（有机化学专业论文）一种方便、有效地合成αα二卤甲基膦酸酯的方法.pdf

摘要 一种方便、有效地合成0 【，0 c 一二卤甲基膦酸酯 的方法 有机化学专业硕士研究生吴狄 指导教师官智教授 摘要 a 位功能化磷酸酯在生物学、药理学和有机化学等领域中受到极大的关注。特别是小卤代 磷酸酯是一类非常吸引人的有机磷酸化合物，它作为有机合成试剂具有广泛地应用价值。它 可以通过w i t t i g h o m e r 反应的对称和不对称合成q 位卤代的烯烃与炔烃。并且，由于a 单卤 代和双卤代磷酸酯与天然磷酸酯结构和电荷的相似性，它们经常被设计成天然磷酸酯模拟物 用作酶的抑制剂和代谢物探针。已有很多方法通过亲电和亲核的卤化试剂来合成洳单卤代和 a ，q 双卤代磷酸酯，而本文主要介绍一种先进行亲核卤代，再进行亲电卤代在磷酸酯n 位分别 引入两个卤原子的方法，还讲述了以n f l u o r o b e n z e n e s u l f o n i m i d e ( n f s i ) 作为路易斯酸催化 a z a 4 + 2 】反应。具体内容包括以下三个方面： 1 我们发展了一种通用的、清晰的方法合成q 二氟苄基磷酸酯。这种方法包括两步卤 化过程，且产率不错。第一步，用d a s t 试剂对洳羟基磷酸酯进行亲核氟化反应。第二步， 用n f s i 对洳氟代磷酸酯进行亲电的氟化反应。这种实验方法与之前报道的相比，优势在于避 免了合成不稳定的中间体洳羰基磷酸酯，且每一步的产率都非常不错。a , a - 二氟苄基磷酸酯还 可作为潜在的p t p s 的抑制剂应用在生物领域。 2 我们发展了一种有效的，实用的方法合成。小氯氟磷酸酯。这种方法包括两步卤化过 程，其中起始原料为a 羟基磷酸酯。第一步，用p p h 3 和c c h 对小羟基磷酸酯进行亲核氯化反 应。第二步，用n f s i 对q 氯代磷酸酯进行亲电的氟化反应。c t ，c t 氯氟磷酸酯不仅可作为潜在 的p t p s 的抑制剂，而且还可以通过亲核取代来合成各类含有洳氟代磷酸酯基的化合物。 3 我们成功开发了一种在室温条件下，以n f s i 作为催化剂催化环己烯酮、不同取代基 的苯甲醛和苯胺发生三组分“一锅煮”反应，得到i s o q u i n u c l i d i n e s 。此反应用环境友好的、可直 接购买的试剂n f s i 作为催化剂来代替金属和复杂方法合成的化合物。该方法优点是反应条件 温和、操作简便、产率和立体选择性高。除此之外，该方法也进一步拓展n f 亲电氟化在有 西南大学硕十学位论文 机化学领域中的应用。 关键词：亲核氟化亲核氯化亲电氟化n f s ia z a 4 + 2 】反应 a b s t r a c t af a c i l ea n de f f i c i e n ts y n t h e s i so fd i e t h y l 仅，a - d i h a l o g e n o m e t h a n e p h o s p h o n a t e s m a j o r ：o r g a n i cc h e m i s t r yp o s t g r a d u a t e ：d iw u s u p e r v i s o r ：p r o f z h ig u a n a b s t r a c t a f u n c t i o n a l i z e dp h o s p h o n a t e sh a v ea t t r a c t e dc o n s i d e r a b l ea t t e n t i o ni nt h ef i e l do fb i o l o g y , p h a r m a c o l o g ya n do r g a n i cc h e m i s t r y i np a r t i c u l a r , a h a l o g e n a t e dp h o s p h o n a t e s ，w h i c ha r ew i d e l y u t i l i z e da ss y n t h e t i cr e a g e n t sa n de s p e c i a l l ya sg o o dp r e c u r s o r sf o rt h es y n t h e s i so fs y m m e t r i c a lo r u n s y m m e t r i c a l 仅- h a l o g e n o a l k e n e sa n da l k y n e si nm i l dc o n d i t i o n sb yt h ew i t t i g h o m e rr e a c t i o n ，a r e f a s c i n a t i n go r g a n o p h o s p h o r u sc o m p o u n d s m o r e o v e r t h eg t m o n o h a l o g e n a t e da n da ，a - d i h a l o g e n a t