l c i t + 1 3 m m o i l c u + 2 6 m m o i l l - a r g ( p h = 1 0 2 ) a sr u n n i n gb u f f e r , s e p a r a t i o nv o l t a g e1 5 0k v , i n j e c t i o nv o l t a g e9 0k v w i t hi n j e c t i o nt i m eo f1 0s t h ec a l i b r a t i o nc u r v eo ft h ee n a n t i o m e r ss h o w e dg o o d l i n e a r i t yi nt h er a n g ef r o m2t o5 0 0m g lw i t hl o d = 0 5m g lt h ee f f e c t so ft h e b u f f e rc o n c e n t r a t i o n ，p h ，t h em o l a rr a t i oo fl - a r g i n i n et oc u ，t h ec o n c e n t r a t i o no f c u ( i i ) a n dl - a r g i n i n e ，a n dt h em e t h o do fi n i e c t i o no nt h er e s o l u t i o no fc h i r a l s e p a r a t i o nw a si n v e s t g a t e d t h i sm e t h o di sw i t h o u tp r e t r e a t m e n t ，a n ds a t i s f i c t i v e r e s u l t sw e r eo b t a i n e d k e yw o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n ，i s o - l e u c i n e ，h i s t i d i n e ， c h i r a ls e p a r a t i o n v 中山大学硕士学位论文氨基酸对映体的毛细管电泳_ | 乜化学分离检测 第一章前言 1 1 毛细管电泳技术简介 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 又叫高效毛细管电泳( h p c e ) ， 是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，是近年来发展最快的分析方法之 一【1 】。毛细管电泳具有高效、快速、微量、高灵敏度和可以自动化的特点，它使 分析科学得以从微升水平进入纳升水平，使单细胞分析，乃至单分子分析成为可 能，在生命科学、环境科学等领域中显示了极其重要的应用前景。毛细管电泳目 前已广泛应用于有机化合物、无机离子、中性分子、手性化合物、蛋白质和多肽、 d n a 和核酸片段的分析，在临床医学珍断、卫生防疫、环境监测、食品安全等 领域得到广泛应用。 1 1 1 毛细管电泳的发展历史 传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热，1 9 6 7 年h i e r t e n 最先 提出在直径为3m m 的毛细管中做自由溶液的区带电泳( c a p i l l a r yz o n e e l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) ，但他没有完全克服传统电泳的弊端【2 】o 现在所说的毛细 管电泳( c e ) 是e l l j o r g e n s o n 和l u k a c s 在1 9 8 1 年首先提出【3 】，他们使用了7 5 p m 的 毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。1 9 8 4 年t e r a b e 将胶束引入毛细 管电泳【4 j ，开创了毛细管电泳的重要分支：胶束电动毛细管色谱( m e k c ) 。1 9 8 5 年h j e r t e n 等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行【”。同年，c o h e n 发表了 毛细管凝胶电泳的工作【6 】。近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又 发展了毛细管电色谱，扩大了电泳的应用范围。目前以毛细管电泳为核心技术， 以芯片为平台的微全分析系统( 1 l t a s ，又称芯片实验室) 1 7j 在最近几年的迅速 崛起，微全分析系统和芯片实验室概念的提出，意味着分析仪器最终发展方向是 微型化和集成化，包括样品前处理、富集、化学反应、分离分析、检测等单元操 中山大学硕士学位论文氨基酸对映体的毛细管电泳1 u 化学分离检测 作都可在芯片上集成化和自动化完成【8 】 从而缩短了分析时间，降低了样品消耗 它很可能成为现代分析技术的主流并“引起分析化学的一场革命”吼 1 1 2 毛细管电泳基本原理 1 1 2 1 电泳，淌度【1 】 电泳是指带电离子在直流电场的作用下于一定介质中所发生的定向运动。电 泳中常用淌度来描述荷电粒子的电泳行为与特性，单位电场下的离子的平均电泳 速度称为淌度( e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t y ) 或电迁移率( e r a ) ，即 ：导：z q 一 ( 1 1 ) 2 i2 面 【1 。1 ) v 运动速度，e 一电场强度 4 溶质粒子所带的有效电荷，r 粒子的有效半径，目溶剂粘度 从上式可知，荷电粒子的电泳速度与电场强度和介质特性有关，还与离子的 电荷多少和形状有关。因此，粒子的大小与形状，以及有效电荷的差异，构成了 电泳分离的基础。 1 1 2 2 电渗流 在高效毛细管电泳中，所使用的毛细管大多是石英材料。当毛细管中充入 p h i 3 的电解质溶液时，管壁的硅羟基( - - s i o h ) 开始部分解离成( - - s i o 一) 使 管壁带负电荷。由于静电引力，- - s i o 一将电解质溶液中的阳离子吸引到管壁附近， 并在一定范围内形成阳离子相对过剩的扩散双电层，双电层之间存在电势差。如 果在毛细管两端加上高压，就会发生管内液体整体相对于管壁的定向流动现象， 叫做电渗现象。电渗现象中液体的整体流动叫电渗流( e l e c t r o o s m o t i cf l o w ，简称 e o f ) ，见图1 - 1 。 哥胃踏哥胃嶷闷胃凝粥铡 之+ 。善善眵j + 二正极+ oo + 。伊膨帕扩负极 良叟基叟禽叟袋基鎏鬯，= 弘禽恩基碧摁 图1 - 1 毛细管中的屯渗模型 2 中山大学硕士学位论文氨基陵对映体的毛细管电泳电化学分离检测 电渗流的方向决定于毛细管内壁表面电荷的性质，一般情况下，石英毛细管 内壁表面带负电荷，电渗流方向从阳极流向阴极。反之如果将毛细管壁表面改性， 例如在壁表面涂渍或者键合一层阳离子表面活性剂，或者在内充液中加入大量的 阳离子表面活性剂，将使毛细管壁带正电荷，壁表面吸引溶液中的阴离子使溶液 表面带负电荷，在外电场作用下，整个液体向阳极流动。 一般情况下，电渗流速度约等于离子电泳速度的5 7 倍，粒子在毛细管内 电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流两种速度的矢量和，正离子的运动方向和 电渗流一致，故最先流出；中性粒子的电泳流速度为零，故其迁移速度相当于电 渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电 泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，从而使各种粒子因迁移速度不同而实现 分离。 以电场力驱动产生的电渗流，与高效液相色谱中靠外部泵压产生的液流不 同。如图1 2 所示，电渗流的流型属扁平流型，或者称为塞流；高效液相色谱中 的流型则是抛物线状的层流，它在壁上的速度为零，中心速度为平均速度的2 倍，而扁平流型不会引起样品区带的增宽，这是c e 获得高分离度的重要原因之 一n 不： 、 图1 2 电渗流形( a ) 和泵推流形( b ) 及相应的溶质区带 1 1 2 3 效率方程 与色谱相同，毛细管电泳的分离效率一般也用塔板高度日或塔板数来表 3 中山大学硕士学位论文氨基酸埘映体的毛细管i u 泳i 也化学分离检测 = 等= 百l ( 1 - 2 )盯。爿 式中，盯2 表示分离区带的总方差。可以利用峰的参数直接测定： 肛s m m s ， 式中，；为峰的半峰宽。在c e 中，有时可以很大但分离并不理想，此时最 好用分离度( r e s o l u t i o n ，见) 来衡量分离效果。分离度，亦称为分辨率，是指 将相近的组分分开的能力。它是分离技术中的一个重要性能指标。分离度尼定 义为： 凡= 2 ( t w ) ：2 + - - 矽( t w 。) , = 百t 2 - t l ( 1 - 4 )- y 2 + 矿14 口 。 