e d p h o s p h o n a t e sa l eo f t e nd e s i g n e d a sp h o s p h a t em i m i c st ob eu s e d 舔e n z y m ei n h i b i t o r sa n d m e t a b o l i t ep r o b e sd u et ot h e i rs t r u c t u r a la n de l e c t r o n i cs i m i l a r i t i e st ot h ep a r e n tp h o s p h a t eg r o u p s a n u m b e ro fm e t h o d sf o rt h ei n t r o d u c t i o no fah a l o g e na n dt w os a m eh a l o g e n sa tt h ea - c h 2p o s i t i o no f p h o s p h o n a t e sb yt h en u c l e o p h i l i ca n de l e c t r o p h i l i ch a l o g e n a t i o n sh a v eb e e nr e p o r t e d i nt h i st h e s i s ， w eh a v ed e m o n s t r a t e dt h a ta v a r i e t y o f a ，a - d i f l u o r o b e n z y l p h o s p h o n a t e s a n d 0 【，a - c h l o r o f l u o r o a l k a n e p h o s p h o n a t e sc a nb er e a d i l yp r e p a r e dv aat w o - s t e ph a l o g e n a t i o np r o c e d u r e ， a n dt h es y n t h e s i so fi s o q u i n u c l i d i n eb yt h eo n e - p o t ，t h r e e - c o m p o n e n ta z a 4 + 2 】r e a c t i o nc a nb e c a t a l y z e db yn f s i 1 w eh a v ed e v e l o p e dag e n e r a l ，v e r s a t i l ea n du n a m b i g u o u sa p p r o a c hf o rt h ep r e p a r a t i o no f a ，a - d i f l u o r o b e n z y l p h o s p h o n a t e si n9 0 0 dy i e l d sv i aat w o s t e ph a l o g e n a t i o np r o c e d u r e f i r s ts t e pw a s n u c l e o p h i l i cf l u o r i n a t i o no fa - h y d r o x y p h o s p h o n a t e sw i t hd a s t , s e c o n ds t e pw a se l e c t r o p h i l i c f l u o r i n a t i o nw i t hn f l u o r o b e n z e n e s u l f o n i m i d e ( n f s i ) t h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n so f f e ram o r e e f f i c i e n ta n dc o n v e n i e n tp r e p a r a t i o nt h a nt h o s ee a r l yr e p o r t e d ，e a c hs t e po ft h i sr e a c t i o ns e q u e n c e b e i n ge x e c u t e di ng o o dy i e l d s t h e s ec o m p o u n d sc o u l db ea sp o t e n t i a li n h i b i t o ro f p t p s 2 w eh a v e d e v e l o p e d a ne f f i c i e n ta n d p r a c t i c a la p p r o a c h f o rt h e p r e p a r a t i o n o f ，a - c h l o r o f l u o r o a l k a n e p h o s p h o n a t e sf r o ma - h y d r o x y p h o s p h o n a t e sb yat w o - s t e pp r o c e d u r e f i r s t s t e pw a sn u c l e o p h i l i ec h l o r i n a t i o no f 位- h y d r o x y p h o s p h o n a t e sw i t hp p h 3a n dc c h 。s e c o n ds t e pw a s e l e c t r o p h i l i cf l u o r i n a t i o n w i t hn f s i t h e s ec o m p o u n d s c o u l db ea sp o t e n t i a li n h i b i t o ro fp t p sa n d c o u l db ec o n v e r t e di n t ov a r i o u su s e f u lq u a t e r n a r yc a r b o n - c o n t a i n i n ga - f l u o r o p h o s p h o n a t e sb yu s i n g n u c l e o p h i l i es u b s t i t u t i o n 两南大学硕十学位论文 3 w eh a v es u c c e s s f u l l yd e v e l o p e dac o n v e n i e n t e f f e c t i v ea n dm i l ds t r a t e g yf o rt h es y n t h e s i s o fi s o q u i n u c l i d i n ed e r i v a t i v e sb yt h eo n e - p o t ，t h r e e c o m p o n e n ta z a 4 + 2 】r e a c t i o no fc y c l o h e x e n o n e w i t han u m b e ro fa r o m a t i ca l d e h y d e sa n da m i n ec a t a l y z e db yn f s i t h er e a c t i o n sg e n e r a t e dt h e d e s i r e dp r o d u c t si n9 0 0 dy i e l d sa tr o o mt e m p e r a t u r ew i t ha c c e p t a b l es t e r e o s e l e c t i v i t yi na i r t h e p r e s e n tm e t h o da v o i d su s i n gm e t a l sa n dc o m p l e xm o l e c u l e so b t a i n e db ym u l t i s t e ps y n t h e s i s ，a n d i n s t e a di te m p l o y su s e r - f r i e n d l ya n dc o m m e r c i a l l ya v a i l a b l ec a t a l y s tn f s i i na d d i t i o n ，t h er e a c t i o n m a ye x p a n dt h es c o p eo f n - fe l e c t r o p h i l i cf l u o r i n a t i n ga g e n t s 硝v e r s a t i l et o o li no r g a n i cs y n t h e s i s k e y w o r d s ：n u c l e o p h i l i cf l u o r i n a t i o n ；n u c l e o p h i l i cc h l o r i n a t i o n ；e l e c t r o p h i l i cf l u o r i n a t i o n ；n f s i ； a z a 4 + 2 】r e a c t i o n i v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。不存在抄袭、伪造等学术不良行为所获的相关内容。对本 研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确 说明并表示衷心感谢。对本文所呈内容由本人负全部学术责任。 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文： 口保密期限至年月止) 。 工作单位： 通讯地址： 臼象磊密， 蹴：麒堋圆日 导师签名： 1 舣7 狰n 签字日期：y 训痒o6 月趔日 邮编： 第l 章绪论 第1 章绪论 蛋白酪氨酸磷酸化是细胞用来调控信号传导的个最主要的手段。