式中，w 为峰底宽，下标1 ，2 表示相邻的两个峰。 1 1 3 仪器系统 毛细管电泳仪的基本结构包括高压电源、进样装置、毛细管柱、检测器及信 号记录系统，如图1 3 所示。h p c e 电源要求采用连续可调的0 - 3 0k v 直流高 压电源，电压输出要求稳定，以单端高压电源为最佳。两个缓冲液池中的缓冲液 面应保持同一水平，并且毛细管柱两端插入液面下的同一深度，以避免柱两端产 生压差，引起虹吸现象。毛细管柱目前常用的是圆管形熔融石英毛细管，通常在 外壁涂渍聚酰亚胺使毛细管富有弹性，内径一般为2 5 1 0 0u m ，细内径毛细管 柱具有较高的表面积体积比，因此能有效地散发电泳过程产生的焦耳热，减少 因流体对流引起的区带展宽【1 0 1 。 在毛细管区带电泳中，毛细管和电极槽内充有相同组分和相同浓度的背景电 解质溶液( 缓冲溶液) 。样品从毛细管的进样端导入，当毛细管两端加上一定的 电压后，荷电溶质便朝与其电荷极性相反的电极方向移动。由于样品组分间的淌 度不同，它们的迁移速度不同，因而经过一定时间后，各组分按其迁移速度的大 小顺序，依次到达检测器分别检出，得到随时间分布的电泳图谱，根据组分的迁 移时间( f 。) 和峰高( h ) 或峰面积( a ) 进行定性和定量分析。 4 中山大学硕十学位论文氨基陵对映体的毛细管电泳一电化学分离硷测 画 d a t aa u i m t m l 图1 - 3 毛细管电泳基本仪器结构示意图 1 1 a 毛细管电泳的主要分离模式 毛细管电泳根据分离介质和分离原理不同，可分为多种操作模式”。 表1 - 1 毛细管电泳各种操作模式 电泳模式说明 毛细管区带电泳 c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e 使用均匀p h 缓冲液 使用前导和终末电解质 毛细管等速电泳 c a p i l l a r yi s o t a c h o p h o r e s i s ，c i t p 缓冲液 毛细管等电聚焦 c a p i l l a r yl s o e l e c t r i cf o c u s ，c l e f 使用d h 梯度缓冲液 m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i c c a p i l l a r y 在c z e 缓冲液中加入一 胶束电动毛细管色谱 c h r o m a t o g r a p h y ，m e c c 种或多种胶束 m i c r o e m u l s i o ne l e c t r o k i u e t i cc h r o m a 在c z e 缓冲液中加入水 微乳液毛细管电动色谱 t o g r a p h y ，m e e k c 包油微乳液 n o n a q u e o u sc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ， 完全非水或有机相占流 非水毛细管电泳 n a c e 动相主要成分 a f f i n i t yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ， 根据抗原抗体、受体配 亲和毛细管电泳 a c e 体的特异性相互作用 毛细管凝胶电泳 c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s ，c g e 在管内填充凝胶介质 5 中山大学硕士学位论文氢基酸对映体的毛细管i u 泳- l u 化学分离检测 n o ng e l c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ， 使用亲水线性或枝状高 非胶毛细管电泳 n g c e分子构成筛分网络 o p e n - - t u b u l a rc a p i l l a r y e l e c t r o c h r o - 使j ；i j 【直| 定相涂层毛细管， 开管毛细管电色谱 m a t o g r a p h y ，o t c e c 分正相、反相、离子交换 p a c k e d - c o l u m nc a p i l l a r ye l e c t r o c h r o - 毛细管内填充色谱填料， 填充毛细管电色谱 m a t o g r a p h y ，p c c e c 分止相、反相、离子交换 利h = | 一根以上毛细管进 阵列毛细管电泳 c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s ，c a e 行c e 操作 m i c r o c h i pc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ， 利用刻制在载玻片上的 芯片毛细管电泳 m c c e 毛细通道进行电泳 1 1 5 进样方法 毛细管分离通道十分细小，所需的样品区带不过数纳升，给进样带来的严格 的要求。