在细胞内， 酪氨酸磷酸化是同一个动力学可逆的过程，并且该磷酸化过程可以抑制蛋白酪氨 酸檄酶( p t k s ) 的活性( 图l1 ) 。p t k s 是用来催化酪氨酸磷酸化，而p t p s 控制 着去磷酸化过程。因此，p t k s 、p t p s 及它们相应的底物都属于可调节信号传导网 的一类化合物这种信号转导网对调节细胞生长、繁殖、新陈代谢、细胞循环、 细胞与细胞间的交流、细胞迁移、基因复制、离子通道的活性和免疫反应等起着 非常重要的作用。这一信号转导网的缺陷和不适当则会导致醅氨酸磷酸化的异常 进而引发许多人类疾病如癌症和糖尿病等”i 。 墨1l p t k s 、p i p s 共同催化蛋白酪氪酸磷酸化 s c h e m el1p r o t e i np h o s p h o r y l a t l o ns t a t e i sr c g u i s t c db y t h er e l a t i v ea c t i v i l y o f p r o t e i nk i n a s e s a n d p h o s p h a t a s c s 虽然p t p s 是构成信号传导通路中很重要的部分，但是它们在人类健康和疾病 中的重要性直到近二十年来才受到足够的重视。生物化学和基因的研究表明p t p s 有正的和负的信号调控作用在各种各种的哺乳动物组织和细胞的生理学中扮演 着非常重要的角色9 1 。更重要的是基于对p t k s 的观察，盯p 活性的失调是许多 人类疾病的致病机理i ”。因此，p t p s 在发展临床试剂中代表着一类新的分子目标 物，下面我们首先介绍下p t p s 结构和机理特性，之后我们将综述下p t p s 在信号 传导和人类疾病中的重要作用，举例说明特异性的p t p 抑制剂的临床意义。最后 我们将重点介绍近年来小分子p t p 抑制剂方面的发展进程，讨论基于有选择性的 西南大学硕士学位论文 p t p 抑制剂临床疗效技术的发展。 1 1p t p 家族化合物 最初的人类基因序列分析揭示了1 1 2 种p t p s 化台物。与蛋白激酶不同，p t p s 的氨基酸序列和丝氢酸苏氨酸磷酸酶是不相关的。决定p t p 家族化舍物特点的地 方在于活性位点的序列( h ，v ) c ( x ) r ( s 厂r ) ，即使用单个字母编码氨基酸，x 代表残 基i i 。 p t p s 也可以被划分为三丈类，即特异性酪氨酸p t p s ( t y r o ，s i n e s p e c i f i c ) 、双重 特异性p t p s ( d u a l s p e c i f i c ) 和低分子量的p t p s ( 图i2 ) 。特异性酪氨酸p t p s 和低 分子量的p t p s 目标物必须是含有酪氨酸的蛋白，而双重特异性的p t p s 目标物既 可以是台有酪氨酸的蛋白也可以是含有丝氨酸和苏氮酸的蛋白。一些双重特异 性的p t p s 也可以水解底物而不是水解磷酸蛋白i 。特异性的酪氨酸p t p s 还可以 被分为两类，即受体类似物p t p s 和细胞内p t p s 。受体类似物p t p s 如c d 4 5a n d p t p a ，通常有一个细胞外配体亲和的部位，一个膜穿透部位。细胞内p t p s 如p t p i b 和s h p 一2 ，有一个催化部位和各类不同的氨基酸和羧基术端延伸部位，它可能具有 识别目标物和调控的功能。取重特异性的p t p s 包括m a p 磷酸酶激酶( m k p s ) ， 细胞循环调节器c d c 2 5 磷酸酶和肿瘤干扰抑制器p t e n 。 t h ep r o t e i n t y r o s i a e p h a s p h a t a s e s u p e r f a m l l 3 t a s s h a l ：p l r ”c n hb l l p m p b p d c d e 2 5 - - m w p i _ l r _ d j u l - r r 。，f p z m f 蛐“ 2 i 气= i 霎 “= = = = 然4 ：灿蚍h ；曼一 一 = u - l 。i i = 。= 口= o 。：2 1 兰! ! 三：! ! ! 兰：竺! ! 竺 囝i2f t p s 奇g 分类 s c h e m e l2 c l a s s i f i c a t i o n 扑dg e n e r a ls t r u c t u r a l f e a t u r e s o f t h ep t ps u p e r f a m i l y 12p t p 结构和催化机理 几十种p t p s 的晶体结构已经被确认。虽然氢基酸序列具有多样性和底物具有 特异性，双重特异性的p t p s 和低分子量的p t p s 的晶体仍显示出与特异性酪氨酸 p t p s 的结构相似性。并且，对催化器重要作用的核心晶体结构部分如p t p 活性位 点的环状部位，h v ) c ( x ) r ( s f f 的序列模式在三类p t p s 化合物中均得到了保留q 】。 