通常采用柱上进样，消除非柱上进样造成的区带扩张和样品过载，实现 无死体积进样的方法是毛细管直接与样品接触，然后通过重力、电场力、或其他 动力来驱动样品流入管中。进样量可以通过控制驱动力的大小或时间长短来控 制。 1 1 5 1 电动进样 把毛细管的进样端插入到样品溶液中，并加一外加电压e 时，组分就会因 电迁移和电渗作用而进入管内。电动进样对毛细管内的填充介质没有特别的限 制，是一种通用型的进样方法，可以实现完全自动化操作，也是商品仪器必备的 进样方法。不过电动进样有歧视现象，即迁移速度大者多进，小者少进或不进， 这会降低分析的准确度和可靠性。 l 1 5 2 压力进样 压力进样也叫流动进样，它要求毛细管中的填充介质具有流动性，比如溶液 等。当毛细管的两端置于不同的压力环境中时，管中溶液即能流动，将样品带入。 毛细管两端的压力差，即压力进样动力，可以用三种方法产生：正压，利用压缩 空气如钢瓶气可以实现正压进样；负压，可利用管尾抽吸的办法，但要注意的是 负压进样需要特别精密的控制涉及，容易因泄漏等原因出现不重复进样；重力虹 6 中山大学硕士学位论文氨基酸对映体的毛细管i u 泳1 u 化学分离检测 吸。压力进样没有偏向问题，但选择性差，样品及其背景都同时被引进管中，对 后续分离可能产生影响。 1 1 5 3 扩散进样 利用浓度差扩散原理同样可以将样品分子引入毛细管中。当将毛细管插入一 样品溶液时，样品分子因管口界面存在浓度差而向管口扩散。扩散进样和电动进 样同属于普适性进样方法，对管内介质没有任何限制。而且扩散进样还具有双向 性：在样品分子进入毛细管的同时，区带中的背景物质也向管外扩散，由此可以 得到畸变程度较小( 和背景差别不大) 的初始区带，能抑制背景干扰，提高分离 效率。同时扩散也与电迁移速度和方向无关，可抑制进样偏向，提高定性定量的 可靠性。 1 1 5 4 毛细管电泳中样品的在线富集【1 1 】 由于毛细管进样体积小以及在柱检测光程短，极大地限制了毛细管电泳检测 灵敏度的提高。为了提高毛细管电泳的检测灵敏度，多种样品富集的方法得以发 展。 一、等速电泳 等速电泳( i s o t a c h o p h o r e s i s ，i t p ) 又称“移动边界”电泳技术，是基于离子 淌度差异的一种电泳富集模式。样品注入到前导( 即较高电泳迁移速率) 和尾随 ( 较低电泳迁移速率) 电解质之间，施加高压后，随着样品中各组分的分离，每 个样品组分区带的电场在发生变化。电泳迁移速率大的离子，电导较大，区带的 电场较小，其迁移速率就会逐渐降低。到平衡时，样品各组分的电泳迁移速率均 与前导电解质的相同，建立一种稳态迁移模式。i t p 对痕量样品起到浓缩的作用， 而对样品中的基体成分则起稀释作用。此外，i t p 的负载量比毛细管区带电泳 ( c z e ) 高得多，进样量可达“l 级。i t p 的应用范围包括荷电小分子和蛋白质等 生物大分子，这种方法非常适用于生物样品等复杂样品基质的体系，如血样、尿 样以及环境样品等。 由于i t p 是一种富集技术，其分离效果并不理想，因此常与c z e 配合使用。 7 中山大学硕士学位论文氨基酸对映体的毛细管i u 泳i u 化学分离检测 二、色谱富集 固相萃取富集( s p e ) 是c e 分离中常用的一种离线样品前处理方法。这种方 法是将大量的稀浓度样品负载到固定相中，然后用小体积的洗脱液将样品洗脱下 来，起到富集的效果。这种富集方法的缺点在于操作时间过长、自动化程度低。 另一种痕量样品富集进样方法是l c c z e 在线耦合。在毛细管的前端约1 2 m m 长度填充或涂渍、键合l c 的固定相，当样品溶液徐徐加到毛细管中时，样品 吸附在填充材料中。进样后用另一种溶剂将样品洗脱至分离毛细管中，然后按 c z e 模式分离。经过预浓缩后，检测灵敏度可以提高1 2 个数量级。 三、样品堆积 样品堆积富集效应是基于因电场强度不同所引起的分析物电泳速度的骤变 而实现的。样品堆积是将样品溶解于低导溶液中，并使样品溶液在高导背景溶液 中运行。当低导和高导溶液同时存在于毛细管中并施以电压时，则低导区的电场 较高导区的强，样品离子在低导区的迁移速度比在高导区快。当样品离子穿越低 导区域和背景缓冲溶液的边界时，样品离子的迁移速度骤降从而导致了样品区带 长度的缩短，样品的浓度相应地提高，从而达到了富集的目的。用水配制样品， 由压力进样，也可在电泳初期产生聚焦现象，但聚焦时问很短，检测灵敏度的提 高有限。增强电场聚焦是利用压力法先进一段水区带，然后用电迁移法进样。纯 水区带的电导趋于零，在电动进样期间承受所有的电场，而管内其他部位电场趋 于零。在这种情况下，不产生电渗，仅有一种符号的离子可迁入管中并迅速穿过 水区带，浓集于它的前沿。研究表明，水区带最好不要长于2m l n ，电迁移进样 时间控制在1m i n 以内，本法可提高灵敏度1 0 0 1 0 0 0 倍而不损失分离效率。 1 2 毛细管电泳的检测技术 在毛细管电泳中，极细的毛细管电泳内径给样品分离带来了很高的效能，但 同时也给极微量的样品组分的检测带来了困难，对检测技术提出了较高的要求。 如何增加检测器的灵敏度，同时又不造成样品区带的明显展宽，一直是c e 技术 发展中的一个重要问题。迄今为止，已有多种检测技术与c e 联用，在不同的实 8 中山大学硕士学位论文氨基陵对映体的毛细管【乜泳1 也化学分离检测 际应用领域中发挥着作用。 现已有的检测方法主要有紫外检测、激光诱导荧光检测、化学发光检测、质 谱检测、电化学检测、拉曼光谱检测、折射指数法和放射性同位素检测等多种检 测方法，其中紫外检测器、激光诱导荧光检测器、质谱检测器和电导检测器已经 商品化。 1 2 1 紫外吸收检测( u t r a - v i o l e t a b s o r p t i o nd e t e c t i o n u v ) 紫外检测器是毛细管电泳最早选用的检测器，也是应用最广泛的检测器。它 操作方便，灵敏度适中，毛细管石英柱有良好的紫外透过性，容易实现柱上检测。 但其最大的缺点是检测光程短而难以进一步提高检测灵敏度。对其较有特色的改 进是z 型池结构【1 2 , 1 3 1 、多次反射检测池【1 4 】、矩形毛细管检测池【1 5 , 1 6 】、球泡检测 池i l7 j 等，都能提高检测光程和灵敏度，但都存在制作困难，损失分离度和分离 效率等缺点。也有采用平面积分检测池【18 1 ，这种设计可使检测的光路增加到1 c m ，还有用光散射二极管( l e d s ) 作光源，其线性范围和信噪比均优于汞灯。 1 2 2 激光诱导荧光检测( l a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n ，l i f ) l i f 是在普通荧光检测器的基础上发展起来的，其灵敏度可达1 0 。1 2 1 0 。1 6 m o l ，l ，是目前毛细管电泳中最灵敏的一种检测方法。对某些荧光效率较高的物 质，可以达到单分子水平。l i f 中最重要的组成部分是激光器，因为激光器的激 发波长与所分析组分的吸收波长必须相适合，而且激光器的功率直接影响到检测 器的灵敏度。目前，l i f 常用的激光器有：h e c d 激光器、旬离子激光器、鼬离 子激光器、h e n e 激光器等。h e c d 激光器有较好的荧光试剂与之匹配，但其寿 命比较短。a r 离子激光器比较稳定，目前应用比较广泛。大多数氨基酸的分析都 是经萘二醛( n d a ) 衍生以后用a r 离子在4 5 7a m 波长下激发出荧光的。 近年来，半导体激光技术得到很大发展，它最大的特点是使用寿命长。 m e l a n s o n 和l u c k 1 9 垃用了寿命长达5 0 0 0 0h 的半导体激光，其寿命比氩和氦镉激 光要高出1 0 倍，而且价格相对较低。低波长半导体激光器的不断出现，使其目前 9 中山大学硕士学位论文氨基酸对映体的毛细管电泳【乜化学分离检测 在4 0 0n m 以上波长已经可以基本代替普通激光器。它具有的体积小、成本低、寿 命长、稳定可靠和易于推广的特点，使d l i f 可以在显著降低成本的情况下广泛 用于氨基酸、肽、蛋白质、d n a ：分析及测序、药物及体内微量成分、以及一些 特殊物质的分析检测f 2 0 】。 1 2 3 质谱检测器( m a s ss p e c t r o m e t r i cd e t e c t i o n m s d ) 1 9 8 7 年，o l i v a r e s l 2 1 1 等首次报道了毛细管电泳与质谱的联用技术，由于 c e m s 在一次分析中可同时得到样品迁移时间、分子量和碎片特征等大量的信 息，该项技术迅速获得认可和欢迎，在过去十几年间得到了很大的发展，并已经 商业化。目前，c e m s 技术中最关键的是接口问题。