对y e r s i n i a p t p , p t p i b ，v h r 和小分子盯p s 的机理研究表明所有的p i p s 都有类似 的催化机理，利用活性位点部位的半胱氨酸作为亲核试剂形成一个具有硫代磷酰 共价结构的酶中间体( 图13 ) ，保持不变的精氮酸残基则起着稳定调控状态和保 持底物配位亲和功能的作用。天冬氨酸参与了磷酸酶的形成过程，它还促使离去 基团质子化，同时保留了酸的催化能力。磷酸酶中间体第二步则是水解过程，它 可以催化天冬氨酸残基。 鲴13p t p 结构和催化机理 s c h e m e l 3p t p m d u ma n dc a t a l y t i c m e c h a n i s m 13p t p s 和人类疾病 许多疾病都与信号传导有障碍有关，其特征就是酪氨酸磷酸化过度或者不能 正常实现磷酸化( 表1i ) 。例如，s h p i 的突变可以引发人类免疫系统紊乱，导致 老鼠中m o t h e a t e n 显性因子增多“。s h p 1 是一种重要的细胞因子信号传导的负调 控因子，失去s h p l 将会导致酪氨酸不断地磷酸化，继而导致细胞繁殖增生不断增 强。这种调控模式增加了有丝分裂，导致了细胞转化。一个较好的例子是s h p 一2 它是细胞生长因子信号的正调控因子”。因此，根据诱发疾病的p t p 调控作用是 西南大学硕十学位论文 正的还是负的，p t p s 抑制剂能阻碍或者促进信号传导过程。 一些p t p s 已经与人类疾病联系在一起。例如：p t e n 肿瘤抑制基因突变能够 导致很多关键部位的癌症，如脑癌、胸癌和前列腺癌等f l i j 。在基因e p m 2 a 处的突 变则与双重特异性的p t p s 有关，导致了不断地肌阵挛癫痫症，特征就是神经上的 不断退化 1 2 , 1 3 l 。 遗传学和生化研究表明一些p t p s 可以发展为有效的靶向药物，如p t p l b 、l a r 和p t p a 等f “l 毛。p t p 活性的的增加或许是造成i i 型糖尿病的一个因素，i i 型糖 尿病的典型特征就是胰岛素信号受阻或削弱胰岛素受体的信号传导。p t p l b 在胰 岛素信号中的负调控作用已被老鼠实验研究证实，即老鼠缺乏p t p l b 则会对胰岛 素更加敏感，同时身体逐渐变瘦 1 7 , 1 8 l 。因此，可以推测，特异性的p t p l b 抑制剂 或许能够增加胰岛素的灵敏性，发展成为一种治疗i i 型糖尿病、胰岛素受阻和肥 胖症的有效方法。 p t p c t 可以通过脱去羧基端酪氨酸残基的磷酸，激活激酶，促进转化 1 9 , 2 0 1 。p t p a 抑制剂能够有效抑制肿瘤激酶的活性。c d c 2 5 磷酸酶可以从控制细胞循环的激酶中 的酪氨酸和苏氨酸残基上脱去磷酸化，因此在调控细胞循环中起着很重的作用， 有证据表明c d c 2 5 a 和c d e 2 5 b 可能都是致癌基因 2 1 , 2 2 】。抗癌药物就是针对抑制 c d c 2 5 磷酸酶的活性发展的。 4 表1 1p t p $ 和人类疾病 t a b l e1 1p t p sa n dh u m a nd i s e a s e s 人类疾病对应的p t p s 人类疾病 糖尿病 肥胖症 癌症 免疫疾病 骨髓增生异常综合征和白血病 骨质疏松症 中枢神经细胞损伤 瘟疫 食物中毒 p t p s p t p l b ，p t p c t ，l a r p t p l b ，s h p 2 c d c 2 5 aa n db ，f a p - 1 ，p t p a ， c d 4 5 h e p t p p t p e p t p s l s t e p ，m k p 3 ，l a r y e r s i n i ap t p s a l m o n e l l ap t p 第1 章绪论 综上所述，一些人类疾病的致病机理可归因于p t p 活性紊乱，其中包括癌症、 糖尿病和免疫紊乱等疾病。p t p s 在不同的病理生理学上的重要性已经使它们成为 研究药物靶点的焦点。因此，p t p s 抑制剂也被预测有很好的治疗研究价值。 1 4p t p 抑制剂发展 酪氨酸磷酸酯( pt y r ) 模拟化合物的设计是发现p t p s 抑制剂的一条最主要的 途径。在早期，pt y r 模拟化合物的设计主要是针对p t p s 的催化活性区域，通常 用磷酸、乙酸、丙二酸、磺酸和草酸等来取代磷酸酯基【2 ”，因为所有的p t p s 都拥 有相同的磷酸化的酪氨酸活性位点，所以设计单一的，选择性的p t p s 的抑制剂存 在着不小的挑战。幸运的是，p t p s 的特异性研究表明，单独的酪氨酸磷酸酯( pt y r ) 对没有足够的亲和力，与pt y r 相连接的残基对p t p s 的识别作用很重要。经证明， 靠近p t p s 活性位点的残基最有可能发展为抑制剂的靶点。这些研究对控制p t p 抑制剂的能力和特异性提供了分子基础，也暗示了一种发展有效的特异性强的p t p 抑制剂的范例，即发展能同时与活性位点和相邻近的外部位点( 有强亲和力的二 齿配体) ，因此独特的与p t p 活性位点相临近的部位能够作为靶点增强抑制剂的亲 和力和选择性。在一种p t p 中，抑制剂与两个相互独立的位点的相互作用可以提 供非常好的选择性因为其他种类的p t p s 可能根本不能提供这种特异性的二位相互 作用。基于此原理人们已经发展了几种有效的选择性好的p t p s 抑制剂，在下文中 我们将做讨论。 1 4 1 无机化合物抑制剂【2 4 1 研究发现，z n 2 + 、n i 2 + 和钒酸盐具有抑制p t p s 的活性作用，其中钒酸盐的抑 制效果最显著，钒酸根在结构上类似于酶的天然底物的磷酸根。最早发现的一类可 逆的非特异性p t p s 抑制剂是钒酸盐和过氧钒酸盐。其中钒酸盐能竞争性抑制活性 位点中的半胧氨酸残基，其亲和性为微摩尔数量级。在矾酸盐与p t p l b 复合物的 晶体结构中，矾原子与活性位点中的硫醇非常靠近，并与酶形成三角双锥形的过 渡态结构，类似于磷酞基转移过程中形成的硫代磷酸盐过渡态。尽管矾酸盐是非 特异性的p t p s 抑制剂，却能以很小的剂量调节i i 型糖尿病模型动物的血糖，且毒 副作用低，临床试验表明它能提高i i 型糖尿病患者胰岛素的敏感性。p t p s 包含一 个具有催化功能的半胱氨酸残基，因此一些碱性试剂和氧化试剂可能成为潜在的 p t p s 抑制剂。过氧矾酸盐则为一种强氧化试剂，它使活性位点中的半胱氨酸残基 氧化成为磺酸，因此它对p t p s 的选择性要强于矾酸盐；其它的无机类p t p 抑制剂 还有一氧化氮和苯胂化氧；这些无机化合物除了可以抑制p t p s 外，还有其它的酶 抑制活性，正是这种非专一性限制了其作为药物的可能性。 1 4 2 肽类抑制剂【2 5 】 两南大学硕十学位论文 含有磷酸化酪氨酸残基( p t y ) r 的肽类底物与p t p s 有较高的亲和性，保留pt y r 而得到的肽类似物与酶有较高的亲和性，但事实上没有取得预期的结果。因为肽 类化合物容易受到体内蛋白酶的降解作用，并且不易通过生物膜，故而肽类化合物 一般不是优良的药物先导。正是由于肽类抑制剂代谢快，化学稳定性和生物稳定 性差，使得人们寻找一些小分子。 1 4 3 醌类抑制剂【2 6 j swh a m 等发现许多p t p s 抑制剂具有醌的结构，猜测其机理可能是醌类化合 物具有氧化性，可以氧化p t p s 活性位点中的半胱氨酸。从而形成了共价结合物， 达到抑制酶活性的作用。 1 4 4 噻二唑烷酮类抑制剂2 7 1 噻二唑烷酮类是一类直接针对胰岛素抵抗的新药，该类药物通过增加靶器官 内的胰岛素敏感性来改善血糖控制。该类化合物是酪氨酸磷酸酯的生物电子等排 体。磷酸酯中的两个氧原子与砜基上的氧配适，而磷酸酯中的第3 个氧原子与2 位 氮原子重叠。由于1 位砜基和3 位羰基均为吸电子基团，2 位氮上的质子具有弱 酸性，可以模拟磷酸酯与催化活性区的碱性氨基酸形成静电作用，增加与酶的亲 和力。第一个上市的噻二唑烷酮类为c i g l i t a z n o e ，由于其明显的严重肝脏毒性，已 从市场上被撤出，而由s m i t h k l i n eb e e e h a m e s 公司研发在1 9 9 9 年上市的 r o s i g l i a t z o n e ，左为一个胰岛素增敏剂，临床疗效较好。噻二唑烷酮类抑制剂的开 发为pt y r 模拟物设计提供了一条新思路，有望成为高活性、高选择性、药学性质 适合的新药物。 1 4 5 磷酸酯类抑制剂【2 8 i 经研究表明磷酸酯类化合物具有较强的抑制活性，一直作为p t p s 抑制剂设计 的重点。在磷酸的a 位引入负电性的卤原子后，降低了磷酸根的p k a 值，增强了 磷酸与p t p s 催化活性区域的静电作用及氢键相互作用。化合物1 中的两个d f m p 结构单元分别与催化活性区及第二结合位点作用，其活性是单d f m p 化合物2 的 4 5 0 倍，并且对p t p l b 有一定的选择性。为了构建分子多样性的化合物库，采用 平行合成技术，以不同的肽模拟物片段连接两个二氟亚甲基磷酸结构单元，筛选 得到的化合物对p t p l b 具有很高的亲和力。而对t 2 细胞蛋白酪氨酸磷酸酶的结 合常数则达到2 6n m o l l ，该酶是p t p 酶家族中与p t p l b 同源性最高的酶，显示 出很好的选择性。 总体来说，目前p t p l b 抑制剂的相关研究还不是很多，抑制剂与酶之间的作 用机制也不是很明确，并且p t p l b 的另一个芳基磷酸盐结合位点的发现也有助于 高专一性、高选择的p t p i b 抑制剂的设计与研究。有关p t p l b 及其抑制剂研究的 不断深入开展，不仅有助于阐明胰岛素的胞内信号传导途径，而且在抗糖尿病新 6 第1 章绪论 药开发中具有重大意义。 从前述蛋白质酪氨酸磷酸酷酶的研究进展可以看出，虽然p t p s 在对许多疾病 的治疗方面有着至关重要的生理作用，但到目前为止，有关这类酶高专一性，高 效的小分子抑制剂的工作并不多见，由此可见寻找低毒高效且新颖结构的小分子 抑制剂，并对其在不同p t p 的选择性作出评估，在药物研究中有重要意义。 