常用的离子化方法有电喷 雾、离子喷雾、基质辅助激光解析离子化、等离子体解吸离子化技术等。作为常 规方法c e m s 尚存在一些不足之处，如灵敏度较低，不如l c m s ：m s 对缓冲 溶液选择的限制较多等。与c e 联用的m s 通常是四级杆质谱仪、飞行时间质谱、 离子阱质谱等。c e m s 由于所需样品少，分离效率高，特别适用于复杂生物样 品的分离鉴定，在肽链测序及蛋白质结构、分子量测定、单细胞分析等方面均有 卓越的表现。m m o i n i 等用自行设计的无鞘流c e e s l m s 分离非衍生化氨基酸 对映体，检出限达1 0 。1 8m o l l 2 2 1 。 1 2 4 化学发光检测( c h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o n ) 化学发光检测瞄】是一种高灵敏度检测器，由于化学发光检测不需要光源， 检测器的光路设计非常简单，而且不存在背景噪音对检测灵敏度的干扰。毛细管 电泳化学发光检测的发光试剂有：过氧化草酸盐、鲁米诺和萤火虫荧光素酶等。 由于受到光化学反应较少的局限，与其他光学检测相比，化学发光检测在c e 中 应用得相对较少，主要用于生化分析、d n a 和r n a 检测、肽检测、活性细胞色 素检测等。电致化学发光也己成功地用作c e 的检测【2 4 】 1 2 5 电化学检测( e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o n e c d ) 1 0 中山大学硕十学位论文氨基陵x t 映体的毛细管i b 泳一电化学分离检测 与光学检测相比，电化学检测以其质量检出限低、线性范围宽、选择性好、 设备简单、价格低廉而得到广泛的使用。电化学检测主要有三种方法：电位检测、 电导检测和安培检测，其中毛细管电泳安培法和电导法应用最广，尤其是安培检 测，可以使用极细内径的毛细管也不会造成灵敏度降低，而且进样量极小，适合 进行单细胞和活体分析。此外电化学检测都采用电极作为传感器，直接将溶液中 待测组分的化学信号转变为电信号，符合仪器微型化和集成化毛细管电泳j 占片的 要求，因此作为微型全分析系统的集成化检测，电化学检测极具潜力【2 5 , 2 6 】。 1 2 5 1 安培检测( a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n ) 安培检测是基于具有电化学活性的物质在恒电位电极上发生氧化还原反应 从而产生响应电流信号而进行检测的一种方法【2 7 1 ，是c e - e c d 中应用最多的一 种检测方式。w a l l i n g f o r d 2 8 】等在1 9 8 7 年首次将安培检测应用于c e 中，由于其 具有灵敏度高、选择性好、响应速度快等特点，十多年来得到了很大的发展。 当被分离的电化学物质流经电极表面时，由于溶液与电极间的电势差，电活 性物质将被还原或氧化，在溶液和电极间形成符合法拉第定律的电流，电流经放 大检测，记录其随时间的变化即可得电泳图谱。 由于毛细管电泳高压回路中的电流远大于检测信号的电流，c e 安培检测所 面临的一个主要问题是如何克服高压回路中的电流对检测的影响。为了解决这个 问题，文献报道了多种处理技术，例如采用多孔玻璃、石墨、醋酸纤维和n i f i o n 等导电性连接管，以离柱的方式检测或采用微盘电极直接与小内径毛细管的出口 对接，以柱端方式进行检测。 1 2 511 离柱安培检测( o i f - c o l u m na m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n ) w a l l i n g f o r d 等1 2 8 】首次提出了离柱安培检测的方式，他们将分离毛细管截断， 再在截痕处耦合一段不允许样品离子通过的导电多孔玻璃管作为接头将分离毛 细管与检测毛细管连接，多孔玻璃管接地与高压电源端形成一高压回路，从而使 c e 分离电压和电流与c e 检测系统相隔离，减小对c e 检测信号的干扰。为了克 服多孔玻璃管机械强度差、易碎的缺点，多孔石墨管【2 9 】、n a t i o n 管 3 0 , 3 1 】和钯管吲 等多种不同导电材料的套管式接口用于离柱安培检测。 山大学硕士学位论文氨基酸对映体的毛细管电泳电化学分离检测 接口是离柱安培检测方式的关键，上述套管式接口以n i f i o n 管耦合为最好， 但其制作均较复杂，均需在毛细管管壁上产生裂痕，不易将分离毛细管和检测毛 细管对齐，因而易引入附加体积，造成谱峰展宽。为了进一步提高柱效，c h e n 【3 3 】 等设