为此，我们设计了如图1 4 所示的探针化合物1 ， xo o x = f ，c i b r - i t s o 等 r 1 一午一p n r 2 - h m e fc i ，b r , i ，等 r 2 、， r 1 = l i n k e r + r e p o r t e r l 图1 4 p t p s 探针 我们认为这一类型的探针俘获蛋白磷酸酶的反应机理： r 飞一够唧e 一滞恻m l 2 3 一r ；毫怨娜 酶的酶催化探针1 水解时，与1 形成共价结合的中间产物2 ，2 中的a 碳上的 离去基团x 因为邻基参与效应而离去，经过中间过渡态环氧化合物3 ，最后形成酶 与探针共价稳定结合的化合物4 ，通过r 2 连结的报告基团，很容易达到俘获和鉴 定磷酸蜜白目的。 第2 章一种新型蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂a , c t 二氟甲基膦酸酯的合成 第2 章一种新型蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂0 t ，仅二氟甲基膦酸 酯的合成 第1 节引言 ，蛋白酪氨酸磷酸酶( p t p s ) 可以催化切除蛋白磷酸化的酪氨酸上的磷酸基团。 这类酶在调节细胞内信号传导，细胞生长与分裂等一系列生化过程中都起着至关 重要的作用，并且，最近研究表明p t p s 的过度表达会导致大量疾病例如糖尿病， 癌症等【2 9 ，3 0 1 ，因此人们对发展特效的p t p s 抑制剂有着浓厚的兴趣 3 1 , 3 2 】。发展特效 的p t p s 抑制剂最常见的方法是用不水解的磷酸化酪氨酸合成多肽来抑制p t p s 活 性【3 3 3 4 1 。虽然基于多肽的抑制剂在与p t p s 相互作用中起到了很好的抑制作用，但 是由于这类化合物蛋白酶的水解比较敏感，所以作为探针在细胞内研究是被限制 的，然而在发展可逆的、有机的、非蛋白的p t p s 抑制剂的报道是很少的。最近， b u r k e 等人报道二氟甲基磷酸基( d f m p ) 的萘环衍生物是相对较好但非特异性的 p t p s 抑制剂。我们推断结合二氟甲基磷酸基的苯环衍生物也会有很好的抑制作用， 如改变苯环上所连接的基团也可能有一定的选择性。因此我们将设计合成0 【，a 二氟 甲基膦酸酯2 0 和2 1 ( 图2 1 ) 。 o f 孓占( o e l ) 2 南 ) h 2 n 7 2 1 图2 1 设计合成的抑制剂 第2 节实验部分 青岛海洋化工厂生产的g f 2 5 4 型t l c 和柱层析硅胶；1 0 0 2 0 0 目和2 0 0 3 0 0 目柱层析硅胶；r e 一2 0 0 0 旋转蒸发仪；8 5 - 2 型恒温磁力搅拌器；s h b i v 双a 循环水式多用真空泵id l s b 5 2 0 低温冷却液循环泵；9 8 1 b 型电子调温电热套： 2 x z - 8 c 型旋片式真空泵；k q 3 2 0 0 型超声波清洗器；f a 2 0 0 4 a 电子天平； s f g - 0 2 4 0 0 电热恒温鼓风干燥箱；乙二醇；对甲苯磺酸：四氢铝锂：二碳酸二叔 丁酯；三乙胺；亚磷酸二乙酯：乙醇钠：d a s t 试剂；n f s i ；n a h m d s ；溴化苄 9 西南大学硕士学位论文 第3 节结果与讨论 为了合成目标抑制剂2 1 ，9 是一个重要的中间体。根据文献，合成9 有两种 方法，一是以对氰基苯甲醛为底物经过醛基保护，再进行氰基还原，然后对氨基 保护，最后再脱醛基保护就得到目标化合物9 ；二是在碱性环境下对胺甲基苯甲酸 为底物经过氨基保护，再进行酸化，然后将羧基还原为羟基，最后把羟基氧化为 醛基得到目标产物9 ，显然，在底物价格和产率方面第一种更优于第二种，因此我 们采用第一种方法来合成目标化合物9 ，合成路线如图2 2 所示。 8 t s o h - - - - - - - - - - - - - - a c e t o n e h 2 0 ( o e t ) 2 。鼍竺竺彬 b o c h、h l i a i h 4 t h f ，0 0 c t or t 加 囝 b o c ：h n 9 ( o e t ) 2 ( b o c ) 2 0 e t 3 n - - - - - - 、- - - - - - - _ 1 4 - d i o x a n e r t n a o e uh p ( o ) ( o e t ) 2 c h 2 c 1 2 3 5 9 c 釜扩 ! 罗二了 图2 2 反应路线 s c h e m e2 2r e a c t i o nr o u t eo f13 我们用对氰基苯甲醛5 为底物在对甲苯磺酸作为催化剂用乙二醇对醛基进行 保护，粗产物6 用乙醚，石油醚( 3 ：1 ) 重结晶。然后，将产物6 与四氢铝锂反应， 1 0 几歹7 八y 甲洲 h c舌l 炮| 垦附 ，一 k 一酎竺1 |o 一粤2 一ih 吲l i | r 甲叫 。芦” 。岁巾 时 第2 章一种新型蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂a , a 二氟甲基膦酸酯的合成 i 把氰基还原成胺甲基。在反应过程，滴加四氢铝锂时要缓慢且反应体系要在冰浴 中，否则反应过于剧烈容易发生事故且副反应多。之后，在三乙胺作为碱情况下 用二碳酸二叔丁酯对氨基进行保护，产物8 未经提纯用于下一步反应。在对甲苯 磺酸存在下，缩醛进行水解得到目标产物9 。在低温弓5 0 c 下乙醇钠作为碱，将9 用亚磷酸二乙酯处理得到目标产物1 0 。最先我们以乙醚为溶剂，发现产率一般， 经过条件优化最终选二氯甲烷为溶剂产物产率可达9 0 以上。 根据文献可知，一般合成二氟甲基磷酸酯是先由静羟基磷酸酯氧化成洳羰基 磷酸酯，在用亲核的氟化试剂d a s t 进行氟化。但根据文献用了几种不同的氧化 试剂，如s w e m 氧化，m n 0 2 ，p c c ，p d c ，结果确不令人满意，基本上没有目标 产物1 1 生成。再查阅一些其它文献发现0 【羰基磷酸酯是一个非常不稳定化合物， 在潮湿的空气中就分解成羧酸和磷酸酯。经过多次尝试仍无法解决这一问题，不 得不采取其它合成方案。在查阅文献过程中发现，除了亲核的氟化试剂外还有亲 电的氟化试剂，如n f s i ，s e l e c t f l u o r t m 等，由此我们改变实验方案先将仅一羟基磷 酸酯1 0 用d a s t 进行亲核氟化生成伊氟代磷酸酯1 2 ，然后用强碱n a h m d s 处理， 再用亲电的氟化试n f s i 进行氟化，幸运的是得到了目标产物1 3 ，且产率7 1 。 h b n b r k 2 c o a c h 2 c 1 2 7 8 ct or t o f 、p ( o e t ) 2 l 囟 c o o b n t 7 f l h 2 t p 们 o i i f 、vp ( o e t ) z 6 c o o h 1 9 n a o e t h p ( o ) ( o e t ) 2 c h 2 c 1 2 1 3 5 。c 图2 3 反应路线 s c h e m e2 3r e a c t i o nr o u t eo f 2 0 o f 斗每( o e l ) 2 6 c o o b n o f 孓每( 。e 1 ) z 囟 c o o h 2 0 e n 睚 卧 庐啪=2董=2 = ，咖r甲咖 忙 刚 玉 h 8 ， 西南大学硕士学位论文 有了上面经验，在合成目标抑制剂2 0 时采取同样的策略，先进行亲核的氟化 再进行亲核的氟化( 图2 3 ) 。我们先将底物对羧基苯甲醛1 4 的羧基进行保护，所 用的试剂是碳酸钾和溴化苄。在低温- 3 5 0 c 下乙醇钠作为碱，将1 5 用亚磷酸二乙 酯处理得到目标产物1 6 。先将c t 羟基磷酸酯1 6 用d a s t 进行亲核氟化生成q 氟 代磷酸酯1 7 ，然后用强碱n a h m d s 处理，再用亲电的氟化试n f s i 进行氟化得到 目标产物1 8 。化合物1 7 和1 8 还原经过氢气还原把苄基保护脱掉得到化合物1 9 和 2 0 。 第4 节本章小结 总之，我们发展了一种有效的、方便的合成a ，a 二氟磷酸酯的方法。这种方法 包括两步氟化过程，首先进行亲核氟代反应，然后再进行亲电的氟化反应，为合 成0 【，0 【二氟磷酸酯类化合物奠定了基础，并且，这类化合物可作为潜在的p t p s 的 抑制剂。 第5 节化合物的合成 2 5 1 化合物6 合成： 将对氰基苯甲醛( 1 0g ，7 6 3m m 0 1 ) 溶解在甲苯( 1 5 0m l ) 中，再加入7 _ , - - 醇( 1 7 m l ) 和对甲基苯磺酸( 5 0m g ) ，在烧瓶上一个分水器，升温到1 4 0 。c 反应4 0 小时。 用5 n a h c 0 3 洗涤，分离有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，重结晶。产 率9 0 。 1 hn m r ( 3 0 0m h z ，c d c l 3 ) ：6 = 4 0 3 - 4 1 3 ( m ，4 ，5 8 4 ( s ，1 1 4 ) ，7 5 9 ( d ，j = 8 2 h z ，2 h ) ，7 6 8 ( d ，= 8 2h z ，2 h ) p p m ；cn m r ( 7 5m h z ，c d c i a ) ：6 = 6 5 4 ，1 0 2 3 ， 1 1 2 8 ，1 1 8 5 ，1 2 7 1 ，1 3 2 1 ，1 4 3 0p p m 2 5 2 化合物7 合成： 将化合物6 ( 1 9 ，5 7m m 0 1 ) 溶解在t h f ( 1 0m l ) 中，在冰浴和氮气保护下滴加 l i a i h 4 ( 4 3 3m g ，1 1 4r e t 0 0 1 ) 和t h f ( 1 0m e ) 混合溶液。滴加完毕后，撤除冰浴，在 室温下搅拌1 5 小时，之后在冰浴下滴加a e o e t ( 5m l ) ，再缓慢滴加冰水( 5m l ) 。 过滤，浓缩，柱层析得产物。产率5 1 。 1 hn m r ( 3 0 0m h z ，c d c l 3 ) ：6 = 1 9 4 ( s ，2 h ) ，3 8 4 ( s ，1 n ) ，3 9 8 4 1 3 ( m ，4 h ) ， 5 7 8 ( s ，i n ) ，7 3 1